Primer for Immunhistokjemi på Cryosectioned Rat hjernevev: Eksempel Farging for Microglia og Nevroner
Summary
This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.
Abstract
Immunhistokjemi er en mye brukt metode for påvisning av nærvær, plassering og relative overflod av antigener in situ. Det innledende nivå protokollen beskriver reagensene, utstyr og teknikker som kreves for å fullføre immunhistokjemisk farging av gnagerhjernevevet, ved hjelp av markører for mikroglia og neuronal elementer som et eksempel. Nærmere bestemt er dette papiret en trinn-for-trinn-protokoll for fluorescerende visualisering av mikroglia og nevroner via immunhistokjemi for Iba1 og Pan-nevronale, respektivt. Fluorescens dobbeltmerking er spesielt nyttig for lokalisering av flere proteiner i samme prøve, og gir mulighet til nøyaktig å observere interaksjon mellom celletyper, reseptorer, ligander, og / eller den ekstracellulære matriks i forhold til hverandre, så vel som protein ko- lokalisering innenfor en enkelt celle. I motsetning til andre visualiseringsteknikker, kan fluorescens immunhistokjemi fargeintensitet reduksjon iukene til måneder etter flekker, med mindre nødvendige forholdsregler blir tatt. Til tross for denne begrensning, ved mange anvendelser fluorescens dobbel-merking er foretrukket fremfor alternativer som for eksempel 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) eller alkalisk fosfatase (AP), som fluorescens er mer tidseffektiv og sørger for mer nøyaktig å skille mellom to eller flere markører. Diskusjonen omfatter feilsøkingstips og råd for å fremme suksess.
Introduction
Immunhistokjemi er en fremgangsmåte for å detektere antigener (dvs. proteiner) i vevssnitt ved hjelp av primære antistoffer som bindes spesifikt til antigener av interesse. Immunhistokjemi ble utviklet av JR Marrack i 1934 da han bestemt at antistoffer kunne lokalisere antigener med stor spesifisitet 1. Starten i 1942, var noen av de første i vitro-studier med fluorescerende antistoffer til å visualisere immunhistokjemi publisert 2,3, etter som den første in vivo histokjemisk Studien ble publisert fire. I løpet av 1960-tallet, tre tiår etter starten av immunohistokjemiske metoder, enzym-konjugerte antistoffer begynte å bli brukt som sekundære reagenser. Disse metodene ble samtidig og uavhengig utviklet i Frankrike og USA 5,6. I dag, et bredt utvalg av antistoffer gir uendelige muligheter for immunhistokjemi studier 7.
"> Det overordnede målet med denne korrespondansen er å gi en kort innføring i immunhistokjemisk farging, det er ikke ment å være en omfattende og grundig gjennomgang av denne teknikken I metoden skissert, er immunhistokjemiske teknikker for to antigener presentert (markører for mikroglia og. nevroner) for farging av paraformaldehyd perfusert begynner sukrose cryoprotected, cryosectioned rottehjerne. Immunohistokjemisk farging med blokkering ikke-spesifikk antigenbinding å redusere bakgrunnsfarging. Deretter inkubering med primært antistoff gjør det mulig for binding til et spesifikt antigen i vevet. Etter det primære antistoff, et annet antistoff, betegnet sekundært antistoff, anvendes for å koble den primære antistoff til et konjugert signal visualisering 8. Det sekundære antistoffet er rettet mot immunglobulin G (IgG) domene spesifikt for artene i hvilke det primære antistoff ble hevet. Den sekundære antistoff forsterker signalet av det primære antistoff, siden de Fab-regionene i tHan sekundært antistoff binder seg til flere steder på IgG-domenet av det primære antistoff. Enten enzymer eller fluorescerende molekyler konjugert til S C regioner av det sekundære antistoff muliggjøre visualisering. For eksempel, er et kanin anti-Iba1 primært antistoff en kanin-IgG-molekyl som er spesifikt for Iba1. Når esel anti-kanin-IgG er anvendt som et sekundært antistoff, det vil gjenkjenne og binde seg til flere regioner av kanin anti-Iba1 IgG (se figur 1). Den esel antistoffet kan visualiseres ved hjelp av forskjellige metoder. Denne korrespondanse fokuserer på deteksjon av en fluorofor konjugert til det sekundære antistoff, som gjenkjenner det primære antistoff, for visualisering av fluorescerende mikroskopi. I fluorescerende immunhistokjemi, kan en atom flekken som Hoechst eller DAPI brukes til å visualisere alle kjerner.
