Introduction
Disiplin farmakologi har brukt den isolerte vevbad system i over 150 år. Allsidigheten av dette systemet har tillatt forskere over hele verden for å karakterisere reseptorer og reseptor-signaltransduksjon, med denne kunnskapen som danner grunnlaget for terapier som er behandlet millioner av personer med sykdommer eller forstyrrelser, slik som hypertensjon, hjertesvikt, diabetes, gastrointestinal sykdom, blære dysfunksjon, astma, og svelgevansker, for å nevne noen få. Til denne dag, forblir isolert vevbad en viktig fasett av narkotika utvikling og grunnleggende forskning, som det lar vev for å fungere som en vev. I denne Jove leksjon, er en formell protokoll delt å demonstrere en visuell og virtuell eksperiment utnytte data fra en isolert vev bad eksperiment som måler isometrisk kontraksjon, som tillater reseptor karakterisering.
Den primære fordelen med denne teknikken er at vevet er levende etnd fungerer som en helhet vev, med en fysiologisk utfall (kontraksjon eller avslapping) som er relevant for kroppen. Det er en syntese av trinnene (medikament-reseptor interaksjon, signaltransduksjon, andre messenger generasjon, endring i glatt muskulatur oppstemthet, og endring i vev funksjon). Selv om andre teknikker tillater undersøkelse av hver av disse trinnene (f.eks radioligandbinding for medikament affinitet, måling av andre budbringere), lar det isolerte vev-bad teknikk for integrering av alle disse trinnene 1. En annen fordel er at holde vev funksjon tillater beregning av viktige farmakologiske variabler som er mer meningsfylt i et vev vs et cellulært miljø; det kommer nærmere hvordan legemidler undersøkt ville fungere i kroppen som en helhet.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer som er beskrevet i denne artikkelen er utført i henhold til retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) fra Michigan State University.
1. System Klargjøring og oppsett
- Gjør 5 l av en fysiologisk saltløsning (PSS), som er den mengde som er nødvendig for en vevsbadet sammentrekning eksperiment som bruker opp til 50 ml vevsbad; se tabell 2 for PSS oppskrift. Beregn totalt nødvendige volumet ved å multiplisere antall vevsbad ganger badekaret volum og deretter multiplisere med antallet nødvendige vev vasker.
- Bruk tabell 2 som en guide til å gjøre PSS. Oppløse salter i ca 4 liter vann. MERK: HPLC - Type I vann anbefales
- Tilsett 8 ml 1 M CaCl2-oppløsning (147 g / l ved bruk av dihydrat-salt) til oppløsningen, slik at sluttløsningen er 1,6 mM kalsium.
- Quantum sufficit PSS løsning på 5 L.
- Forvarm vevsbadet systemet til 37 ° C ved å slå på den resirkulerende oppvarmet vannbad. Kritisk trinn: Hver komponent i systemet er vannkappe, slik at de er koblet i serie til hverandre. Strømningsretningen er kritisk - at vann strømmer inn i hver komponent ved den laveste pigg forbindelse og ut ved det høyeste pigg forbindelse.
- Slå på datainnsamling system. Makt på krafttransdusere minst 15 minutter før eksperimentet skal stabilisere temperaturen.
MERK: De fleste krafttransdusere ansette strekklapper som er følsomme for variasjoner i temperatur og utviser termisk drift i første omgang etter at strømmen slås på. - Lanseringen datainnsamling programvare og sikre forbindelse med datainnsamling system. Følg produserer instruksjoner for å aktivere dataopptak.
- Kontroller at krafttransdusere er kalibrert før vevet er plassert i vevsbadet og før data innspillingen har startet; follow produsentens instruksjoner for kalibrering.
- Koble vevsbadet systemet til en 95% O2 / 5% CO 2 medisinsk kvalitet gassflaske og sjekk for gasslekkasjer, og deretter trykksette systemet.
- Fyll vevsbadet reservoarer med PSS og la løsningen tid for å oppnå optimalt resultat. Prime systemet og fjerne eventuelle luftbobler i systemet og slangen.
- Kontroller vevbad luftere for å sikre jevn oppløsning lufting, noe som oxygenates PSS buffer og gir Brownske bevegelser for å fordele legemidler som vil bli innført i vevbadet i løpet av eksperimentet. Sørge for lufting / bobler ikke forårsaker vev bevegelse, noe som vil forstyrre dataopptak; redusere gasstrømmen som er nødvendig.
MERK: vevsbadet og datainnsamling system er nå klar til å starte eksperimentet.
