Introduction
Solfato Dextran (DS) e chitosano (CS) sono polisaccaridi con più sostituiti gruppi solfato carica negativa (a DS), o gruppi di ammine cariche positivamente (deacetilata CS). Quando miscelato in una soluzione acquosa, i due polisaccaridi formano complessi polielettroliti attraverso interazioni elettrostatiche. I complessi risultanti possono formare grandi aggregati che verrà a fasi separate dalla soluzione acquosa (precipitati), o piccole particelle che sono disperdibili in acqua (colloidi). Le condizioni specifiche che contribuiscono a questi risultati sono stati ampiamente studiati e sono stati riassunti ed illustrato in dettaglio in una recente revisione 1. Tra queste condizioni, due requisiti fondamentali per la produzione di particelle idrodispersibili sono i polimeri di carica opposta devono 1), una massa molare significativamente diverse; e 2) essere miscelato in un rapporto non stechiometrica. Queste condizioni permetteranno ai complessati segmenti polimerici carica neutrale generate dalla caricaneutralizzazione di segregare e formare il nucleo della particella, e il polimero in eccesso per formare il guscio esterno 1. Le particelle glycan descritti in questo protocollo sono destinati per la consegna polmonare, e sono progettati per essere al netto carica negativa, e di dimensioni nanometriche. La carica superficiale negativa riduce la probabilità di assorbimento cellulare delle particelle 2,3. Particelle di dimensioni nanometriche facilitano il passaggio attraverso le vie aeree distali. Per raggiungere questo obiettivo, la quantità di DS usato in questa preparazione è in eccesso di CS (rapporto in peso 3: 1); ed alto peso molecolare DS (medio ponderale Mw 500.000) e basso peso molecolare CS (MW 50-190 kDa, 75-85% deacetilato) sono utilizzati.
SDF-1α è un fattore di homing delle cellule staminali, che esercita la funzione di riferimento attraverso la sua attività chemiotattica. SDF-1α svolge un ruolo importante in homing e manutenzione di cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo, e nel reclutamento di progecellule Nitor per tessuti periferici per la riparazione del pregiudizio 4,5. SDF-1α ha un sito-eparina vincolante nella sua sequenza della proteina, che permette la proteina di legarsi all'eparina / eparansolfato, formare dimeri, essere protetti da proteasi inattivazione (CD26 / DPPIV), e di interagire con le cellule bersaglio tramite i recettori della superficie cellulare 6-8. DS ha simili proprietà strutturali come eparina / eparansolfato; pertanto, il legame di SDF-1α DS sarebbe simile a quella dei ligandi polimerici naturali.
Nella seguente protocollo, si descrive la preparazione di nanoparticelle SDF-1α-DS-CS. Le procedure rappresentano una delle formulazioni precedentemente studiate 9. Il protocollo è originariamente adattato da un'indagine di nanoparticelle VEGF-DS-CS 10. Una piccola scala preparazione è descritta, che può essere facilmente scalata con le stesse soluzioni stock e condizioni di preparazione. Dopo la preparazione, le particelle sono caratterizzati by esaminando le loro dimensioni, potenziale zeta, estensione di incorporazione SDF-1α, tempo di rilascio in vitro, e l'attività del incorporata SDF-1α.
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Protocol
1. Preparazione di SDF-1α Glycan nanoparticelle
Grazie allo scopo della fornitura in vivo, sterilizzare tutti i contenitori, pipette e puntali usati nella preparazione.
- Preparare le seguenti soluzioni madre in UltraPure Acqua: 1% di solfato di destrano; 1 M NaOH (sterile filtrata con una membrana PES); 0,1% chitosano in 0,2% di acido acetico glaciale (filtro attraverso 0,8 e 0,22 micron filtri consecutivamente e regolare il pH a 5,5 con NaOH in seguito); 0.1 M ZnSO4; 15% mannitolo; e 0,92 mg / ml SDF-1α (memorizzati in aliquote a 80 ° C, e conservato a 4 ° C una volta scongelati).
