Abstract
Immunhistokjemi er en mye brukt metode for påvisning av nærvær, plassering og relative overflod av antigener in situ. Det innledende nivå protokollen beskriver reagensene, utstyr og teknikker som kreves for å fullføre immunhistokjemisk farging av gnagerhjernevevet, ved hjelp av markører for mikroglia og neuronal elementer som et eksempel. Nærmere bestemt er dette papiret en trinn-for-trinn-protokoll for fluorescerende visualisering av mikroglia og nevroner via immunhistokjemi for Iba1 og Pan-nevronale, respektivt. Fluorescens dobbeltmerking er spesielt nyttig for lokalisering av flere proteiner i samme prøve, og gir mulighet til nøyaktig å observere interaksjon mellom celletyper, reseptorer, ligander, og / eller den ekstracellulære matriks i forhold til hverandre, så vel som protein ko- lokalisering innenfor en enkelt celle. I motsetning til andre visualiseringsteknikker, kan fluorescens immunhistokjemi fargeintensitet reduksjon iukene til måneder etter flekker, med mindre nødvendige forholdsregler blir tatt. Til tross for denne begrensning, ved mange anvendelser fluorescens dobbel-merking er foretrukket fremfor alternativer som for eksempel 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) eller alkalisk fosfatase (AP), som fluorescens er mer tidseffektiv og sørger for mer nøyaktig å skille mellom to eller flere markører. Diskusjonen omfatter feilsøkingstips og råd for å fremme suksess.
Introduction
Immunhistokjemi er en fremgangsmåte for å detektere antigener (dvs. proteiner) i vevssnitt ved hjelp av primære antistoffer som bindes spesifikt til antigener av interesse. Immunhistokjemi ble utviklet av JR Marrack i 1934 da han bestemt at antistoffer kunne lokalisere antigener med stor spesifisitet 1. Starten i 1942, var noen av de første i vitro-studier med fluorescerende antistoffer til å visualisere immunhistokjemi publisert 2,3, etter som den første in vivo histokjemisk Studien ble publisert fire. I løpet av 1960-tallet, tre tiår etter starten av immunohistokjemiske metoder, enzym-konjugerte antistoffer begynte å bli brukt som sekundære reagenser. Disse metodene ble samtidig og uavhengig utviklet i Frankrike og USA 5,6. I dag, et bredt utvalg av antistoffer gir uendelige muligheter for immunhistokjemi studier 7.
"> Det overordnede målet med denne korrespondansen er å gi en kort innføring i immunhistokjemisk farging, det er ikke ment å være en omfattende og grundig gjennomgang av denne teknikken I metoden skissert, er immunhistokjemiske teknikker for to antigener presentert (markører for mikroglia og. nevroner) for farging av paraformaldehyd perfusert begynner sukrose cryoprotected, cryosectioned rottehjerne. Immunohistokjemisk farging med blokkering ikke-spesifikk antigenbinding å redusere bakgrunnsfarging. Deretter inkubering med primært antistoff gjør det mulig for binding til et spesifikt antigen i vevet. Etter det primære antistoff, et annet antistoff, betegnet sekundært antistoff, anvendes for å koble den primære antistoff til et konjugert signal visualisering 8. Det sekundære antistoffet er rettet mot immunglobulin G (IgG) domene spesifikt for artene i hvilke det primære antistoff ble hevet. Den sekundære antistoff forsterker signalet av det primære antistoff, siden de Fab-regionene i tHan sekundært antistoff binder seg til flere steder på IgG-domenet av det primære antistoff. Enten enzymer eller fluorescerende molekyler konjugert til S C regioner av det sekundære antistoff muliggjøre visualisering. For eksempel, er et kanin anti-Iba1 primært antistoff en kanin-IgG-molekyl som er spesifikt for Iba1. Når esel anti-kanin-IgG er anvendt som et sekundært antistoff, det vil gjenkjenne og binde seg til flere regioner av kanin anti-Iba1 IgG (se figur 1). Den esel antistoffet kan visualiseres ved hjelp av forskjellige metoder. Denne korrespondanse fokuserer på deteksjon av en fluorofor konjugert til det sekundære antistoff, som gjenkjenner det primære antistoff, for visualisering av fluorescerende mikroskopi. I fluorescerende immunhistokjemi, kan en atom flekken som Hoechst eller DAPI brukes til å visualisere alle kjerner.