2. Vevspreoarerlng
- Ideelt dissekere vev fra dyr umiddelbart før bruk og plassere direkte into PSS.
MERK: Noen vev kan lagres i PSS natten ved 4 ° C, men hensiktsmessige kontroller må gjøres for å validere vev funksjon etter langvarig lagring; se kapittel 6. - Bruk thorakalaorta som vevet i denne øvelsen.
- Bedøve rotte i henhold til institusjonelle retningslinjer og plasser rotte ryggsiden ned. Bekreft anesthetization via en tå-pinch og tap av refleks respons på denne smertefulle stimuli.
MERK: Denne protokollen bruker 70 mg / kg av pentobarbital levert via en intraperitoneal injeksjon. Institusjonelle retningslinjer for gnager anestesi kan avvike. - Opprette en pneumothorax ved å skape et snitt med en saks langs membranen ved bunnen av brystkassen. Deretter fortsetter snittet fra bunnen av brystkasse til sternum og gjennomskjære.
- Dissekere bort eller legge til side de organer som er på toppen av ryggsøylen og finn aorta, som ligger direkte langs ryggsøylen.
MERK: Dette step gir en klar arbeids plass å dissekere ut aorta. - Bryte alle forbindelser til aorta; fra spiserør, lunge, etc. og kuttet aorta vinkelrett på ryggraden ved nivået av membranen.
- Hold forsiktig aorta med pinsett og bruke saks til å dissekere aorta fra ryggraden. Start disseksjon i nedre membran område som grenser til ryggraden og arbeid mot hjertet. Sørg for å ta ekstra forholdsregler for å ikke trekke eller slepebåt på aortavev, noe som kan skade vevet.
- Umiddelbart plassere aorta i den utarbeidede disseksjon fatet inneholder PSS.
MERK: Dissection av aorta i ringer gjøres best i en dissekere rett som har en svart silastisk fundament. Dette åpner for bruk av ledninger som kan brukes til å cannulate aorta og festes til parabolen, og gir stabilitet mens i disseksjon parabolen. Svart bakgrunn gir kontrast som hjelpemidler disseksjon. Forsiktighet bør tas i bruk av kanylerør ledninger som endotelial cellelaget kan fjernes med et overskudd av gnidning av ledningen mot hulrommet i beholderen. - Ta en wire og en liten 90 ° vinkel i den ene enden, og skyv den vinklede enden inn i silastic grunnlag for å forankre guidekabelen. Plassere hele aorta i disseksjon parabolen.
- Hold enden av føringstråd med pinsett og deretter forsiktig træ tråden inn i lumen av aorta.
- Bruk pinsett og skyv aorta på ledningen. Når den frie enden av guidekabel er synlig, kurve ledningen forsiktig og plasser den frie enden inn i silastic grunnlaget for retten til å stabilisere vev.
- Ved hjelp av små Vännäs saks og pinsett, fjerner perivaskulær fettvev og alle andre utenforliggende vev, blodpropper, etc. inntil thorakalaorta er hvit og litt fiber.
- Fjern den rengjorte aorta fra wire og bruke saks til å klippe aorta i ringene som er ca 3-5 mm i bredden.
- Plassere en aorta-ring på en av et par av tissue kroker ved å holde kroken og bruke pinsett for å skyve ringen på kroken forsiktig. Gjenta denne prosessen med den andre kroken. Pass på krokene ikke floke; se figur 3.
- Sjekk at hver krok har en annen silke sutur vedlagt. Kontroller at en krok har en liten knyttede løkke av silke som gjør det mulig for feste til en glass- eller rustfri stålstang, mens den andre er en 10-4 cm langt stykke sutur som vil være hånd bundet til styrken transduseren; se figur 3.
MERK: Når aorta er festet til krokene er vevet klar til å bli montert i vevsbadet; se figur 3. - Gjenta trinn 2,14 til 2,15, for å montere en andre aorta ring i den andre vev-bad kammer.
3. Tissue Plassering i Bath
- Legg merke til at i dette system, vevsbad selv er stillestående. På denne tiden, fylle vevsbad med varmet, luftet PSS og la løsningen å komme til temperature.
- Med silkesutur, binde en av krokene på vevspreparat til tappen på den rustfrie stålstaven. Plasser denne enden i vevsbadet kammeret. Koble stangen til en ring stå og plasser den andre enden i farging tallerken fylt med PSS å holde vev nedsenket i buffer; se figur 3.
- Plassere stangen og vev i vevsbadet kammeret og sørge for at vevet er fullstendig oppslukt i PSS og stangen er sikkert; se figur 3.
