Introduction
Dextran sulfaat (DS) en chitosan (CS) zijn polysachariden met meerdere gesubstitueerde negatief geladen sulfaatgroepen (DS) of positief geladen aminogroepen (gedeacetyleerd CS). Wanneer gemengd in een waterige oplossing de twee polysacchariden vormen polyelectrolytcomplexen elektrostatische interacties. De resulterende complexen kunnen grote aggregaten die worden fase gescheiden van de waterige oplossing (neerslag) of kleine deeltjes die in water dispergeerbaar (colloïden) vormen. De specifieke voorwaarden die bijdragen aan deze uitkomsten zijn uitgebreid bestudeerd, en zijn samengevat en geïllustreerd in detail in een recente beoordeling 1. Onder deze omstandigheden zijn de tegengesteld geladen polymeren moeten 1) significant verschillend molecuulgewicht twee basisvereisten voor het produceren water dispergeerbare deeltjes; en 2) worden gemengd in een niet-stoichiometrische verhouding. Deze voorwaarden zullen de kosten-neutrale gecomplexeerd polymere segmenten gegenereerd door lading toestaanneutralisatie te scheiden en vormen de kern van het deeltje, en de overmaat polymeer aan de buitenmantel 1 vormen. De glycan deeltjes beschreven in dit protocol zijn bedoeld voor pulmonale levering, en zijn ontworpen netto te zijn negatief geladen, en van nanometer afmetingen. De negatieve oppervlakte lading vermindert de kans op cellulaire opname van de deeltjes 2,3. Deeltjes van nanometer dimensie van de doorgang door het distale luchtwegen. Om dit doel te bereiken, de hoeveelheid DS in dit preparaat dan CS (gewichtsverhouding 3: 1); en hoog molecuulgewicht DS (gewichtsgemiddelde MW 500.000) en lage molecuulgewicht CS (MW 50-190 kDa, 75-85% gedeacetyleerd) gebruikt.
SDF-1α is een stamcel homing factor, die de homing-functie via haar chemotactische activiteit uitoefent. SDF-1α speelt een belangrijke rol bij homing en onderhoud van hematopoietische stamcellen in het beenmerg, en rekrutering van progeNitor cellen naar de perifere weefsels voor letsel reparatie 4,5. SDF-1α een heparine-bindingsplaats in de eiwitsequentie, waardoor het eiwit bindt aan heparine / heparansulfaat, vorm dimeren, worden beschermd tegen protease (CD26 / DPPIV) inactivering en interactie met doelcellen via celoppervlak receptoren 6-8. DS soortgelijke structuureigenschappen als heparine / heparansulfaat; dus de binding van SDF-1α DS zou vergelijkbaar met die van de natuurlijke polymere liganden.
In de onderstaande voorschriften beschrijven we de bereiding van SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes. De procedures vormen één van de formuleringen die eerder zijn onderzocht 9. Het protocol is oorspronkelijk aangepast van een onderzoek van VEGF-DS-CS nanodeeltjes 10. Een kleinschalige bereiding wordt beschreven, die gemakkelijk kan worden opgeschaald met dezelfde voorraad oplossingen en voorbereiding voorwaarden. Na bereiding worden de deeltjes gekarakteriseerd by behandeling van hun grootte, zeta potentieel, omvang van SDF-1α oprichting, in vitro release tijd, en de activiteit van de opgenomen SDF-1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van SDF-1α Glycan Nanodeeltjes
Door de toepassing van in vivo afgifte, steriliseren alle containers, pipetten en tips gebruikt bij de bereiding.
- Bereid de volgende voorraad oplossingen in ultrapuur water: 1% dextraansulfaat; 1 M NaOH (steriel gefiltreerd met een PES membraan); 0,1% chitosan in 0,2% ijsazijn (filter door 0,8 en 0,22 urn filters achtereenvolgens en pH op 5,5 met NaOH daarna); 0,1 M ZnSO 4; 15% mannitol; en 0,92 mg / ml SDF-1α (in porties bewaard bij 80 ° C en bij 4 ° C bewaard Ontdooide).
- Steriliseren voorraad oplossingen door 0,22 pm filter membranen. Beoordelen endotoxine niveaus in de bereide oplossing met limulus amoebocyt lysaat (LAL) gel stollingstest. Zorg ervoor dat de niveaus zijn <0,06 EU / ml.