Figur 1: Schematic representasjon av direkte sammenlignet med antistoff indirekte merkingsteknikker. Antistoffer bindes til antigenet av interesse og kan forsterkes ved sekundære antistoffer dannet mot arter av de primære antistoffer. Denne teknikken kan bli utført ved bruk av avidin-biotin kompleks (ABC) for forsterkning og DAB for visualisering (A), eller et direkte konjugerte fluorescerende sekundært antistoff (B). Alternativt kan primære antistoffer direkte konjugert med mange forskjellige koder, inkludert biotin eller en fluorofor (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En alternativ metode for visualisering av immunhistokjemisk farging benytter 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB, se figurene 1 og 2). Dette skiller seg fra fluorescens ved hjelp av en eller biotinylertpepperrot-peroksidase (HRP) konjugert sekundært antistoff, noe som gir et enzym for å omdanne DAB til et bunnfall som er synlig under lysfelt-mikroskopi. I tilfeller der en enkelt antigen er av interesse eller farging er nødvendig for å bli langvarig, kan DAB være mer hensiktsmessig enn fluorescerende farging. Imidlertid DAB farging er ikke godt egnet for å differensiere mellom flere markører, spesielt hvis to nukleære antigener som er av interesse. For informasjon om DAB materialer og protokoll modifikasjoner, se i tabell 1. Alternativt kan nitro blå tetrazoliumklorid / 5-Bromo-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) brukes til å visualisere en alkalisk fosfatase (AP) konjugert sekundært antistoff.
Figur 2:. Representative bilder av nikkel-forsterket DAB enkeltmerkede rottehjerne vevssnitt Rat hjernen SEctions som er merket med nikkel-forbedret DAB for Iba1 (A) og Pan-nevronale (B) gir mulighet for langvarig analyse av mikroglia eller nevroner alene. Scale bar 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Man må ta hensyn til den beregnede mengde av antigenet av interesse i vevet som analyseres. Indirekte metoder (som beskrevet ovenfor) er nyttige for mål med lav overflod. Når antigen av interesse er i høy overflod, kan direkte metoder brukes. Direkte metoder involverer et primært antistoff som er direkte konjugert til en visualisering signal, og dermed ingen sekundære antistoff er nødvendig. Denne fremgangsmåten forenkler fargeprosessen, men eliminerer forsterkning oppnås ved indirekte metoder. Ved hjelp av en direkte konjugert primær antistoff eliminerer også kryssreaktivitet av sekundære antistoffernår dobbel-merking.
Denne kommunikasjonen detaljer protokollen for dobbel-merking med Iba1 og Pan-nevronale (detaljer i tabell 1). Iba1 flekker mikroglia i mange aktiverings stater, inkludert ramified, hyper-ramified, aktivert, amoeboid og stang. Pan-nevronale flekker nevronale aksoner, dendritter, og Soma. Siden Iba1 flekker fleste mikroglia og Pan-nevronale mål nervecellen, er nyttig i å få en bred forståelse av mikroglia-nevroner interaksjoner denne kombinasjonen av flekker.
I sum, avhengig immunhistokjemisk farging på nøye utvalg av antistoffer. Som problemstillingen blir mer konkret, kan antistoffer hevet til alternative antigener være ønsket. Å målrette en bestemt microglial aktiveringsstatus, kan man velge å bruke CD45 eller CD68 antistoffer, snarere enn Iba1. Videre i arbeidet med mus, kan F4 / 80 gi de nødvendige resultatene. På samme måte kan neuronale elementer spesielt rettet med antistoffer ralakkering mot kjernen, synapse (før eller etter), axon, og vekst kjegle. I tillegg er det andre markører som skiller en alder av nervecellen (Dobbelt cortin, Neun), og neuronal regenerering (GAP-43).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer ble utført i samsvar med The Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Arizona. En liste over anbefalte materialer og utstyr finner du i tabell 1.