- Bind den andre sutur til krafttransduktor og sørg for å forlate slakk i sutur mellom vev og krafttransduktor.
MERK: Dette slakk vil bli fjernet ved å justere mikrometer; se figur 3.
- Gjenta disse trinnene for den andre aorta ring og vev bad kammeret.
4. Innstilling Passiv Tension
MERK: Hver vev har en lengde (Lo) hvor glatte muskelceller svare optimally. Foreløpige eksperimenter for å bestemme den optimale strekket som oppnår denne lengde må gjøres for hver enkelt type vev som skal undersøkes. Rotte torakal aorta har en optimal passiv strekket på 4 g.
- Bruk mikrometer / tannstang for å øke spenningen til 2 g og vente på vev for å nå platå. Når platå er nådd, øke spenningen ytterligere 2 g og vente på vevet til platået.
MERK: I Aortaringene, etter den første spenning på 2 g har satt og platå nådd, vevet bør deretter slappe av til ~ 1,6 g. En annen anvendelse av 2 g ville bringe vevet til ~ 3,6 g, hvorfra vevet igjen vil slappe av og spenningen vil avta. Således, etter å ha tilsatt 4 g total spenning, må programvaren indikere omtrent 3,2 g strekk. - Gjenta disse trinnene for den andre aorta ring og vev bad kammeret.
5. Ekvilibrering and Drug Making
- Balanser vev for60 minutter etter bruk av passiv spenning til vevet.
- Under likevektsfasen, vaskes vevet hver 15-20 min. Drenere vev bad og erstatte PSS med PSS fra en varmet reservoaret.
MERK: I løpet av denne tiden, vil vevet slappe av, noe som vises ved tap av passiv spenning. - I løpet av denne tiden, fremstille medikamenter for eksperimentet, som må være minst 1000 ganger mer konsentrert enn den faktiske konsentrasjon i badet, slik at bare et lite volum av medikament-lageret som er nødvendig for å oppnå den ønskede konsentrasjon.
6. Oppstarts Challenge
- Ved slutten av ekvilibreringsperiode, vaskes vevet en endelig tid, lagre data, og re-null alle innganger.
- Plukk en agonist (forbindelse som vil føre til aktiv kontraksjon) som reagerer vev.
MERK: I rotte thorakalaorta, den arterielle glatte muskler vil aktivt kontrakt til en alfa adrenerge reseptorer agonist på grunn av innervasjon avvev av det sympatiske nervesystemet. Adrenerg agonist ville være nyttig i tarmvevet gitt som adrenerge agonister forårsake avslapning. I dette tilfellet er en reseptor-agonist, slik som acetylkolin (kolinergisk reseptor) kan brukes. Et alternativ til både fenylefrin og acetylkolin er å bruke en ikke-reseptor-agonist, for eksempel høyt kalium (K) som den første utfordring. I glatt muskulatur, opererer med høy K til indirekte åpen kalsiumkanaler, og dermed blir sett på som en generell indeks av glatt muskulatur integritet.- Utføre den første utfordringen eller vekking utfordringen ved å legge til 10 -5 M fenylefrin til vevsbadet. For å oppnå denne konsentrasjon i 50 ml vevbad, tilsett 50 pl av en 10 -2 M fenylefrin løsning.
MERK: 50 ul til 50 ml av PSS er en 1 / 1.000 fortynning, slik at sluttkonsentrasjonen er mindre enn 1,000x lager, eller 10 -5 M. Kjennskap til volum og konsistent vedlikehold av volumet i vevsbadet chamber er kritisk for å bestemme den endelige medikamentkonsentrasjon.
- Utføre den første utfordringen eller vekking utfordringen ved å legge til 10 -5 M fenylefrin til vevsbadet. For å oppnå denne konsentrasjon i 50 ml vevbad, tilsett 50 pl av en 10 -2 M fenylefrin løsning.
- Tilsett 10 -5 M fenylefrin til vevsbadet og tillater sammentrekning til topp og deretter platå, da skråningen av data blir null. Sørg for å registrere hver eksperimentell begivenhet for å hjelpe post-eksperimentell analyse.
- Etter platå, vaske agonist ut grundig ved tømming og påfylling vevsbadet kammer med ny PSS. Sørg for å registrere disse hendelsene også.
MERK: En tommelfingerregel er at konsentrasjonen av agonist i badet er redusert 10 ganger med hver vask. Selv om det kan mer enn 3-4 vaskinger er nødvendig for å bringe vevet tilbake til sitt likevektsreferansesignal (spenning). - La vevet resten ved baseline tone for ~ 10 min før du fortsetter.