Figur 1: Schematic representasjon av direkte sammenlignet med antistoff indirekte merkingsteknikker. Antistoffer bindes til antigenet av interesse og kan forsterkes ved sekundære antistoffer dannet mot arter av de primære antistoffer. Denne teknikken kan bli utført ved bruk av avidin-biotin kompleks (ABC) for forsterkning og DAB for visualisering (A), eller et direkte konjugerte fluorescerende sekundært antistoff (B). Alternativt kan primære antistoffer direkte konjugert med mange forskjellige koder, inkludert biotin eller en fluorofor (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En alternativ metode for visualisering av immunhistokjemisk farging benytter 3,3'-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB, se figurene 1 og 2). Dette skiller seg fra fluorescens ved hjelp av en eller biotinylertpepperrot-peroksidase (HRP) konjugert sekundært antistoff, noe som gir et enzym for å omdanne DAB til et bunnfall som er synlig under lysfelt-mikroskopi. I tilfeller der en enkelt antigen er av interesse eller farging er nødvendig for å bli langvarig, kan DAB være mer hensiktsmessig enn fluorescerende farging. Imidlertid DAB farging er ikke godt egnet for å differensiere mellom flere markører, spesielt hvis to nukleære antigener som er av interesse. For informasjon om DAB materialer og protokoll modifikasjoner, se i tabell 1. Alternativt kan nitro blå tetrazoliumklorid / 5-Bromo-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) brukes til å visualisere en alkalisk fosfatase (AP) konjugert sekundært antistoff.
Figur 2:. Representative bilder av nikkel-forsterket DAB enkeltmerkede rottehjerne vevssnitt Rat hjernen SEctions som er merket med nikkel-forbedret DAB for Iba1 (A) og Pan-nevronale (B) gir mulighet for langvarig analyse av mikroglia eller nevroner alene. Scale bar 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Man må ta hensyn til den beregnede mengde av antigenet av interesse i vevet som analyseres. Indirekte metoder (som beskrevet ovenfor) er nyttige for mål med lav overflod. Når antigen av interesse er i høy overflod, kan direkte metoder brukes. Direkte metoder involverer et primært antistoff som er direkte konjugert til en visualisering signal, og dermed ingen sekundære antistoff er nødvendig. Denne fremgangsmåten forenkler fargeprosessen, men eliminerer forsterkning oppnås ved indirekte metoder. Ved hjelp av en direkte konjugert primær antistoff eliminerer også kryssreaktivitet av sekundære antistoffernår dobbel-merking.
Denne kommunikasjonen detaljer protokollen for dobbel-merking med Iba1 og Pan-nevronale (detaljer i tabell 1). Iba1 flekker mikroglia i mange aktiverings stater, inkludert ramified, hyper-ramified, aktivert, amoeboid og stang. Pan-nevronale flekker nevronale aksoner, dendritter, og Soma. Siden Iba1 flekker fleste mikroglia og Pan-nevronale mål nervecellen, er nyttig i å få en bred forståelse av mikroglia-nevroner interaksjoner denne kombinasjonen av flekker.
I sum, avhengig immunhistokjemisk farging på nøye utvalg av antistoffer. Som problemstillingen blir mer konkret, kan antistoffer hevet til alternative antigener være ønsket. Å målrette en bestemt microglial aktiveringsstatus, kan man velge å bruke CD45 eller CD68 antistoffer, snarere enn Iba1. Videre i arbeidet med mus, kan F4 / 80 gi de nødvendige resultatene. På samme måte kan neuronale elementer spesielt rettet med antistoffer ralakkering mot kjernen, synapse (før eller etter), axon, og vekst kjegle. I tillegg er det andre markører som skiller en alder av nervecellen (Dobbelt cortin, Neun), og neuronal regenerering (GAP-43).
Protocol
Representative Results
Discussion
Det overordnede målet med denne kommunikasjonen var å introdusere immunhistokjemi prosedyrer for leseren. For dette, til det eksempel på dobbeltmerking med Iba1 og Pan-nevronale antigener observere mikroglia og neuroner i paraformaldehyd perfusert, ble sukrose cryoprotected, cryosectioned rottehjerne anvendes.
Denne teknikken kan tilpasses for å tjene løse formål. En rekke forskjellige antigener i en rekke forskjellige vevstyper som for eksempel, men ikke begrenset til hjerne, lunge, l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children’s Hospital Mission Support Funds.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-Rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l’Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. . Immunohistochemistry. , (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. . Junqueira’s basic histology : text and atlas. , (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L., Kumar, G. L., Rudbeck, L. . Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. , 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