1. Vevspreparering
- Perfusjon
- Avlive gnager med en overdose av natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP), og perfuse tran med fosfatbufret saltvann (PBS) til det er helt tappet for blod (3-5 min) ved en strømningshastighet på 8 ml / min. For i dybden perfusjon instruksjoner under Gage et al 2012 9.
- Umiddelbart etter PBS flush, fast vev Ved perfusert med 4% paraformaldehyd i PBS i 15-20 minutter ved en strømningshastighet på 8 ml / min.
- Fjern hjerne og plasser i 4% paraformaldehyd i 24 timer, etterfulgt av graderte sukrose-løsninger (15%, 30%, 30%, i rekkefølge, fremstilles i Tris-bufret saltvann) ved 4 ° C. Overfør hjernen til den etterfølgende sukroseløsning oare etter at hjernen har sunket i hver løsning. Merk: Vanligvis fem dager i hver løsning er tilstrekkelig tid til vev å synke.
- Tissue Frysing og Cryosectioning
- Plasser hjernen i innstøpningsmediet, såsom oktober forbindelse og apparatet i isopentan ved en temperatur på -35 ° C. Tillat hjernen til å fryse i minst 10 min, og deretter lagres ved -80 ° C. Problemer kan oppstå dersom diligence til temperaturen ikke er tatt; se diskusjon for informasjon om feilsøking.
- Skjær serie koronale seksjoner med en tykkelse på 20 um og en temperatur på -20 ° C. Samle vev på positivt ladede lysbilder. Hjerne seksjoner kan plasseres i et lysbilde boks innpakket i folie i en zip-top bag og lagret langsiktig ved -80 ° C. Denne metoden for lagring danner en dobbel grense for å hindre eksponering for luft og frost.
2. Tissue Processing
MERK: Eksempel utstyr og materialer required for farging er vist i figur 3. Alternativer er tilgjengelig, vil imidlertid disse bildene hjelpe de nye til immunhistokjemisk farging å visualisere aktuelle elementene før kjøp.
Figur 3: Eksempel elementer som kreves for immunhistokjemisk farging Den svarte boksen vist i (A) er en ideell luftfuktighet kammer for immunfluorescens, som lysbilder er beskyttet mot lys uten å måtte pakke inn boksen på folien.. Etter seksjonering, kan slides oppbevares i en boks som gule boksen vist i (B). Innpakning boksen tett i folie og plassere i en zip-top bag før fryseren beskytter vevsprøver fra fryseren brenne. Et eksempel på et objektglass er angitt i (C), med forskjellige flekker retter vist i (D) og (E (F), men 1,2 tykke dekk gir fin bilde resultater på de fleste stående og konfokale mikroskoper. En blyant slik som den som er vist i (G) kan brukes til å merke lysbilder. Permanente markører bør unngås så blekket kan kjøre, som påvirker både flekker og muligheten til å finne ut hva prøven er. En mini pap penn slik som den som er vist i (H) muliggjør en frastøtende kant å bli trukket på objektglass.
- Slide forberedelse
- Fjern lysbilder fra fryseren og tine i romtemperatur.
- Valgfritt: Hvis seksjoner tidligere har fløt fra lysbilder, plasserer tint lysbilder i en ovn ved 60 ° C for ikke mer enn 4 timer for å hindre vevssnitt fra flytende av lysbilder.
- Plasser lysbilder i en lysbilde rack og tilhørende fatet.