7. Eksperimenter
MERK: Prazosin, en alfa-adrenerg reseptor-antagonist, vil bli introdusert til vevsbadet kammeret for å skifte konsentrasjonen response kurve til fenylefrin (PE); Dette er en påviselig antagonisme.
- Til ett bad, legge til kjøretøyet (H 2 O) der prazosin ble oppløst. Til en annen, tilsett passende konsentrasjon av prazosin. I dette tilfellet, tilsett 25 pl av kjøretøyet til ett bad og 25 pl 10 -5 M konsentrasjon av prazosin til den andre for å oppnå en 5 x 10 -9 M eller en 5 nM konsentrasjon i badet.
MERK: Mens tilsetningen av kjøretøyet synes unødvendig i dette eksempel, er det viktig å gjøre dette ved bruk av andre kjøretøyer som har et potensial til å være vasoaktive (for eksempel DMSO, etanol, acetat). Legg den tilsvarende bilen selv om lite bevis finnes for at det skal være vasoaktivt. - Forlater kjøretøyet / prazosin i bad og ikke vaske vevet i 1 time.
- Mens vev er equilibrating, forberede flere konsentrasjoner av agonist (PE). Omfatter et bredt spekter av konsentrasjoner, fra konsentrasjoner å utløse noen reaksjon (for eksempel </ Em> 10 -9 M PE) for konsentrasjoner som overskrider den maksimale respons (f.eks 10 -4 M PE). Etter konsentrasjon-responskurvene er logaritmisk i naturen, få seks separate lagerløsninger av PE (10 -6 -10 -1 M) gjennom seriefortynninger fra 10 -1 M stamløsning. Kontroller at volumet som er nødvendig for hver konsentrasjon er litt større enn trippel det totale volumet som er nødvendig for alle bad (dvs.> 300 ul).
- Fortsett å tilsette agonist, som beskrevet i tabell 1.
MERK: Dette eksperimentet vil generere en kumulativ konsentrasjon responskurve til PE; hver iterasjon tar hensyn til mengden av stoffet som allerede er lagt inn i badekaret. Tilsetninger skje før de ikke lenger øker sammentrekningen, eller hele kurven har flatet ut.- Legg hver medikamentkonsentrasjon individuelt inntil vevet terskel er nådd.
- Hvis det oppstår ingen endring, legger neste konsentrasjonen iserien; se tabell 2.
MERK: Tidspunktet for disse tilleggene avhenger av agonist som brukes. For eksempel, noradrenalin og fenylefrin sammentrekning utvikler seg raskt, og bør platå i løpet av minutter. I motsetning til dette utvikler endotelin-1 sammentrekning langsomt og kan ikke platå for i nærheten av 45 min. Annen eksperimentering kan gjøres på vevet etter at byggingen av en kurve slik som dette, så lenge som (1) stoffet vasker ut; og (2) det kan påvises at vevet tilbake til normal kontraktile atferd og blir ikke påvirket av de tidligere stimuleringer.
8. Data Analysis
- Sørg for å lagre data umiddelbart før og etter en intervensjon (f.eks våkne opp eller full kurve).
- Finn og sette vevet grunnlinjen for hver vevsbadet kammer / inngangskanal, som skal hjelpe til med dataanalysen.
- Så snart grunnlinjen er angitt, finner den maksimale respons for hver konsentrasjon, og registrere change fra baseline. Sekvensielt beveger seg gjennom hver av konsentrasjonene og registrere grunnlinjeforskyvning.
- Tegne den resulterende data. Gjør dette i en graf program.
MERK: Graph Pad Prism er designet for pharmacologists, og dette er ideelt for den type eksperiment som presenteres her.
Representative Results
I form av agonisme, kan den relative effekt (E MAX) og styrke (EC 50) på en agonist i et gitt vev bli beregnet og sammenlignet med responsene fra andre agonister i samme vev 1. I våre forsøk ble rotten thorakalaorta inkubert med enten bærer eller α en adrenerg reseptorantagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsetning av α en adrenerg agonist fenylefrin til vevsbadet og generering av kontraksjon (figur 1).
Figur 2 presenterer endret resultatene av figur 1. De grønne responser har merket maksimal sammentrekning oppnås ved PE merket som maks, ½ maksimal sammentrekning merket som sådan, og deretter knyttet til PE konsentrasjon som forårsaket at respons. Identifisering av disse verdier er å identifisere den effektive konsentrasjon av en agonist som oppnår en halv maks (50%) respons eller EC
I generering og tolkning av disse resultater er det viktig å bruke både lave og høye konsentrasjoner av agonist for å skape konsentrasjon-responskurve. Uten nok poeng til å vise en stabil baseline og maksimal platå, kan EC 50 og E MAX bare estimeres. Dette ble gjort grafisk i dette eksempel. Dataprogram som bruker logistiske funksjoner for sigmoidale kurver kan brukes for kurvetilpasning og beregning av EC 50 verdier.