- Sterilizzare soluzioni madre attraverso 0,22 micron membrane filtranti. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata con dosaggio limulus lisato di amebociti (LAL) gel coagulo. Assicurarsi che i livelli sono <0,06 EU / ml.
- Aggiungere 0,18 ml UltraPure acqua per un flaconcino di vetro da 1,5 ml contenente un bastoncino magnetico. Impostare la velocità scalpore a 800 giri al minuto. Aggiungere 0,1 ml 1%solfato destrano e mescolare per 2 minuti. Aggiungere 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml di 0,92 mg / ml SDF-1α soluzione) e mescolare per 20 min.
- Aggiungere 0,33 ml 0,1% chitosano, goccia a goccia e mescolare per 5 min. Cambio di velocità mescolare al massimo e aggiungere 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 lentamente con una siringa da 0,1 ml (oltre 1 min).
- Ritorna velocità mescolare a 800 giri al minuto e mescolare per 30 min. Aggiungere 0,4 ml 15% mannitolo e mescolare per 5 min. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min.
Nota: La presenza di mannitolo facilita la risospensione delle particelle dopo centrifugazione. A seconda della compattezza del pellet, la concentrazione mannitolo può essere variata da 0% al 5%. La completa risospensione delle particelle dopo ogni centrifugazione è fondamentale per evitare aggregati nella sospensione finale. - Aspirare il surnatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l'ultima goccia di liquido lentamente. Aggiungere 0,2 ml 5% mannitolo. Sospendere il pellet con 0,5 ml, 29 G neesiringa dle. Aggiungere 1 ml 5% mannitolo. Centrifugare a 16.000 xg per 15 min.
- Ripetere il punto 1.6.
- Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 0,2 ml 5% mannitolo. Conservare la sospensione di particelle a 4 ° C.
Nota: La sospensione di particelle può anche essere congelati a -80 ° C o liofilizzato. Compresi 5% mannitolo nella sospensione è essenziale per prevenire l'aggregazione delle particelle dopo il congelamento e scongelamento o dopo liofilizzazione e reidratazione. Mannitolo può essere rimosso mediante centrifugazione della sospensione dopo lo stoccaggio.
2. Determinazione della dimensione delle particelle e Zeta Potenziale
La dimensione delle particelle e il potenziale zeta sono analizzati mediante dynamic light scattering e light scattering elettroforetico, rispettivamente, con un analizzatore di particelle indicato nella Lista dei Materiali.
- Impostare i seguenti parametri per la misurazione delle dimensioni delle particelle: i tempi di accumulazione: 70; Tempi di ripetizione: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto.
- Diluire il campione di SDF-1α-DS-CS con acqua (diluizione 10 volte). Caricare 100 microlitri del campione ad una cuvetta UV monouso come una cuvetta Eppendorf. Inserire la cuvetta nel supporto cella. Attendere che la regolazione dell'intensità di raggiungere "Optimum" (~ 10.000 cps). Avviare acquisizione dati.
- Dopo la misurazione è completata, registrare i risultati cumulanti di diametro (nm) e l'indice di polidispersità. Media dei risultati ottenuti da ciascuna delle 4 letture ripetute e calcolare la deviazione standard.
- Carico 500 ml di 10 volte diluito campione di particelle ad una cella di flusso per la misura potenziale zeta. Impostare i seguenti parametri per la misurazione: i tempi di accumulazione: 10; Ripetere volte: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto. Registrare i risultati del potenziale zeta (mV). Media la risultato di ciascuna delle 5 letture ripetute, e calcolare la deviatio serien.