- Vask glir tre ganger i PBS i 5 minutter hver, i endring løsning mellom hver vask. Fra dette skritt fremover, unngå at delen elons uten væske i lengre perioder av gangen. Merk: Dersom deler tørke ut, er bakgrunnsfarging økt og meningsfulle data kan ikke pålitelig oppnås.
- Fjern lysbilder fra fryseren og tine i romtemperatur.
- Tissue Farging
- I en lystett flekker boksen, lage en "fuktighet kammer" med lofri vev dynket med avionisert vann.
- Tørk kantene av raset med en lofri vev, bruk en mini pap penn for å lage en flytende frastøtende grensen helt på kanten av rasgropa, vekk fra vevssnitt. Denne grensen bør sikre rikelig plass mellom menisken av væsken og kanten av vevet, slik at overflatespenningen ikke påvirker farging.
MERK: pap penn frastøtende grensen kan brukes før 2.1.3 hvis antistoffene interesse ikke krever mikrobølgeovn antigen henting. Dersom pap pennen har vært brukt før vasking i PBS, må integriteten av væskefrastøtende grensen kontrolleres ved dette trinnet. Bruk en mini-pap penn til å fylle eventuelle hull i grensen. - Bruke serum fra samme art som sekundært antistoff blir gjort. Merk: I denne fremgangsmåten, blir de sekundære antistoffer laget i esel, og således esel serum anvendes. Hvis sekundære antistoffer fra to eller flere forskjellige arter anvendes, omfatter serum fra hver art.
- Pipette primær antistoff mot skred. Merk: antistoffkonsentrasjoner for farging er optimalisert på 1: 5000 og 1: 500 for Iba1 og Pan-nevronale hhv. Disse konsentrasjonene har blitt funnet å vise menings farging med et fravær av bakgrunnsfarging.
- Fortynne blokk løsning1% serum i PBS og tilsett primære antistoffer. Pipette 300 mL av primær antistoff løsning i 1% serum per lysbilde. Igjen, sikre væsken er til kanten av pap penn. Inkuber over natten ved 4 ° C.
- Inkluderer tre slides: en som inneholder verken Iba1 eller Pan-nevronale antistoffer, en med Iba1 uten Pan-nevronale antistoff, og en med Pan-nevronale antistoff uten Iba1. Flekk disse lysbildene i samme løp med de samme oppløsninger, men utelate de primære antistoffene for å teste ikke-spesifikk binding av de sekundære antistoffer.
- Den følgende morgen, glir vask tre ganger i PBS i 5 minutter hver, i endring løsning mellom hver vask.
- Fluorescerende antistoffer er lysømfintlig derfor fra dette skritt fremover, minimere lyseksponering ved å sikre vaske containere er pakket inn i folie og hybridiseringsbetingelser boksene er enten svart eller inkuberes i mørket. Pipette de aktuelle sekundære antistoffer på alle lysbilder og inkuberes i60 minutter ved romtemperatur ved en konsentrasjon på 1: 250 i blokk-løsning (se trinn 2.2.3) i et lystett "fuktighetskammer" (se trinn 2.2.1).
- Bruke sekundære antistoffer av forskjellige bølgelengder. Her, for det primære antistoff kanin anti-Iba1 bruker esel anti-kanin 594 som passende sekundært antistoff. For det primære antistoff mus anti-Pan-neuronal bruker esel-anti-muse 488 som passende sekundært antistoff. Alternativt bruke anti-kanin 488 og anti-mus 594.
- Vask glir tre ganger i PBS i 5 min hver.
- Valgfritt: utføre atom farging.
- Sted i Hoechst (eller annen atom flekk) ved en konsentrasjon på 0,03 ug / ml i dobbeltdestillert H 2 0 for nøyaktig 60 sek.
- Vask glir tre ganger i PBS i 5 min hver.
- Vask i DDH 2 0.
- Dekkglass med et vandig monteringsmedium, for eksempel Fluoromount-G eller ProlongGold. Vær nøye med å fjerne alle bobler med en bomulls-tipped applikator.