Fig. 1: Skjematisk vevsbadet tegneserie representerer en ring av vev plasseres i dobbeltveggen, vannkappe vev bath. Buffer innstrømning og utstrømning reguleres av en 3-veis stoppekran glass integrert i bunnen av kammeret. O 2 / CO 2 bobles inn gjennom en tut som er forseglet med en pakning for å hindre lekkasje av PSS eller gass. Resirkulasjon innspill er under produksjonen for å opprettholde forsvarlig resirkulering og hindre dannelse av luftlommer som ville føre til temperatur disregulation.
Figur 2:. Rat thorakalaorta + endotelet Figuren ovenfor viser fire separate eksperimenter (forskjellige dyr og gjort av ulike forskere på ulike sett ups som representert ved forskjellige farger) for å teste evnen til prazosin å skifte en PE-indusert sammentrekning. Prazosin (5 nM) klart skiftet PE-indusert sammentrekning kurve mot høyre i en parallell måte.
Figur 3: Rotte thorakalaorta + endotel grafisk estimering av EC 50-verdier for PE i fravær (bærer) og nærvær (prazosin) av antagonist.. Grønn linje (gruppe C) kun er merket.
| Salt | MW (g / mol) | 5 Liters | FINAL mM |
| (gram) | |||
| NaCl | 58.45 | 37.99 | 130 |
| KCl | 74,56 | 1,75 | 4.7 |
| KH2PO4 | 136,1 | 0.8 | 1.18 |
| MgSo4• 7H20 | 246,5 | 1,45 | 1.17 |
| NaHCO3 | 84.21 | 6,25 | 14.9 |
| Druesukker | 180,16 | 5 | 5.5 |
| EDTA | 380 | 0,05 | 0.03 |
Tabell 1: Normal fysiologisk saltløsning (PSS) Oppskrift Innholdet i bikarbonat-buffer PSS brukt i dette eksperimentet.. Inkludert er de molekylvekter for alle salter og mengden tilsatt til 5 liter dH 2 O for å oppnå den ønskede konsentrasjon.
| Konsentrasjon i badekaret | Tilsetting av agonist gjort til bad |
| 1 x 10 -9 M | 50 ml 1 x 10 -6 M |
| 3 x 10 -9 M | 100 ml 1 x 10-6 M |
| 1 x 10 -8 M | 35 ml 1 x 10 -5 M |
| 3 x 10 -8 M | 100 ml 1 x 10 -5 |
| 1 x 10 -7 M | 35 ml 1 x 10 -4 M |
| 3 x 10 -7 M | 100 ml 1 x 10 -4 M |
| 1 x 10 -6 M | 35 ml 1 x 10 -3 M |
| 3 x 10 -6 M | 100 ml 1 x 10 -3 M |
| 1 x 10 -5 M | 35 ml 1 x 10 -2 M |
| 3 x 10 -5 M | 100 ml 1 x 10 -2 M |
| 1 x 10 -4 M | 35 ml 1 x 10 -1 M |
Tabell 2:. Tissue Bath Additiv Agonist Konsentrasjoner Mengden av agonist som skal tilsettes til hvert bad til proPerly konstruere kumulative konsentrasjons-responskurvene. Den ønskede badkonsentrasjonen er oppnådd gjennom tilsetning av sekvensielle mengder av økende konsentrasjoner av agonist. Hver tilsetning tar hensyn til konsentrasjonen av agonist som allerede er tilstede i badet. Dette gjøres for å minimere økning i volum i vevsbadet som ville resultere fra å bruke økende volumer av en enkelt konsentrasjon av agonist.
Discussion
Måling av isometrisk kraft som et analyseverktøy er over 150 år gammel, men det fortsetter å være den prototypiske teknikk for reseptor karakterisering i kontraktile vev 2. Kraften av denne teknikk er i sin enkelhet og fleksibilitet: ved å registrere responser fremkalt av økende konsentrasjoner av en agonist i nærvær eller fravær av en antagonist, kan en myriade av informasjon utledes om de farmakologiske egenskapene av hvert medikament og reseptoren til hvilken det binder 3-5. Eksperimenter av denne typen også garner informasjon om konkurranse versus ikke-konkurrerende natur antagonister som brukes, samt reseptor heterogenitet og uspesifikke narkotika effekter 6-8. Således, med enkle permutasjoner til dette isolerte vev-bad eksperiment, en relativt fullstendig farmakologiske profilen til reseptorene som medierer agonist-indusert muskelkontraksjon kan genereres.