3. Quantificazione di SDF-1α nelle particelle
- Diluire forma libera SDF-1α a concentrazioni di 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml in tampone 1.3x Laemmli. Diluire 6 microlitri campioni SDF-1α-DS-CS con 40 microlitri 1.3x tampone Laemmli. (Preparare 4x Laemmli scorta contenente 0,25 M Tris-HCl, pH 7.5, 8% SDS, 40% glicerolo, 0,05 mg / ml bromofenolo blu, e l'8% 2-mercaptoetanolo. Dividere la soluzione di riserva in piccole aliquote e tenere a -20 ° C per uso singolo.)
- Riscaldare i campioni a 100 ° C per 10 min. Vortex campioni due volte (ciascuno per 10 sec a velocità massima) durante il tempo di riscaldamento 10 min per dissociare completamente le particelle. Raffreddare i campioni a RT per 2 min. Centrifugare a 10.000 xg per 0,5-1 minuti per abbattere la condensa dell'acqua. Nuovo Vortex per mescolare bene.
Nota: A questo punto, la soluzione del campione deve essere chiaro senza alcun precipitato visibile presente. - Load 10 &# 181; l campione / bene ad un gel SDS 4-20%. Eseguire elettroforesi a 200 V per 20 min. Colorare il gel con Coomassie macchia proteine blu.
- Esaminare la densità di banda della proteina di SDF-1α con un imager e analisi densitometria software molecolare. Calcolare la quantità di SDF-1α nelle particelle contro una curva standard costruita con connessione standard SDF-1α.
4. In Vitro saggio di rilascio
- Mescolare particelle glycan SDF-1α con tampone fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio (D-PBS) in un rapporto 1: 1 (v / v).
- Dividere la sospensione di particelle in 0,05 ml aliquote in provette da 1,5 ml. Caricare i campioni al fondo delle provette. Evitare l'introduzione di bolle d'aria o disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore dei tubi con Parafilm.
NOTA: In tal modo, il liquido rimane sul fondo durante la successiva rotazione top-to-bottom del mixer tubo. - Ruotare i tubi a 37 &# 176; C su un rotante Mixer Micro-Tube. Rimuovere aliquote dai tubi ai tempi indicati e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
- Separare i supernatanti e pellet, e ricostituire il pellet con 0,05 ml di D-PBS. Conservare i campioni a -20 ° C. Dopo che tutti i campioni sono raccolti, esaminare i supernatanti e pellet su un gel SDS come descritto sopra.
5. Migration Assay
Questo test misura l'attività chemiotattica di SDF-1α. Interazione di SDF-1α con il suo recettore (CXCR4) sulla superficie cellulare provoca la migrazione della cellula verso il gradiente SDF-1α. In questo test, le cellule vengono caricati in un pozzo superiore (separati da una membrana semipermeabile da una minore ben) Soluzione e SDF-1α in un minor bene.
- Diluire SDF-1α (libero o di particelle-bound form) con tampone di migrazione (media RPMI-1640 contenente 0,5% di albumina sierica bovina) in un 3-fodiluizione in serie ld a concentrazioni finali di 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml.
- Aggiungere 0,6 ml della soluzione di SDF-1α diluito o tampone di migrazione solo (controllo negativo) per un pozzo nella piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 0,57 ml di tampone di migrazione a un pozzo (controllo cella di input). Incubare a 37 ° C per 30 min. Inserire un permeabile inserto coltura cellulare come Transwell (dimensione dei pori 5 micron, Ø 6,5 mm) sulla parte superiore del pozzo inferiore. Carico 0,1 ml cellule Jurkat (5 × 10 5) nella Transwell inserire. Caricare 0,03 ml cellule direttamente al controllo cella di input bene. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 ore in un incubatore CO 2 5%.
- Rimuovere gli inserti Transwell. Trasferire le cellule che sono emigrati ai pozzetti inferiori ad una provetta di polistirene 4 ml. Contare le cellule migrate con citometro di flusso.