Merk: Andre monteringsmidler kan brukes, har imidlertid høy blø-through mellom fargestoffer blitt nevnt av noen innen dager coverslipping. - Bruk klar neglelakk for å forsegle kantene, hindrer delene fra å tørke ut på grunn av fordampning. Tillat neglelakk tørke i en lystett beholder, mens slides forbli flat og ved romtemperatur, og deretter lagres i en lystett beholder innpakket i folie ved 4 ° C.
3. Imaging Stained Tissue
- Mikroskopi
- La neglelakk tørke i minst en time før du begynner mikroskopi, som skal finne sted i et mørkt rom.
- Tilegne photomicrographs bruker en confocal eller forskning mikroskop med et fluorescerende lyskilde og et digitalt kamera vedlegg. Bruke den medfølgende programvaren, stille inn eksponering for hver bølgelengde - 405, 488 og 594 - separat. Merk: dyptgående bilde instruksjoner skal være tilgjengelig online fra mikroskopet produsenten.
- Erverve photomicrographs i hver kanal uten å flytte seksjonene eller justering av fokus. Ta bilder i farger, eller vekselvis i gråtoner og konvertere til farge etterpå.
Merk: Farge eller gråtonebilder fra hver kanal kan samles i etterbehandling. - Sikre at vevssnitt ikke utsettes for omgivende lys eller lys mikroskopisk for lange perioder av tid, som foto-bleking av seksjonene vil oppstå. For å unngå dette, øke eksponeringen tid snarere enn å øke lys / laser intensitet.
- Ikke slå av fluorescerende lyskilde innen 30 min for å bli slått på.
Merk: Slå kilden på og av i rask rekkefølge kan redusere levetiden på fluorescerende pære.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dette farging protokoll resultater i rottehjerne vevssnitt som har mikroglia fluorescensmerkede i 594-kanal (rød) og nevroner merket i 488-kanal (grønn, se figur 4). Hvis en atom flekken har blitt gjort, vil det vises i 405-kanal (blå). Bilder kan tas i ulike kanaler og kledde for direkte sammenligning av de tre kanalene, eller mellom to kanaler. Mange digitale oppkjøpet programvare suitene har denne funksjonaliteten. Dobbelt merking med Iba1 og Pan-nevronale markør vises her demonstrerer meste ramified mikroglia, med lange gode nevronale anslag tydelig over cortical lagene.
Figur 4:. Representative konfokale fluorescerende bilder av Iba-1 / Pan-nevronale dobbeltmerking Kolonne 1 viser mikroglia farget med Iba1 (rød). Nerveceller er vist iandre kolonne i grønt, og overlagt bilde av både røde og grønne kanaler i den tredje kolonnen. I den første rad, er det en fullstendig mangel på spesifikk farging på grunn av fravær av både primære antistoffer. Den andre raden viser spesifisitet av Pan-nevronale primær antistoff for nevronale flekker, mens den tredje raden viser spesifisitet Iba1 for microglia, med en fullstendig mangel på kryssreaksjon i begge tilfeller. Den fjerde rad illustrerer dobbeltmerking med en overlapping av de to kanalene som viser både microglial og nevronale farging. Scale bar 50 mikrometer.
Dårlige fargings resultatene er også vist (figur 5), som dokumentert av mangel på klart definerte celle organer og fragmenterte mikrogliaceller / nevronale prosesser. Høy bakgrunn indikerer dårlig kvalitet flekker, og kan sees ved ikke-spesifikk ko-lokalisering av antistoffer (se figur 5). Dessuten, hvis signalet er svakt, en forsterkning takt med fluorescently bundet streptavidin kan inkorporeres. I stedet for å bruke en direkte kodet fluorescerende sekundært antistoff i trinn 2.2.6, et biotinylert sekundært påføres. Etter vasking i PBS, streptavidin: er (1 1 000 i PBS) inkubert på skinnene i 1 time. Tilbake til protokollen i trinn 2.2.7 der lysbildene er deretter vasket og dyppet i en counterstain eller dekke glapp.
