Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udnyttelse af Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52335
Automatic Translation
*1, 1, *1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Introduction

I løbet af de sidste tredive år har positronemissionstomografi (PET) blevet et uundværligt klinisk redskab i diagnosticering og behandling af kræft. Antistoffer har længe været anset for lovende vektorer til levering af positron-emitterende radioisotoper til tumorer på grund af deres udsøgte affinitet og specificitet for kræft biomarkører. 1,2 dog den relativt langsomme in vivo farmakokinetik af antistoffer bemyndiger anvendelse af radioaktive isotoper med flere dages fysiske halveringstider. Denne kombination kan give høj strålingsdoser til de ikke-målorganer patientorganisationer, en vigtig komplikation, der er af særlig klinisk betydning, da radioimmunoconjugates injiceres intravenøst, og derfor - i modsætning til delvis krop CT-scanninger - resultat i absorberede doser i alle dele af kroppen, uafhængigt af interrogerede væv.

For at omgå dette problem, er betydelig indsats været dedikeret til udvikpment af PET-billeddannelse strategier, afkoble radioaktive isotop og målsøgende del, og derved udnytte de fordelagtige egenskaber af antistoffer samtidig fodpaneler deres iboende farmakokinetiske begrænsninger. Disse strategier - oftest betegnet pretargeting eller flertrins målretning - benytter typisk fire trin: (1) indgivelse af et antistof er i stand til at binde både et antigen og en radioligand; (2) akkumulering af antistoffet i målvævet og dets clearance fra blodet; (3) at behandling af et lille molekyle radioligand; og (4) in vivo ligering af radioligand til antistoffet efterfulgt af hurtig clearance af overskydende radioligand. 3-8 I nogle tilfælde er en yderligere klaringsmiddel injiceres mellem trin 2 og 3 for at fremskynde udskillelsen af hvilket som helst antistof , som endnu ikke binde tumoren og forbliver i blodet. 5

I store træk two typer pretargeting strategier er mest fremherskende i litteraturen. Mens begge har vist sig gode i prækliniske modeller, de har også vigtige begrænsninger, som har hindret deres kliniske anvendelighed. Den første strategi bygger på den høje affinitet mellem streptavidin-konjugerede antistoffer og biotinmodificerede radiomærker; har imidlertid immunogenicitet streptavidin-modificerede antistoffer vist sig at være et bekymrende problem med hensyn til translation. 5,6,9,10 Den anden strategi, i modsætning, beskæftiger bispecifikke antistoffer, der er blevet genetisk manipuleret til at binde både en cancer biomarkør antigen og et lille molekyle radiomærket hapten. 3,11-14 Mens sidstnævnte rute er bestemt kreativ, er dets brede anvendelighed begrænset af kompleksitet, omkostninger og manglende modulopbygning af systemet.

For nylig har vi udviklet og udgivet en pretargeted PET imaging metode baseret på den inverse elektron efterspørgsel Diels-Alder (IEDDA) cycloadditionsreaktion mellem trans -cyclooctene (TCO) og tetrazin (Tz;. Figur 1) 11, medens selve reaktionen har været kendt i årtier, har IEDDA kemi oplevet en renæssance i de senere år som et klik kemi bioconjugation teknik, som illustreret ved den fascinerende gruppernes arbejde af Ralph Weissleder, Joseph Fox, og Peter Conti blandt andre. 12-15 Den IEDDA cycloaddition er blevet anvendt i en lang række indstillinger, herunder fluorescens billeddannelse med peptider, antistoffer og nanopartikler samt nuklear billeddannelse . med både radiohalogens og radiometaller 16-26 Ligeringen er højtydende, ren, hurtig (k 1> 30.000 M-1 sek -1), selektiv, og - kritisk -. bioorthogonal 27 Og mens en række typer af klik kemi - herunder Cu-katalyseret azid-alkyn cycloadditioner, strain-forfremmet azid-alkyn cycloadditioner og Staudinger Ligtioner -. er bioorthogonal så godt, det er den unikke kombination af hurtige reaktionskinetik og bioorthogonality der gør IEDDA kemi så velegnet til pretargeting applikationer i hele organismer 28,29 Langs disse linjer, er det vigtigt at bemærke, at den seneste rapport fra vores laboratorier var ikke den første til at anvende IEDDA kemi pretargeting: den første rapport fra pretargeted billeddannelse med IEDDA opstået under arbejdet i Rossin, et al og fremhævede en SPECT metode anvender en 111 In-mærket tetrazin 30..