- Voeg 0,18 ml ultrapuur water om een 1,5 ml glazen flacon met een magnetische roerstaaf. Stel het roer snelheid van 800 rpm. Voeg 0,1 ml 1%dextransulfaat en roer gedurende 2 min. Voeg 0,08 mg SDF-1α (0.087 ml 0,92 mg / ml SDF-1α oplossing) en roer gedurende 20 min.
- Voeg 0,33 ml 0,1% chitosan druppelsgewijs toe en roer gedurende 5 min. Verandering roer snelheid naar de maximale en voeg langzaam 0,1 ml 0,1 M ZnSO 4 met een 0,1 ml injectiespuit (meer dan 1 min).
- Terug roer snelheid tot 800 rpm en roer gedurende 30 min. Voeg 0,4 ml 15% mannitol en roer gedurende 5 min. Breng het reactiemengsel tot een 1,5 ml microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min.
Opmerking: De aanwezigheid van mannitol vergemakkelijkt de resuspensie van de deeltjes na centrifugeren. Afhankelijk van de dichtheid van de korrel kan mannitolconcentratie variëren van 0% tot 5%. Volledige resuspensie van de deeltjes na elke centrifugering cruciaal aggregaten in de uiteindelijke suspensie voorkomen. - Zuig supernatant en gebruik een pipet om de laatste druppel vloeistof langzaam te verwijderen. Voeg 0,2 ml 5% mannitol. Hang de pellet met een 0,5 ml, 29 G needle spuit. Voeg 1 ml 5% mannitol. Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 15 min.
- Herhaal stap 1.6.
- Zuig de supernatant. Resuspendeer de pellet in 0,2 ml 5% mannitol. Bewaar de deeltjessuspensie bij 4 ° C.
Opmerking: De deeltjessuspensie kan ook opgeslagen worden ingevroren bij -80 ° C of gevriesdroogd. Inclusief 5% mannitol in de suspensie is essentieel om aggregatie van de deeltjes na invriezen en ontdooien of na vriesdrogen en rehydratatie te voorkomen. Mannitol kan worden verwijderd door centrifugeren van de suspensie na de opslag.
2. Meting van de deeltjesgrootte en Zeta-Potentiaal
De deeltjesgrootte en zeta potentieel worden geanalyseerd door middel van dynamische lichtverstrooiing en elektroforetische lichtverstrooiing, respectievelijk, met een deeltjesanalysator aangegeven Material List.
- Stel de volgende parameters voor de deeltjesgrootte meting: Accumulatie tijden: 70; Herhaal keer: 4; Temperatuur: 25 ° C;Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto.
- Verdun het SDF-1α-DS-CS monster met water (10-voudige verdunning). Plaats 100 pl van het monster aan een wegwerpbare UV kuvet zoals een Eppendorf cuvet. Plaats de cuvet in de cel houder. Wacht tot de intensiteit aanpassing aan "Optimum" (~ 10.000 cps) bereikt. Start data-acquisitie.
- Nadat de meting is voltooid, registreren de cumulanten resultaten van diameter (nm) en polydispersiteit index. Gemiddeld verkregen uit elk van de 4 herhaalde metingen resultaten en bepaal de standaardafwijking.
- Lading 500 pl van de 10-voudig verdunde deeltjesmonster een stroomcel voor zetapotentiaal meting. Stel de volgende parameters voor het meten: Accumulatie tijden: 10; Herhaal tijden: 5; Temperatuur: 25 ° C; Oplosmiddel: water; Intensiteit aanpassing: auto. Noteer de resultaten van de zeta-potentiaal (mV). Het gemiddelde van de resultaten van elk van de 5 herhaalde metingen resultaat, en bereken de standaard deviation.
3. Kwantificering van SDF-1α in de Deeltjes
- Verdun vrije vorm SDF-1α concentraties van 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, en 0,05 mg / ml in 1,3 x Laemmli monsterbuffer. Verdun 6 pl SDF-1α-DS-CS monsters met 40 gl 1,3 x Laemmli monsterbuffer. (Bereid 4x Laemmli stock buffer die 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% glycerol, 0,05 mg / ml broomfenolblauw, en 8% 2-mercaptoethanol. Verdeel de stockoplossing in kleine porties en bewaar bij -20 ° C voor eenmalig gebruik.)