I form av agonisme, the relative effekten (E MAX) og styrke (EC 50) på en agonist i et gitt vev kan beregnes og sammenlignes med responser fra andre agonister i det samme vev 1. I våre forsøk ble rotten thorakalaorta inkubert med enten bærer eller α en adrenerg reseptorantagonist prazosin (5 nM) i en time før tilsetning av α en adrenerg agonist fenylefrin til vevsbadet og generering av sammentrekning. Figur 2 viser resultatene modifisert i figur 1. De grønne responser er merket med maksimal kontraksjon oppnås ved PE merket som max, markerte ½ maksimal sammentrekning som sådan og deretter knyttet til PE konsentrasjon som forårsaket at respons. Identifisering av disse verdier er å identifisere den effektive konsentrasjon av en agonist som oppnår en halv maks (50%) respons eller EC50 verdien.
Dessverre bruker agonist avhengig parameters alene for å bestemme reseptor-bindingsegenskaper kan være komplisert 9. Ideelt, men ytterligere forsøk under anvendelse av reseptorantagonister tillate beregning av to viktige parametre som er viktige for å definere interaksjon mellom et medikament og en reseptor: den -log 10 av antagonisten dissosiasjonskonstant (pK B) og -log 10 av den molare antagonist konsentrasjonen som er nødvendig for å fremkalle to ganger mot høyre skift i konsentrasjons-responskurve (pA 2) 10. Både K B og pA to forsterknings deres nytte av det faktum at de er agonist uavhengige verdier, og forblir konstant selv mellom forskjellige vev 11. Fra dataene i figur 2, kan pK b bli beregnet ved hjelp av følgende ligning og basert på EC 50 verdier beregnet annet sted:
EC 50 i fravær av prazosin = 2 x 10 -8 M
EC 50 i prefølelse av prazosin = 7 x 10 -6 M
Løse for K B i den følgende ligning:
log (dr-1) = log [B] - logg K B
Hvor:
[B] = antagonist-konsentrasjon, eller 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8,3
dr = dose forhold på EC 50 verdi i nærvær av antagonist / EC 50 i fravær. Hvis det er en høyrerettet forskyvning, vil denne verdien er større enn én. Dermed:
dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M eller 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350
Erstatter [B] og dr:
log (350-1) = -8 - logg K B
2.54 = -8 - logg KB
pK B = 10,54
Denne verdi for prazosin er i samsvar med verdiene oppnådd når prazosin samvirker med en α en adrenerg recepteller 12,13, noe som tyder på at den adrenerge reseptoren medierer kontraksjon til fenylefrin er α en adrenerg reseptor.
Flere trinn er avgjørende for å lykkes med disse eksperimentene. Vev må forbli i PSS etter disseksjon for å forhindre tap av vev levedyktighet. Enhver isometrisk muskel forberedelse har en optimal lengde-spenningsforhold som genererer maksimal kraft mot passiv spenning 14,15. For forsøket beskrevet i denne protokollen, ble optimal passiv spenning tidligere bestemt ved kort å legge trinn på 0,5 g passiv spenning til vevet. Vevstoffet bør begynne uten tone og deretter etter 30 minutter av likevekt, ble vevet utfordret med en maksimal konsentrasjon av KCl (80 mM), noe som ga aktive tone. Deretter ble vevet vasket og fikk returnere til basislinjen tone. Etter 15 minutter ved grunnlinjen, ble en annen 0,5 g passiv spenning plassert og denne prosessen gjentas inntil et platå avaktiv spenning ble oppnådd med ytterligere passiv spenning. I preliminære eksperimenter, ble 4 g totalt passiv spenning bestemmes for å oppnå maksimal aktiv spenning generasjon i aorta-ringer, og dermed denne totale mengde spenning legges på ringene før ekvilibrering. Prosedyremessig er det best å fokusere før passiv spenning program, men det kan gjøres når som helst før forsøket. Over-strekking vev, ved ethvert punkt i eksperimentet eller disseksjon, negativt vil påvirke vevs-levedyktighet og eksperimentelle resultater. Dette er mest viktig når du plasserer vev i badekaret, da dette trinnet har den høyeste sannsynligheten for overdreven strekk. Tilstrekkelig vasking, i antall og varighet kreves for reproduserbare effekter. En annen utfordring for tidlig etter en innledende utfordring, eller vev før har returnert til referansespenningen, vil resultere i avvikende respons. Hvis studere reversibel antagonister / hemmere, bør vev ikke vaskes før agonist tillegg, som inhibitor-konsentrasjonen vil bli redusert.