Figur 5:. Representative fluorescerende bilder av dårlig kvalitet vev Vist her er et eksempel på farging i dårlig vev som resulterer i en mangel på klarhet i microglial farging (a) og fullstendig mangel på neuronal-farging (B). Dette neuronal farging er bare høy bakgrunn. Den overlagt bilde (c) ikke er meningsfylt.
| Navn på materiell / utstyr | Selskap | Katalognummer | Kommentarer / beskrivelse |
| Fisherbrand Superfrost Plus glass | Fisher Scientific | 22-034-979 | Brukes for vev montering (1.2.2) |
| Stekeovn | Thermo Scientific | 51028112 | Brukes for vev tørking (2.1.1) |
| Mini Pap penn | Life Technologies | 00-8877 | Brukes i trinn 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-Tek Slide Farging Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Benyttes for alle vaskinger under farging (2,2), samt Hoechst trinn (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Brukes for tørking lysbilder (2.2) |
| Svart Farging Box | Ted Pella | 21050 | Brukes for blokkering og farging trinn (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Brukes for blokk og antistoff inkubasjon (2.2) |
| Muse α-Pan-nevronale | Millipore | MAB2300 | Brukes for primær antistoff (2.2.4) |
| Kanin α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Brukes for primær antistoff (2.2.4) |
| Esel α-Rabbit 594 | Jackson Immunoresearch | 711-585-152 | Brukes til sekundært antistoff (2.2.6) |
| Esel α-mus 488 | Jackson Immunoresearch | 715-545-150 | Brukes til sekundært antistoff (2.2.6) |
| Caterer sin folie | Enhver | N / A | Brukes i trinn 1.2.2 og 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Brukes for coverslipping (2.2.8) |
| Dekk | Fisher Scientific | 12544E | Brukes for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Enhver | N / A | Brukes for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 og LSM 710 (laserskanning, konfokalmikroskoper) | Carl Zeiss | N / A | Brukes for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Brukes for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB-protokollen | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB-protokollen |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB-protokollen |
| Biotinylerte hest α-kanin IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB-protokollen |
| Biotinylert heste α-mus IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB-protokollen |
| 30% hydrogenperoksyd | FisherScientific | H325-500 | For DAB-protokollen |
| Wheaton lysbilde stativer og farging retter | TedPella | 21043 | For DAB-protokollen |
| Master perfusjon pumpe og rør | Cole-Parmer | Brukes for perfusjon (1.1.1 og 1.1.2) | |
| Andwin vitenskapelig vev-tek Cryo-oktober forbindelse (Ved 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Brukes for vev frysing (1.2.1) |
| Termometer (-50 til 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Brukes for vev frysing (1.2.1) |
| Kryostat | Leica | CM3500S | Brukes for vev seksjonering (1.2.2) |
| Flekker Dish, Plast med to Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Farging Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Mikrobølgeovn | Enhver | N / A | For antigen retrival |
Tabell 1: Materialer List.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det overordnede målet med denne kommunikasjonen var å introdusere immunhistokjemi prosedyrer for leseren. For dette, til det eksempel på dobbeltmerking med Iba1 og Pan-nevronale antigener observere mikroglia og neuroner i paraformaldehyd perfusert, ble sukrose cryoprotected, cryosectioned rottehjerne anvendes.
Denne teknikken kan tilpasses for å tjene løse formål. En rekke forskjellige antigener i en rekke forskjellige vevstyper som for eksempel, men ikke begrenset til hjerne, lunge, lever, nyre og tarmen kan synliggjøres immunhistokjemisk med mindre endringer i protokollen. Immunhistokjemi gir mulighet for direkte sammenligning av flere markører og kan omfatte opptil fire forskjellige antistoffer i en enkelt prøve. Antallet antistoffer som brukes i en prøve blir begrenset av gjennomslag, som beskriver overlapping av fluorescerende bølgelengder. Det er et begrenset fluorescerende lys spekteret, som dermed begrenser fargekombinasjoner innenfor såingle prøven (se figur 6).