- Verwarm de monsters bij 100 ° C gedurende 10 min. Vortex de monsters tweemaal (elk gedurende 10 seconden bij maximale snelheid) gedurende 10 min opwarmtijd om de deeltjes volledig dissociëren. Koel de monsters tot kamertemperatuur gedurende 2 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 0,5-1 min het water condensaat naar beneden te brengen. Weer vortex goed te mengen.
Opmerking: Op dit punt moet de monsteroplossing helder zonder zichtbare neerslag aanwezig. - Load 10 &# 181; l monster / goed op een 4-20% SDS-gel. Run elektroforese bij 200 V gedurende 20 minuten. Vlekken op de gel met Coomassieblauw eiwit vlek.
- Onderzoeken het eiwit band dichtheid van SDF-1α met behulp van een moleculaire imager en densitometry analyse software. Bereken de hoeveelheid SDF-1α in de deeltjes tegen een standaardkromme geconstrueerd met gratis SDF-1α standaarden.
4. In vitro afgifte assay
- Mix SDF-1α glycan deeltjes met Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium (D-PBS) bij een 1: 1 verhouding (v / v).
- Verdeel de deeltjessuspensie in 0,05 ml porties in 1,5 ml buizen. Plaats de monsters naar de bodem van de buizen. Voorkomen dat er luchtbellen of het oppervlak van de vloeistof te storen. Dicht de top van de buizen met Parafilm.
OPMERKING: Daarbij zal de vloeistof onderin blijven tijdens de daaropvolgende boven naar beneden draaien op de buis mixer. - Draai de buizen op 37 &# 176; C op een roterende Micro-Tube Mixer. Verwijder aliquots uit de buizen bij de aangegeven tijden en onmiddellijk gecentrifugeerd de monsters bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Scheid de supernatanten en pellets, en los het pellet met 0,05 ml D-PBS. Bewaar de monsters bij -20 ° C. Nadat alle monsters verzameld, onderzoekt de supernatanten en pellets op een SDS-gel zoals hierboven beschreven.
5. Migratie Assay
Deze test meet de chemotactische activiteit van SDF-1α. Interactie van SDF-1α met zijn receptor (CXCR4) op het celoppervlak veroorzaakt migratie van de cel naar de SDF-1α gradiënt. In deze assay worden de cellen geplaatst in een bovenste put (gescheiden door een semipermeabel membraan van een lagere well) en SDF-1α oplossing in een lagere put.
- Verdun SDF-1α (vrij of deeltjes gebonden vorm) migratie buffer (RPMI-1640 medium dat 0,5% bovine serum albumine) in een 3-fold seriële verdunning tot eindconcentraties van 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 en 0,05 ng / ml.
- Voeg 0,6 ml van de verdunde SDF-1α oplossing of migratie buffer alleen (negatieve controle) aan een putje in de 24-well plaat. Voeg 0,57 ml migratie buffer tot een goed (input cel controle). Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min. Plaats een permeabele celkweek insert zoals Transwell (poriegrootte 5 urn, 6,5 mm) bovenop de onderste put. Load 0,1 ml Jurkat-cellen (5 x 10 5) in de Transwell voegen. Laad 0,03 ml cellen rechtstreeks aan de ingang celcontrole goed. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 2 uur in een 5% CO2 incubator.
- Verwijder de Transwell inzetstukken. Breng de cellen die zijn gemigreerd naar de onderste putjes van een 4 ml polystyreen buis. Tel de gemigreerde cellen met een flowcytometer.
- Bereken migratie als percentage van het aantal invoercel (celaantal in de invoercel controleputje x 100/30) na aftrekken van de getallen in negative controles (cellen gemigreerd naar de putjes die alleen migratie buffer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De grootte en zetapotentiaal van de bereide SDF-1α-DS-CS deeltjes worden bepaald met een deeltjesanalysator. Figuur 1 toont de analyse van de maat opmeten. Uit de cumulanten resultaten verkregen uit vier herhaalde metingen, het gemiddelde hydrodynamische diameter van het SDF-1α-DS-CS deeltjes 661 ± 8.2 (nm) en de polydispersiteit is 0,23 ± 0,02. Het resultaat van de zeta potentieel meting wordt getoond in figuur 2. Van de vijf herhaalde metingen, het zeta potentieel van de SDF-1α-DS-CS deeltjes -24,8 ± 0,5 mV. Zoals hierboven vermeld, de aanwezigheid van 5% mannitol in het SDF-1α-DS-CS deeltjessuspensie essentieel voor het voorkomen van deeltjesaggregatie tijdens invriezen en ontdooien. Figuur 3 toont de grootte meting van de deeltjes gesuspendeerd in water en bevroren -80 ° C. Een duidelijke aggregatie piek zichtbaar is na het ontdooien.