- Calcolare la migrazione come percentuale del numero di cella di input (numero di cellule nel controllo cella di input ben x 100/30) dopo la sottrazione dei numeri in negative controlli (cellule migrate nei pozzetti contenenti solo buffer di migrazione).
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Representative Results
La dimensione e il potenziale zeta delle particelle preparate SDF-1α-DS-CS sono determinate con un analizzatore di particelle. La Figura 1 mostra l'analisi della misura di formato. Dai risultati ottenuti cumulanti quattro misurazioni ripetute, il diametro medio delle particelle idrodinamico SDF-1α-DS-CS è 661 ± 8.2 (nm) e la polidispersità è 0.23 ± 0.02. Il risultato della misurazione potenziale zeta è mostrato in Figura 2. Dalle cinque misurazioni ripetute, il potenziale zeta delle particelle SDF-1α-DS-CS è -24.8 ± 0,5 mV. Come accennato in precedenza, la presenza di 5% di mannitolo in sospensione particelle SDF-1α-DS-CS è essenziale per la prevenzione di aggregazione delle particelle durante un processo di congelamento e scongelamento. La Figura 3 mostra la misura dimensioni delle particelle sospese in acqua e congelati a -80 ° C. Un picco di aggregazione distinto sia visibile dopo lo scongelamento.
La amount di SDF-1α nelle particelle SDF-1α-DS-CS è stimato da elettroforesi su gel SDS. La figura 4A mostra un Coomassie blu macchiato gel SDS agli standard SDF-1α, DS-CS nanoparticelle (particelle di controllo senza incorporazione SDF-1α , Ctrl NP) e SDF-1α-DS-CS nanoparticelle (SDF-1α NP) campioni caricati. Una curva standard è costruito dall'analisi densità delle bande standard SDF-1α (Figura 4B). Calcolo della curva standard indica che la concentrazione SDF-1α nel campione SDF-1α NP è 0,03 mg / ml (media del duplicato). Poiché la diluizione del campione con il tampone è (6 + 40) / 6, la concentrazione del campione originale è 0,23 mg / ml. Poiché il volume finale della preparazione delle particelle è di 0,2 ml, totale SDF-1α nella sospensione finale è 0,046 mg. Considerando la massa di ingresso di SDF-1α nella miscela di reazione è di 0,08 mg, l'efficienza di intrappolamento di SDF-1α nelle particelle DS-CS è 57%. ChitOsan è stato precedentemente riportato di macchiare con Coomassie blu. La colorazione, tuttavia, non è significativo nel gel mostrato in Figura 4A. È, forse, legato alla quantità di chitosano (matrice particella) caricato sul gel. In ogni caso, una completa dissociazione e la separazione di SDF-1α dalla matrice di particelle sia necessaria per valutare con precisione la quantità della proteina incorporata. Questo gel mostra anche che SDF-1α non è rilevabile degradata mediante riscaldamento a 100 ° C per 10 min o dal processo vortice, come bande si trovano tra la banda proteica SDF-1α e il fronte del colorante.
Il tasso in vitro rilascio di SDF-1α dalle nanoparticelle è determinato mediante incubazione delle particelle nel 50% D-PBS a 37 ° C per 7 giorni. A 0 ore, 3 ore, 8 ore, 24 ore, 48 ore, e 7 giorni, aliquote dei campioni vengono rimossi e immediatamente centrifugato. Il SDF-1α rilasciato (nel supernatante) viene separato dal SD legati alle particelleF-1α (pellet). I campioni vengono analizzati su un gel SDS, e la quantità di SDF-1α nei supernatanti e pellet sono determinate dalla colorazione Coomassie e analisi densitometria. Un tipico gel SDS dell'analisi è mostrato in Figura 5. Come dimostrato, la particella vincolato SDF-1α è minimamente rilasciato dopo 7 giorni di incubazione.