Det er bemerkelsesverdige fordeler og ulemper for de isolerte vev bade analyser.
Ulemper: Vev kan oppleve ulike grader av skade under kirurgisk fjerning eller plassering av ringene på kroker. Siden endotelceller er den indre fôr av aorta ring, må man være forsiktig på plassering av ringen på kroker for ikke å skade dette cellelaget. Vev kan også ha ulike lengder av tid som de er levedyktig i vevsbadet, og dette må fastsettes; ikke alle vev, er de samme. Langs disse linjene, kan vev endre i sin respons i løpet av dagen slik at tidskontroller blitt en nødvendig kontroll for hvert eksperiment. Et godt eksempel på dette er marsvintrakea som forbedrer i kontraktilitet maksimum ved 100% under et typisk 8 timers forsøket. Legemidler som er dårlig løselig i vann kan utløse ut i PSS. Endelig kumulative ennd ikke-kumulative tilsetninger av et medikament som er en agonist kunne resultere i forskjellige resultater hvis reseptor desensitivisering til agonisten oppstår; angiotensin II er et slikt medikament som viser raske tachyphylaxis.
Fordeler: En av de viktigste fordelene med vev bade eksperimenter er at det er sanntid; man kan se eksperimentet som den utfolder seg, og kan raskt gjøre konklusjoner og planlegge neste trinnene, samt feilsøke under et eksperiment. Et eksperiment tar en dag å gjøre. Flere vev kan vanligvis fremstilles fra ett dyr, slik at et dyr kan tjene som sin egen kontroll, og som tilfører styrke til et eksperiment. Man kan også isolere vev fra andre faktorer, slik som å teste en relativt ren reaksjon av vevet for medikamentet. In vitro-eksperimenter som vevsbadet systemet tillater også bruk av en liten mengde av stoffet, sammenlignet med en in vivo-eksperiment.
Den grunnleggende eksperimentelle konstruksjon som er beskrevet her kan bliomfattende modifisert for å gi rom for opptak av flere parametere eller innføring av andre eksterne stimuli. For eksempel, tilsetning av elektroder tillater elektrisk felt stimulering av nerver innervating 16,17. Med tillegg av termiske eller pH-sonder, kan virkningene av temperatur og pH på kontraktile responser også måles 18,19. På samme måte kan oksygen være substituert helt eller delvis med N2 for å evaluere hypoksi-induserte effekter. Videre kan de samme grunnleggende prinsipper for isometrisk måling kontraktilitet brukes i denne video bli brukt for å utvikle systemer som tillater samtidig måling av isometrisk spenning utvikling og forandringer i intracellulær kalsium-20. Signaltransduksjon blir også lett undersøkt, siden systemer finnes som kan hurtig fryse en vevsprøve ved en reaksjon, slik at aktiviteten til en signaltransduksjonsbane system kan verifiseres biokjemisk.
Variasjonen av utstyr;ipment som kan brukes til å gjøre dette er enorme. Hele dette systemet, enten hånd konstruert eller automatisert, kan kjøpes fra flere forskjellige selskaper. Vevbadene og vev holdere som brukes i denne protokollen var munnblåst (vevsbad) og hånd konstruert (innehavere) av en in-house Michigan State University maskin butikker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabChart Software | ADInstruments | 7.2 | |
| PowerLab (4 channel) | ADInstruments | ML760 | |
| QuadBridge (4 channel) | ADInstruments | ML112 | ML112 |
| Grass Adapter Cable | ADInstruments | MLAC11 | MLAC11 |
| Grass Force-displacement Transducer | Grass Instrument Co | FT03 | FT03 |
| Grass Transducer Cable | Grass Instrument Co | TAC-7 REV-1 | |
| BNC to BNC Cable | ADInstruments | MLAC01 | |
| IsoTemp 2100 | Fisher Scientific | IC-2100 | |
| Tissue Bath | Multiple Sources | ||
| Physiological Salt Solution | PSS | ||
| Braided Silk Suture | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Ring Stand | Humboldt MFG Co | H-2122 7 | |
| Dissecting Dishes | Handmade with Silicone | ||
| Tygon Tubing | VWR Scientific | 63010-100 | R-3603 |
| Hose Clamps | Cole-Parmer Instrument Co | 06832-08 | SNP-8 |
| 50 ml Muscle Bath | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| 250 ml Warming Chambers | Eberhartglass Blowing | Custom | |
| Gas Dispersion Tube | Ace Glass | 7202-06 | 7202-02 |
| Micrometer | |||
| Custom Stands | |||
| Three-prong Clamps | VWR International | Talon | |
| S-connector | VWR International | Talon | |
| Tissue Hooks | Hand Made in House | Custom | |
| Tissue Dissection | |||
| Leica Stereomicroscope MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscope Fiber-optic Light Source | Fisher Scientific | 12562-36 | 12562-36 |
| Culture Petri Dish | Pyrex | 7740 Glass | |
| Sylgard Silicone Elastomer | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
| Vannas Scissors | George Tiemann & Co | 160-150 | 160-150 |
| Splinter & Fixation Forceps | George Tiemann & Co | 160-55 | 160-55 |
References
- Kenakin, T. P. The classification of drugs and drug receptors in isolated tissues. Pharmacol. Rev. 36, 165-222 (1984).