Når dobbeltmerking, er det best å velge primære antistoffer gjort i forskjellige arter, som begge antistoffer kan brukes samtidig. Dobbel-merking med to antistoffer fra samme art er mulig, selv om det er teknisk vanskelig. Når begge primære antistoffer er gjort i den samme art, må farging skje sekvensielt, ved å fullføre farging for en antigen før den andre. Færre problemer vil oppstå hvis de primære antistoffer fra samme art har ulike Ig klasser (dvs. mus IgG og mus IgM eller forskjellige underklasser IgG1 og IgG2a). For mer informasjon ta kontakt med flere referanser 10,11. Denne protokollen bruker kanin anti-Iba1 og mus anti-Pan-neuronal. Det er også nødvendig å inkludere egnede negative kontroller. For dobbel-merking med Iba1 og Pan-neuronal, inneholder ett lysbilde ingen primære antistoffer, inneholder ett lysbilde anti-Iba1 og bare ett lysbilde inneholder kun anti-Pan-neuronal (se figur 4). Disse negative kontroller bekrefte et fravær av kryssreaksjon og falsk farging. Alle andre lysbilder inneholde både primære antistoffer. Det er også viktig å unngå å bruke sekundære antistoffer som kan kryssreagerer. For eksempel, ved bruk av esel-anti-kanin 594 og kanin anti-mus 488 ville resultere i esel anti-kanin-594-binding til både kanin-anti-Iba1 primært antistoff og esel anti-kanin-anti-mus 594 488 sekundært antistoff. Dette ville skape falske co-merking. Antistoffer for et bestemt protein (antigen) er ikke alltid det samme. For eksempel har noen antistoffer dannet mot antigener som er tilstede i frosne vev, mens andre vil gjenkjenne et antigen som er blitt endret i løpet av parafin innebygging prosessen. Av denne grunn bør det særlig legges vekt på than antistoff blad før kjøp. Hvis det tiltenkte formålet for antistoff ikke er oppført, kan feilsøking være nødvendig for å få flekker, eller flekker kan ikke fungere i det hele tatt. I tillegg kan tidligere publiserte data tilbyr "triks av handelen" for å få flekker. Viktig å merke seg er at små forskjeller kan sees i ulike grupper av antistoffer; små endringer kan ha behov for å bli gjort med hver re-order av et antistoff. De fleste antistoffer er god for 12 måneder fra datoen for mottak. Husk å angi ankomstdagen på produktet spesifikasjonsarket. Hvis antistoffarging ikke følges, kan antistoffet være for gammel eller oppbevart på riktig måte. Det er derfor også viktig å sjekke hver antistoff er spesifikasjonsarket for forsvarlig oppbevaring. I tillegg, for mange antistoffer, forskjellige kloner er tilgjengelige. Forskjellige kloner gjenkjenner forskjellige deler av antigenet av interesse. Agitt klone kan være bedre for vev utsettes for ulike behandlingsteknikker (voks-embedded / frosne), målrette vevstype, eller målarter. Vær spesielt oppmerksom på de artene der antistoff ble hevet. Når antistoffet er hevet i samme art som den vev for analyse, kan høy bakgrunn observeres. For å bekjempe dette, SPERRE med kommersielt tilgjengelige sett for eksempel en mus på mus kit, kan være nødvendig for farging. Denne teknikken kan også bli tilpasset til cellekultur. Fiksering av celler, klone og spesifisitet må kontrolleres på spesifikasjonsarket for applikasjoner. Festes med paraformaldehydkryss lenker proteiner, noe som kan skjule antigen bindingsseter i noen forhold. Antigen henting kan bryte protein kryssbindinger og avsløre bindingssteder. Hvis antigen gjenfinning er nødvendig, sett inn følgende protokoll etter trinn 2.1.3: ved hjelp av en plast flekker tallerken og sett (se tabell 1), mikrobølge lysbilderi sitratbuffer på et lavt strømforbruk innstilling