L'attività della particella-bound SDF-1α viene misurata mediante un saggio di migrazione (dosaggio chemiotattica), e rispetto a quella di connessione SDF-1α. In questo saggio, SDF-1α nelle nanoparticelle DS-CS è serialmente diluito con un buffer di migrazione, e incubate con cellule Jurkat per 2 ore. Le cellule migrate sono contati con un citometro di flusso. I dati (con concentrazioni SDF-1α di 0,05-11 ng / ml) sono tracciate con una regressione non lineare montaggio, e l'EC 50 viene calcolato. Come mostrato in figura 6, la particella-bound SDF-1α indotta nella stessa misura della migrazione come quello della libera SDF-1 ^5; a tutte le concentrazioni misurate. I valori di EC 50 delle forme libere e legate a particelle di SDF-1α sono 0,55 e 0,45 ng / ml, rispettivamente.
Figura 1. schermata Analisi colpo mostrando misura per la dispersione della luce dinamica della dimensione delle particelle. I primi due pannelli mostrano le trame della funzione di autocorrelazione, G2 (τ), e logaritmo [G2 (τ) -1] nel corso del tempo. Processore di segnale digitale dello strumento (correlatore) esprime l'intensità della luce rilevata in funzione del tempo di ritardo (τ). Il grafico mostra che le particelle SDF-1α-DS-CS provocato un decadimento esponenziale dell'intensità tra 0,2-2 msec. Per ottenere la costante di decadimento medio <Γ>
Figura 2. schermata Analisi colpo mostrando light scattering elettroforeticomisura del potenziale zeta di particelle. Il pannello superiore mostra un G2 (τ) nel tempo plot. La funzione oscillante gradualmente decadimento è tipicamente osservata in particelle cariche che sono sottoposti a elettroforesi e diffusione della luce. La funzione riflette lo spostamento di frequenza (Doppler) causata dalle particelle in movimento nel campo elettrico. Una trasformazione di Fourier di G2 (τ) fornisce lo spettro di potenza (intensità vs. plot frequenza) mostrato nel pannello centrale. Il centro del picco spostamento di frequenza definisce la mobilità delle particelle, quali viene calcolato il potenziale zeta. Il potenziale zeta calcolato viene mostrato nella parte inferiore dello schermo.
Figura 3. particelle misura di formato di SDF-1 particelle α-DS-CS dopo il congelamento e scongelamento in acqua. In assenza di mannitolo, le particelle formano aggregates dopo il congelamento e lo scongelamento. Nota la formazione di un ulteriore intensità / picco dimensioni e l'aumento cumulanti diametro e polidispersità rispetto a quella di figura 1.
Figura 4. Quantificazione di SDF-1 α incorporazione in nanoparticelle DS-CS. (A) Fotografia di gel SDS Coomassie tinto caricata con connessione standard SDF-1α, DS-CS nanoparticelle (Ctrl NP), e SDF-1α-DS- CS nanoparticelle (SDF-1α NP) campioni come indicato. Le bande proteiche SDF-1α e il gel in esecuzione tintura anteriore sono contrassegnati. I campioni Ctrl NP non sono colorate con Coomassie blu e le bande chitosano (larghezza) sono vagamente visibile. (B) Le bande vengono analizzati con un densitometro, da cui la curva standard è costruito con gli standard SDF-1α gratuitamente (media di Duplicate). La quantità di SDF-1α nelle nanoparticelle è calcolato contro la curva standard, che dà un valore medio di 0,3 mg / pozzetto (10 microlitri).
Figura 5. SDS gel mostrando SDF-1 α in vitro corso tempo di rilascio. Coomassie macchiato gel SDS mostra la quantità di rilasciato SDF-1α (in surnatanti) e legato SDF-1α (in pellets), dopo incubazione di SDF-1α-DS nanoparticelle -cs a 37 ° C per diversi periodi di tempo. Re-stampata con il permesso di 9.
