Préparation et caractérisation des SDF-1α-chitosane-Sulfate de Dextran nanoparticules
Summary
The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.
Abstract
Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.
Introduction
Sulfate de dextran (DS) et le chitosan (CS) sont des polysaccharides avec plusieurs groupes sulfate chargés négativement substitués (dans DS) ou des groupes aminés chargés positivement (désacétylés CS). Lorsqu'il est mélangé à une solution aqueuse, les deux polysaccharides forment des complexes polyélectrolytiques par des interactions électrostatiques. Les complexes résultants peuvent former de gros agrégats qui seront phases séparées de la solution aqueuse (précipités), ou de petites particules qui sont dispersables dans l'eau (colloïdes). Les conditions spécifiques qui contribuent à ces résultats ont été largement étudiées et ont été résumés et illustrés en détail dans une étude récente 1. Parmi ces conditions, deux conditions de base pour la production de particules dispersibles dans l'eau sont les polymères de charges opposées doivent 1) ont une masse molaire sensiblement différente; et 2) être mélangés dans un rapport non stoechiométrique. Ces conditions permettront aux segments polymères complexés charge neutre produites par la chargeneutralisation de séparer et de former le noyau de la particule, et le polymère en excès pour former la coque externe 1. Les particules glycanes décrites dans ce protocole sont destinés à une administration pulmonaire, et sont conçus pour être nette chargé négativement, et de dimensions nanométriques. La charge de surface négative réduit la probabilité d'absorption cellulaire des particules 2,3. Les particules de dimension nanométrique de faciliter le passage à travers les voies aériennes distales. Pour atteindre cet objectif, la quantité de DS utilisé dans cette préparation est supérieure à CS (rapport pondéral 3: 1); et de haute masse moléculaire DS (moyenne en poids MW 500 000) et de faible poids moléculaire CS (gamme de 50 à 190 MW kDa, 75-85% désacétylé) sont utilisés.
SDF-1α est un facteur de ralliement de cellules souches, qui exerce la fonction de référencement à travers son activité chimiotactique. SDF-1α joue un rôle important dans la prise d'origine et le maintien des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, et dans le recrutement de progecellules Nitor à tissus périphériques à la réparation des lésions de 4,5. SDF-1α a un site de liaison à l'héparine dans la séquence de la protéine, ce qui permet à la protéine de se lier à l'héparine / sulfate d'héparane, former des dimères, être protégés contre la protéase (CD26 / DPPIV) inactivation, et d'interagir avec des cellules cibles par l'intermédiaire des récepteurs de surface cellulaire 6-8. DS a des propriétés structurelles similaires à celles de l'héparine / héparane-sulfate; Ainsi, la liaison du SDF-1α pour DS serait similaire à celui de ses ligands polymères naturels.
Dans le protocole suivant, nous décrivons la préparation de nanoparticules SDF-1α-DS-CS. Les procédures représentent l'une des formules qui ont été précédemment étudiés 9. Le protocole est à l'origine adapté d'une enquête de nanoparticules VEGF-DS-CS 10. Une petite préparation à grande échelle est décrite, qui peut être facilement mise à l'échelle avec les mêmes solutions d'achat d'actions et les conditions de préparation. Après la préparation, les particules sont caractérisées by examiner leur taille, le potentiel zêta, degré d'incorporation SDF-1α, in vitro temps de libération, et l'activité du SDF-1α incorporé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme mentionné ci-dessus, les nanoparticules DS-CS sont formés par neutralisation de la charge entre le polyanion (DS) et de polycation (CS) molécules. Étant donné que l'interaction de charge se produit facilement pendant la collision moléculaire, la concentration des solutions de polymère et la vitesse d'agitation au cours du mélange est critique pour la taille des particules résultantes. Une tendance générale est que plus dilué DS et CS solutions 15 et le résultat de la vitesse d'a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions du NIH: HL671795, HL048743 et HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | |
| Syringe filter, PES membrane 0.22 um. | Millipore | SLGP033RS |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | |
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
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