i 10 minutter, ta vare å ikke la løsningen koke strengt (spesifikke effektnivåer ikke inkludert på grunn av variasjon i innstillinger mellom mikrobølger). Alternativt bringe citratbuffer til 80 ° C i en glassfargings tallerken i en ovn, og deretter legge slides i 10 min. Dårlig kvalitet vev kan også forårsake problemer med farging (se figur 5). Det finnes en rekke forholdsregler man kan ta for å unngå at det går vev kvalitet. Først, være tålmodig og flittig med sukrose endringer for å grundig fortrenge vann i vevet før frysing. Ved frysing, holde temperaturen konstant. Hvis vevet fryser for langsomt, vil vannmolekylene ekspandere etter hvert som de fryse, noe som skaper hull i vevet. Alternativt, vil frysepunktet for lav temperatur forårsake at vevet til å sprekke. Protokoller vil variere noe for hvert antistoff av interesse. Ved mottak av en ny antistoff, må man velgeimize protokollen tilsvarende. Hvis bakgrunns er høy (figur 5), prøve blokkerer for en lengre periode. Alternativt øke serumkonsentrasjonen av blokken løsning eller legge serum fra flere forskjellige arter f.eks geit og kaninserum. I tillegg kan kasein brukes for å redusere ikke-spesifikk binding. Skummet melk (laget av tørt pulver) inneholder kasein, og kan brukes i en rekke konsentrasjoner (typisk 1-5% w / v). Melk kan brukes alene, eller i forbindelse med serum. Dersom et antigen av interesse er en intracellulær markør, kan detergenter slik at TritonX-100 eller Tween-20 tilsettes til den blokkerende løsning for å permeabilisere cellemembraner. Tykkere vevssnitt kan behandles på samme måte etter flytende vevssnittene i brønner i stedet for å montere dem på lysbilder. Parafininnstøpte vev kan også behandles på samme måte, men krever en de-voksing trinn før blokkering. Feldengut et al. 12 adresser begge disse metodene. En annen faktor å ta hensyn til DAB farging er at celler bestå av flere lag av vev. Det er derfor vanskelig å oppnå klare bilder av celler slik som mikroglia som har som strekker seg over prosesser. For å løse dette problemet, noen etterforskere kutte sine seksjoner tynnere på 8-12 mikrometer. Avbildning av fluorescensmerkede vev er best oppnås på en konfokal mikroskop. Konfokale mikroskoper eliminere dis normalt sett med en forsknings fluorescerende mikroskop ved å isolere og fange en enkelt plan av fokus i prøven. Med konfokalmikroskopi, finere detaljer er skarpere og blø-through mellom fluorescerende fargestoffer reduseres. Tykkere prøver kan avbildes en plan om gangen (z-stack) for å demonstrere sann ko-lokalisering. Når tilgang til et konfokalt mikroskop ikke er tilgjengelig, er det mulig avbildning på et forsknings mikroskop, men eksponeringstid og lysintensitet må være locked mellom bilder. 
Fig. 6: Farge spektrum diagram Hver fluorofor avgir en bestemt bølgelengde av lys når det påvirkes av en bestemt laser eller filter. For effektivt å produsere flermerkede vev, bør det være minimal overlapping mellom spesifikke fluoroforer konjugert til antistoffer. Selv om det finnes minst 10 forskjellige fluoroforer som er tilgjengelige på markedet, er det ikke mulig å oppnå entydige resultater hvis alle 10 blir brukt. For eksempel vil trippel-merking med bølgelengdeemisjoner ved 405, 488 og 594 (A) gir klar merking som det er minimal overlapping, om noen, mellom disse bølgelengdene. Imidlertid, hvis bølgelengde gasser på 488, 514 og 555 ble anvendt fargingen ikke ville være lett tolkes som hvert antistoff kan bli eksitert ved laser eller filter ment for den andre (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