Figura 6. curve dose-risposta di SDF-1 α (cerchi) e SDF-1α nanoparticelle (NP) (quadrati) in un saggio di migrazione delle cellule Jurkat. SDF-1α sia libera e nanoparticelle direttems esposto la stessa attività con valori di EC 50 di 0,55 e 0,45 ng / ml, rispettivamente. Re-stampata con il permesso di 9.
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Discussion
Come accennato in precedenza, le nanoparticelle DS-CS sono formati attraverso la neutralizzazione di carica tra polianione (DS) e policatione (CS) molecole. Poiché l'interazione di carica avviene facilmente durante la collisione molecolare, la concentrazione delle soluzioni polimeriche e la velocità di agitazione durante la miscelazione è critica per la dimensione delle particelle risultanti. Una tendenza generale è che più diluita DS e CS soluzioni 15 e superiori risultato velocità di agitazione in particelle più piccole.
La formulazione delle nanoparticelle glycan SDF-1α può essere variata. Ad esempio, gli importi ei rapporti di SDF-1α / DS / CS utilizzati in questo protocollo sono 0,08 / 0,33 / 1 (mg / mg / mg), rispettivamente. A seconda della destinazione d'uso nanoparticelle SDF-1α, questi rapporti possono cambiare. Se la quantità di SDF-1α aggiunto alla miscela è 0,04 mg (0,04 / 0,33 / 1, mg / mg / mg) invece di 0,08 mg, le particelle sarà minore, ~ 650 nm, e l'SDF-1α efficienza intrappolamento leggermente greater, 70-80% 9. Tuttavia, quando consegnato in vivo, una maggiore quantità di matrice glycan sarà presente a SDF-1α. Se una granulometria inferiore è desiderato, la formulazione di nanoparticelle glycan SDF-1α può essere ulteriormente modificato. Una alternativa è quella di utilizzare un chitosano piccolo peso molecolare, come dimostrato in 15 Ref. Va notato, tuttavia, che il chitosano ha un'alta affinità per endotossina (carica negativa lipopolisaccaridi); pertanto, una prova di livello endotossina o potenzialmente una purificazione è necessaria per l'uso dei prodotti chitosano prima della consegna in vivo. La seconda alternativa è quella di caricare SDF-1α su pre-formate piccole nanoparticelle DS-CS. Poiché quest'ultima può essere manipolato più facilmente in granulometria e SDF-1α ha un'alta affinità per DS, il caricamento di una piccola quantità di SDF-1α al guscio esterno delle particelle DS-CS può risultare in particelle più piccole.
Rispetto ad altri tipi dinanoparticelle (ad esempio, 11 PLGA, polianidride 12, 13 o gelatina nanoparticelle), le nanoparticelle DS-CS presentano particolari vantaggi e limitazioni. I principali vantaggi delle nanoparticelle DS-CS sono: 1) la preparazione di particelle non comporta solventi organici o sonicazione vigorosa. È, quindi, adatto per il fattore proteine incorporazione, come preparazione dolce riduce la probabilità di inattivazione della proteina; 2) la matrice delle particelle ha una proprietà strutturale simile a matrice extracellulare, che rende le particelle compatibili con l'ambiente e il tessuto è meno tossica e infiammatoria; e 3) glycan imita SDF-1α legate a particelle di un rapporto di legame naturale tra la proteina e la matrice extracellulare, che spiega la piena attività chemiotattica di SDF-1α dopo essere stati incorporati in particelle glycan. Il pienamente attivo SDF-1α sotto forma di particelle legata permette di servire come un fattore homing stazionaria nel tessuto environment. Le limitazioni delle nanoparticelle DS-CS sono: 1) i diametri delle particelle sono generalmente superiori ai particelle suddetti; e 2) crollare facilmente in soluzioni saline, che potrebbero non essere adatti per l'iniezione diretta in circolazione del sangue.
