Het doel van dit protocol is om SDF-1α, een stamcel-home-factor, te integreren in dextransulfaat-chitosan nanodeeltjes. De resulterende deeltjes worden gemeten op hun grootte en zetapotentiaal, evenals de inhoud, activiteit en in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α uit de nanodeeltjes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Bereiding en karakterisering van SDF-1α-Chitosan-Dextransulfaat Nanodeeltjes
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chitosan (CS) en dextransulfaat (DS) zijn geladen polysachariden (glycanen), die polyelektrolytcomplex-gebaseerde nanodeeltjes vormen wanneer ze onder geschikte omstandigheden worden gemengd. De glycanen nanodeeltjes zijn nuttige dragers voor eiwitfactoren, die de in vivo levering van de eiwitten vergemakkelijken en hun retentie in het beoogde weefsel ondersteunen. De glycanen polyelektrolytcomplexen zijn ook ideaal voor eiwitlevering, omdat de incorporatie wordt uitgevoerd in waterige oplossing, wat de kans op inactivering van de eiwitten vermindert. Eiwitten met een heparine-bindende plaats hechten zich gemakkelijk aan dextransulfaat en worden op hun beurt door de binding gestabiliseerd. Deze deeltjes zijn ook minder ontstekingsverwekkend en toxisch wanneer ze in vivo worden toegediend. In het hieronder beschreven protocol wordt SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), een stamcel-homing factor, eerst gemengd en geïncubeerd met dextransulfaat. Chitosan wordt toegevoegd aan het mengsel om polyelektrolytcomplexen te vormen, gevolgd door zinksulfaat om de complexen met zinkbruggen te stabiliseren. De resulterende SDF-1α-DS-CS-deeltjes worden gemeten op grootte (diameter) en oppervlaktelading (zetapotentiaal). De hoeveelheid van het geïncorporeerde SDF-1α wordt bepaald, gevolgd door metingen van zijn in vitro afgiftesnelheid en zijn chemotactische activiteit in een deeltjesgebonden vorm.
Inleiding
Dextran sulfaat (DS) en chitosan (CS) zijn polysachariden met meerdere gesubstitueerde negatief geladen sulfaatgroepen (DS) of positief geladen aminogroepen (gedeacetyleerd CS). Wanneer gemengd in een waterige oplossing de twee polysacchariden vormen polyelectrolytcomplexen elektrostatische interacties. De resulterende complexen kunnen grote aggregaten die worden fase gescheiden van de waterige oplossing (neerslag) of kleine deeltjes die in water dispergeerbaar (colloïden) vormen. De specifieke voorwaarden die bijdragen aan deze uitkomsten zijn uitgebreid bestudeerd, en zijn samengevat en geïllustreerd in detail in een recente beoordeling 1. Onder deze oms....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van SDF-1α Glycan Nanodeeltjes
Door de toepassing van in vivo afgifte, steriliseren alle containers, pipetten en tips gebruikt bij de bereiding.
- Bereid de volgende voorraad oplossingen in ultrapuur water: 1% dextraansulfaat; 1 M NaOH (steriel gefiltreerd met een PES membraan); 0,1% chitosan in 0,2% ijsazijn (filter door 0,8 en 0,22 urn filters achtereenvolgens en pH op 5,5 met NaOH daarna); 0,1 M ZnSO 4; 15% mannitol; en 0,92 mg / ml SDF-1α (in porties bewaard bij 80 ° C en bij 4 ° C bewaard Ontdooide).
- Steriliseren voorraad oplossingen door 0,22 pm filter membranen. Beoordelen endotox....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De grootte en zetapotentiaal van de bereide SDF-1α-DS-CS deeltjes worden bepaald met een deeltjesanalysator. Figuur 1 toont de analyse van de maat opmeten. Uit de cumulanten resultaten verkregen uit vier herhaalde metingen, het gemiddelde hydrodynamische diameter van het SDF-1α-DS-CS deeltjes 661 ± 8.2 (nm) en de polydispersiteit is 0,23 ± 0,02. Het resultaat van de zeta potentieel meting wordt getoond in figuur 2. Van de vijf herhaalde metingen, het zeta potentieel van de SDF-1α-DS-CS .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zoals hierboven vermeld, worden de DS-CS nanodeeltjes gevormd door ladingsneutralisatie tussen polyanion (DS) en polykation (CS) moleculen. Omdat de lading interactie optreedt gemakkelijk tijdens de moleculaire botsing, de concentratie van de polymeeroplossingen en de roersnelheid tijdens mengen kritisch voor de grootte van de resulterende deeltjes. Een algemene trend is dat meer verdund DS en CS oplossingen 15 en hogere roersnelheid resultaat in kleinere deeltjes.
De formulering .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies: HL671795, HL048743 en HL108630.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dextransulfaat | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, laag moleculair gewicht | Sigma | 448869 | |
| Zinksulfaat heptahydraat | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Bereid volgens referentie 8. | ||
| Spuitfilter, PES membraan 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetische microroerstaven (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glazen vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Deeltjesanalysator | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Proteïne Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 Systeem | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeabele Steunen | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
Referenties
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