De amount van SDF-1α in het SDF-1α-DS-CS deeltjes geschat met SDS gelelektroforese. Figuur 4A toont een Coomassie blauw gekleurde SDS-gel met SDF-1α standaarden DS-CS nanodeeltjes (controle deeltjes zonder SDF-1α incorporatie , Ctrl NP) en SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes (SDF-1α NP) monsters geladen. Een standaardcurve wordt gemaakt van de dichtheid analyse van de SDF-1α standaard banden (Figuur 4B). Berekening van de standaard kromme geeft aan dat de SDF-1α concentratie in het SDF-1α NP monster is 0,03 mg / ml (gemiddelde van duplo). Aangezien de verdunning van het monster met het monster buffer (6 + 40) / 6, de oorspronkelijke monsterconcentratie 0,23 mg / ml. Aangezien het eindvolume van het preparaat van 0,2 ml, totaal SDF-1α in de uiteindelijke suspensie is 0,046 mg. Gezien de ingang massa van SDF-1α in het reactiemengsel is 0,08 mg, de oplaadefficiëntie van SDF-1α in de DS-CS deeltjes 57%. Briefjeosan werd eerder gemeld om vlekken met Coomassie blauw. De kleuring is echter niet significant in de in figuur 4A gel. Het is misschien gerelateerd aan de hoeveelheid chitosan (deeltjes matrix) op de gel geladen. In elk geval, volledige dissociatie en scheiding van SDF-1α van het deeltje matrix noodzakelijk voor het nauwkeurig beoordelen van de hoeveelheid van het opgenomen eiwit. Deze gel blijkt dat SDF-1α niet detecteerbaar afgebroken door verhitting bij 100 ° C gedurende 10 minuten of de vortex werkwijze, omdat er geen banden worden gevonden tussen de SDF-1α eiwit band en de kleurstof voorkant.
De in vitro afgiftesnelheid van SDF-1α van de nanodeeltjes wordt bepaald door incubatie van de deeltjes in 50% D-PBS bij 37 ° C gedurende 7 dagen. Bij 0 uur, 3 uur, 8 uur, 24 uur, 48 uur en 7 dagen, worden monsters van de monsters verwijderd en onmiddellijk gecentrifugeerd. De vrijgegeven SDF-1α (in het supernatant) wordt gescheiden van de deeltjes gebonden SDF-1α (pellet). De monsters lopen op een SDS-gel en de hoeveelheid SDF-1α in de supernatanten en pellets worden bepaald door Coomassie kleuring en densitometrie analyse. Een typische SDS-gel van de analyse wordt getoond in figuur 5. Zoals aangetoond, is het deeltje gebonden SDF-1α minimaal vrijgegeven na 7 dagen incubatie.
De activiteit van de deeltjes gebonden SDF-1α wordt gemeten door een migratie assay (chemotactisch assay), en vergeleken met die van vrije SDF-1α. Bij deze test wordt SDF-1α in de DS-CS nanodeeltjes serieel verdund met migratie buffer en geïncubeerd met Jurkat-cellen gedurende 2 uur. De gemigreerde cellen geteld met een flowcytometer. De gegevens (met SDF-1α concentraties van 0,05-11 ng / ml) wordt uitgezet met niet-lineaire regressie passend, en de EC50 berekend. Zoals getoond in figuur 6, de deeltjes gebonden SDF-1α geïnduceerde dezelfde mate van migratie die vrij SDF-1 ^5; bij alle concentraties gemeten. De EC50 waarden van de vrije en deeltjes gebonden vormen van SDF-1α zijn 0,55 en 0,45 ng / ml.