L'SDF-1α particelle legato si trova ad essere minimamente liberato dalle nanoparticelle dopo una sette giorni di incubazione. Questo fenomeno è legato alla elevata affinità di SDF-1α per eparina, che contribuisce anche alla sua funzione in vivo. Poiché le proteine con eparina domini di legame in genere hanno diverse affinità per l'eparina, i loro tassi di rilascio probabilmente diverso. Ad esempio, in un VEGF 165 -DS-CS nanoparticelle preparato in una formulazione analoga, 44% del VEGF incorporato 165 è stato rilasciato nella prima ora e 29% è stato rilasciato nel successivo 47 hr durante l'incubazione a 37 ° C 14. Pertanto, il modello di rilascio in vitro per una specifica protein deve essere testato singolarmente.
Lo scopo di preparazione delle nanoparticelle SDF-1α-DS-CS è quello di consegnare SDF-1α al polmone e stabilire un segnale homing delle cellule staminali nel tessuto. Le particelle possono anche essere consegnate ad altri tessuti per lo stesso scopo, anche se il formato specifico nanoparticella non è richiesta per l'iniezione tessuto solido. Il fatto che SDF-1α è stabilizzata da DS nella matrice nanoparticelle ed è minimamente liberato dalle particelle supporta staminali principi reclutamento di cellule, e la particella dovrebbe essere utile per la rigenerazione tissutale.
Poiché le nanoparticelle proteina-glicani hanno una matrice simile a quella di glicosaminoglicani superficie cellulare e matrice extracellulare, è possibile che le proteine particelle incorporate possa essere scambiati in queste matrici (Le molecole della matrice extracellulare carica negativa possono competere con il legame del positivamente proteine carica) in vivo l'iniziale caratterizzazione vitro.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH: HL671795, HL048743, e HL108630.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran sulfate | Fisher | BP1585-100 | |
| Chitosan, low molecular weight | Sigma | 448869 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | 204986 | |
| D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
| UltraPure water | Invitrogen | 10977-023 | |
| SDF-1α | Prepared according to reference 8. | ||
| Syringe filter, PES membrane 0.22 μm | Millipore | SLGP033RS | |
| Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm) | Fisher | 14-513-63 | |
| Glass vial Kit; SUN-SRi | Fisher | 14-823-182 | |
| Delsa Nano C Particle Analyzer | Backman Coulter | ||
| Eppendorf UVette Cuvets | Eppendorf | 952010069 | |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-Rad | 456-1096 | |
| GelCode Blue Safe Protein Stain | Fisher | PI-24592 | |
| Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System | BioRad | 170-8640 | |
| Corning Transwell Permeable Supports | Corning | 3421 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | |
| Pyrogent plus kit | Fisher | NC9753738 |
References
- Delair, T. Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules. Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).
- Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles. Pharmacol Rev. 64 (3), 505-519 (2012).
- Yue, Z. G., et al. Surface charge affects cellular uptake and intracellular trafficking of chitosan-based nanoparticles. Biomacromolecules. 12 (7), 2440-2446 (2011).
- Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction. Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).
- Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow. Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).
- Sadir, R., Baleux, F., Grosdidier, A., Imberty, A., Lortat-Jacob, H.
- Amara, A., et al. Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine. J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).
- Sadir, R., Imberty, A., Baleux, F., Lortat-Jacob, H. Heparan sulfate/heparin oligosaccharides protect stromal cell-derived factor-1 (SDF-1)/CXCL12 against proteolysis induced by CD26/dipeptidyl peptidase IV. J Biol Chem. 279 (42), 43854-43860 (1074).
- Yin, T., et al. SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats. Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).
- Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor. Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).
- McCall, R. L., Sirianni, R. W. PLGA nanoparticles formed by single- or double-emulsion with vitamin E-TPGS. J Vis Exp. (82), 51015 (2013).
- Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles. J Vis Exp. (65), 3967 (2012).
- Xu, J., Amiji, M. Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles. J Vis Exp. (59), e3612 (2012).
- Lauten, E. H., et al. Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung. Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).
- Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes. Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).