- Scheindlin, S. A brief history of modern pharmacology. Modern Drug Discovery. 4, 87-88 (2001).
- Christopoulos, A., El-Fakahany, E. E. Qualitative and quantitative assessment of relative agonist efficacy. Biochem. Pharmacol. 58, 735-748 (1999).
- Arunlakshana, O., Schild, H. O. Some quantitative uses of drug antagonists. Br. J. Pharmacol. Chemother. 14, 48-58 (1959).
- Christopoulos, A., Kenakin, T. G. protein-coupled receptor allosterism and complexing. Pharmacol. Rev. 54, 323-374 (2002).
- Braverman, A. S., Kohn, I. J., Luthin, G. R., Ruggieri, M. R. Prejunctional M1 facilitory and M2 inhibitory muscarinic receptors mediate rat bladder contractility. Am. J. Physiol. 274, R517-523 (1998).
- Singh, J., et al. Immunoglobulins from scleroderma patients inhibit the muscarinic receptor activation in internal anal sphincter smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 297, G1206-1213 (2009).
- Goadsby, P. J., Adner, M., Edvinsson, L. Characterization of endothelin receptors in the cerebral vasculature and their lack of effect on spreading depression. J. Cereb. Blood Flow Metab. 16, 698-704 (1996).
- Colquhoun, D. Agonist-activated ion channels. Br. J. Pharmacol. 147, Suppl 1. S17-26 (2006).
- Wyllie, D. J., Chen, P. E. Taking the time to study competitive antagonism. Br. J. Pharmacol. 150, 541-551 (2007).
- Schild, H. O. pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. 1947. Br. J. Pharmacol. 120 (4), 29-46 (1997).
- Oshita, M., Kigoshi, S., Muramatsu, I. Pharmacological characterization of two distinct alpha 1-adrenoceptor subtypes in rabbit thoracic aorta. Br. J. Pharmacol. 108, 1071-1076 (1993).
- Hiraoka, Y., et al. Binding and functional characterization of alpha1-adrenoceptor subtypes in the rat prostate. Eur. J. Pharmacol. 366, 119-126 (1999).
- Cooke, P. H., Fay, F. S. Correlation between fiber length, ultrastructure, and the length-tension relationship of mammalian smooth muscle. J. Cell Biol. 52, 105-116 (1972).
- Davis, M. J., Gore, R. W. Length-tension relationship of vascular smooth muscle in single arterioles. Am. J. Physiol. 256, H630-H640 (1989).
- Davis, R. P., et al. One-month serotonin infusion results in a prolonged fall in blood pressure in the deoxycorticosterone acetate (DOCA) salt hypertensive rat. ACS Chem. Neurosci. 4, 141-148 (2013).
- Heppner, T. J., et al. Nerve-evoked purinergic signalling suppresses action potentials, Ca2+ flashes and contractility evoked by muscarinic receptor activation in mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 587, 5275-5288 (2009).
- Burdyga, T. V., Wray, S. On the mechanisms whereby temperature affects excitation-contraction coupling in smooth muscle. J. Gen. Physiol. 119, 93-104 (2002).
- Hyvelin, J. M., O'Connor, C., McLoughlin, P. Effect of changes in pH on wall tension in isolated rat pulmonary artery: role of the RhoA/Rho-kinase pathway. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 287, L673-L684 (2004).
- Tykocki, N. R., Thompson, J. M., Jackson, W. F., Watts, S. W. Ryanodine receptors are uncoupled from contraction in rat vena cava. Cell Calcium. 53, 112-119 (2013).