Figuur 1. Analyse screen shot waarin dynamische lichtverstrooiing meting van de deeltjesgrootte. De bovenste twee panelen tonen de percelen van de autocorrelatiefunctie, G2 (τ), en de logaritme van [G2 (τ) -1] in de tijd. Het instrument digitale signaalprocessor (correlator) drukt de gedetecteerde lichtintensiteit als functie van de vertragingstijd (τ). De plot laat zien dat SDF-1α-DS-CS deeltjes veroorzaakt een exponentiële verval van de intensiteit tussen 0,2-2 msec. Om de gemiddelde vervalconstante verkrijgen <Γ>
Figuur 2. Analyse screen shot waarin elektroforetische lichtverstrooiingmeting van het zeta potentieel. Het bovenste paneel toont een G2 (τ) na verloop van tijd plot. De langzaam rottende oscillatiefunctie wordt meestal waargenomen bij geladen deeltjes die worden onderworpen aan elektroforese en lichtverstrooiing. De functie geeft de frequentieverschuiving (Doppler verschuiving), veroorzaakt door bewegende deeltjes in het elektrische veld. Een Fourier-transformatie van G2 (τ) geeft het vermogensspectrum (intensiteit versus frequentie perceel) weergegeven in het middelste paneel. Het centrum van de frequentieverschuiving piek wordt de mobiliteit van de deeltjes waaruit de zeta-potentiaal berekend. De berekende zeta potentieel wordt onderaan het scherm.
Figuur 3. Deeltjesgrootte meting van SDF-1 α-DS-CS deeltjes na invriezen en ontdooien in water. Bij afwezigheid van mannitol, de deeltjes aggregates na invriezen en ontdooien. Let op de vorming van een extra intensiteit / grootte piek en de toename cumulanten diameter en polydispersiteit vergeleken met die van figuur 1.
Figuur 4. Kwantificering van SDF-1 α incorporatie in DS-CS nanodeeltjes. (A) foto Coomassie-gekleurde SDS-gel geladen met gratis SDF-1α normen, DS-CS nanodeeltjes (Ctrl NP) en SDF-1α-DS- CS nanodeeltjes (SDF-1α NP) monsters zoals aangegeven. De SDF-1α eiwit bands en de gel loopt kleurstof voorzijde zijn gemarkeerd. De Ctrl NP monsters worden niet gekleurd met Coomassie blauw en de chitosan banden (breed) zijn vaag zichtbaar. (B) De banden worden geanalyseerd met een densitometer, waarvan de standaardcurve wordt gemaakt met de vrije SDF-1α standaarden (gemiddeld duplicate). De hoeveelheid SDF-1α in de nanodeeltjes berekend tegen de standaardcurve, die een gemiddelde waarde van 0,3 ug / putje (10 ui) geeft.
Figuur 5. SDS gel die SDF-1 α in vitro afgifte tijdsverloop. Coomassie gekleurde SDS gel geeft de hoeveelheid afgegeven SDF-1α (in supernatanten) en gebonden SDF-1α (pellets) na incubatie van SDF-1α-DS -CS nanodeeltjes bij 37 ° C gedurende verschillende perioden. Re-bedrukt met toestemming van 9.
Figuur 6. Dosisresponscurves van SDF-1 α (cirkels) en SDF-1α nanodeeltjes (NP) (vierkanten) in een Jurkat- cel migratie assay. SDF-1α in zowel gratis en nanodeeltjes op weg naarms vertoonde dezelfde activiteit met EC50-waarden van 0,55 en 0,45 ng / ml. Re-bedrukt met toestemming van 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals hierboven vermeld, worden de DS-CS nanodeeltjes gevormd door ladingsneutralisatie tussen polyanion (DS) en polykation (CS) moleculen. Omdat de lading interactie optreedt gemakkelijk tijdens de moleculaire botsing, de concentratie van de polymeeroplossingen en de roersnelheid tijdens mengen kritisch voor de grootte van de resulterende deeltjes. Een algemene trend is dat meer verdund DS en CS oplossingen 15 en hogere roersnelheid resultaat in kleinere deeltjes.
De formulering van de SDF-1α glycan nanodeeltjes kunnen worden gevarieerd. Bijvoorbeeld, de hoeveelheden en verhoudingen van SDF-1α / DS / CS gebruikt in dit protocol zijn 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), respectievelijk. Afhankelijk van het beoogde gebruik van SDF-1α nanodeeltjes, kunnen deze verhoudingen veranderen. Als de hoeveelheid SDF-1α toegevoegd aan het mengsel 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) in plaats van 0,08 mg, de deeltjes kleiner zijn, ~ 650 nm, en SDF-1α oplaadefficiëntie licht greater, 70-80% 9. Echter, bij aflevering in vivo, een grotere hoeveelheid van de glycan matrix aanwezig per SDF-1α zijn. Als een kleinere deeltjesgrootte gewenst kan de formulering van SDF-1α glycan nanodeeltjes verder gemodificeerd. Een alternatief is om een kleiner molecuulgewicht chitosan gebruiken, zoals aangetoond in 15 Ref. Opgemerkt zij echter, dat chitosan een hoge affiniteit voor endotoxine (negatief geladen lipopolysacchariden); dus een test endotoxinegehalte of mogelijk een zuivering noodzakelijk is voor het gebruik van chitosan producten voor in vivo afgifte. Het tweede alternatief is SDF-1α laden op voorgevormde kleine DS-CS nanodeeltjes. Omdat de laatste kan gemakkelijker worden gemanipuleerd deeltjesgrootte en SDF-1α heeft een hoge affiniteit voor DS, het laden van een kleine hoeveelheid van SDF-1α aan de buitenkant van de DS-CS deeltjes kan leiden tot kleinere deeltjes.
Vergeleken met andere typennanodeeltjes (bijvoorbeeld PLGA 11 polyanhydride 12 of 13 gelatine nanodeeltjes), de DS-CS nanodeeltjes specifieke voordelen en beperkingen. De belangrijkste voordelen van de DS-CS nanodeeltjes zijn: 1) het deeltje preparaat geen organische oplosmiddelen of krachtige sonificatie betrekken. Het is daarom geschikt voor eiwitfactor bijmenging zo zacht preparaat vermindert de kans eiwit inactivering; 2) de matrix van de deeltjes een soortgelijke structurele eigenschap extracellulaire matrix, waarbij de deeltjes geschikt weefselomgeving maakt en minder toxisch en inflammatoire; en 3) glycan deeltjesgebonden SDF-1α bootst een natuurlijke binding tussen het eiwit en de extracellulaire matrix, die het volledige chemotactische activiteit van SDF-1α verklaart na in de glycan deeltjes worden opgenomen. De volledig actief SDF-1α in de deeltjes gebonden vorm toestaat om als stationair homing factor weefsel environment. De beperkingen van de DS-CS nanodeeltjes zijn: 1) de diameter van de deeltjes in het algemeen groter dan de hierboven genoemde deeltjes; en 2) gemakkelijk instorten in zoutoplossingen, die niet geschikt zijn voor directe injectie in de bloedsomloop kunnen zijn.
De deeltjes gebonden SDF-1α blijkt minimaal vrijkomen van de nanodeeltjes na zeven dagen incubatie. Dit verschijnsel houdt verband met de hoge affiniteit van SDF-1α voor heparine, wat ook bijdraagt aan zijn functie in vivo. Omdat eiwitten met heparine bindende domeinen zullen in verschillende affiniteiten voor heparine, hun afgiftesnelheden waarschijnlijke verschillen. Bijvoorbeeld, in een VEGF 165 -Ds-CS nanodeeltjes bereid volgens een soortgelijke formulering, werd 44% van de opgenomen VEGF 165 uitgebracht in het eerste uur en 29% werd in de volgende 47 uur bij incubatie bij 37 ° C 14. Daarom is de in vitro afgifte patroon voor een bepaald protein moet individueel worden getest.
Het doel van de voorbereiding van de SDF-1α-DS-CS nanodeeltjes SDF-1α leveren aan de longen en stellen een stamcel homing signaal in het weefsel. De deeltjes kunnen ook worden afgegeven aan andere weefsels hetzelfde doel, hoewel de specifieke nanodeeltje indeling niet nodig is voor vast weefsel injectie. Dat SDF-1α wordt gestabiliseerd door DS in de nanodeeltjes matrix en minimaal losgemaakt van de deeltjes ondersteunt stam beginselen celrecrutering en het deeltje naar verwachting gunstig voor weefselregeneratie te zijn.
Aangezien het eiwit-glycaan nanodeeltjes een identieke matrix met die van celoppervlak glycosaminoglycanen en extracellulaire matrix, is het mogelijk dat de deeltjes opgenomen eiwitten kunnen worden omgewisseld in deze matrices (de negatief geladen extracellulaire matrix moleculen kunnen concurreren met de binding van de positief geladen eiwit) in vivo in vitro karakterisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies: HL671795, HL048743 en HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H. Characterization of the stromal cell-derived factor-1alpha-heparin complex. J Biol Chem. 276 (11), 8288-8296 (2001).
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