Som vi diskuteret ovenfor pretargeting metode har fire forholdsvis enkle trin (figur 2). I protokollen ved hånden, vil blive beskrevet en pretargeted strategi for PET-billeddannelse af kolorektal cancer, der anvender en 64 Cu-NOTA-mærket tetrazin radioligand og en TCO-modificeret konjugat af huA33 antistof. Men i sidste ende modulopbygning af denne metode er en af ​​sin GRspiser aktiver, som trans -cyclooctene del kan tilføjes til enhver ikke-internalisere antistof, og tetrazin kan knyttes til en bred vifte af radioaktive journalister.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etiske retningslinjer: Alle de in vivo dyreforsøg beskrevne blev udført efter en godkendt protokol og under de etiske retningslinjer for Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC).

1. Syntese af Tz-Bn-NOTA

  1. I en lille reaktionsbeholder opløses 7 mg NH2 -Bn-NOTA (1,25 x 10 -2 mmol) i 600 pi NaHCO3-puffer (0,1 M, pH 8,1). Kontroller pH af opløsningen. Hvis det er nødvendigt, at justere pH af opløsningen til 8,1 ved hjælp af små portioner af 0,1 M Na 2 CO 3.
  2. Tilsæt NH2 -Bn-NOTA løsning på 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 -3 mmol) i et 1,7 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: TZ-NHS kan enten afvejes tør eller tilsættes fra en stamopløsning af tørt DMF eller DMSO (<50 pi).
  3. Lad den resulterende reaktionsopløsning at reagere i 30 minutter ved stuetemperaturmed mild omrøring.
  4. Efter 30 min oprense produktet ved hjælp af omvendt fase C18 HPLC-kromatografi til fjernelse af uomsat NH2 -Bn-NOTA. NH 2 -Bn-NOTA kan overvåges ved en bølgelængde på 254 nm, mens Tz-NHS og Tz-Bn-NOTA bedst overvåges ved en bølgelængde på 525 nm.
    BEMÆRK: Retentionstider er naturligvis stærkt afhængig af HPLC-udstyr opsætning af hvert laboratorium (pumper, søjler, slanger, etc.). Men for at præsentere et eksempel, hvis en gradient af 0: 100 MeCN / H2O (begge med 0,1% TFA) til 100: 0 MeCN / H2O løbet af 25 minutter og en analytisk 4,6 x 250 mm C18-søjle anvendes De retentionstid Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, og NH 2 -Bn-NOTA vil være omkring 15 min, 16,5 min og 10 min. Produktet kan oprenses fra de andre reaktionskomponenter i enten en enkelt kørsel eller flere kørsler ved hjælp af en semi-præparativ eller præparativ C18 HPLC-søjle. 1H-NMR, analytical HPLC og ESI-MS er alle metoder, der kan anvendes til at kontrollere renheden af det færdige Tz-Bn-NOTA precursor. 11
  5. Frys det indsamlede HPLC eluent anvendelse af flydende nitrogen.
  6. Pak frosne opsamlingsrør i uigennemsigtig aluminiumsfolie.
  7. Placer den frosne opsamlingsrør i en frysetørring fartøj O / N for at fjerne HPLC mobil fase.
  8. Opbevar oprensede produkt (lyst pink fast stof) i mørke ved -80 ° C.
    BEMÆRK: Dette er en acceptabel standsning punkt i proceduren. Den udfyldte Tz-Bn-NOTA forstadiet er stabil i mindst 1 år i henhold til disse betingelser.

2. Fremstilling af huA33-TCO immunkonjugatet

  1. I et 1,7 ml mikrocentrifugerør, fremstilles en 1 mg / ml (2,7 mM) opløsning af TCO-NHS i tørt DMF.
  2. I et 1,7 ml mikrocentrifugerør udarbejde en 2 mg / ml (13,3 pM) af huA33 i 1 ml phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (0,01 M PO 4 3-
  3. Ved hjælp af små portioner (<5 pi) af 0,1 M Na 2 CO 3, justere pH af antistoffet opløsningen til 8,8-9,0. Brug enten pH papir eller et pH-meter med en mikroelektrode at overvåge pH, og pas på ikke at lade pH til at stige over pH 9,0.
  4. Når antistoffet løsning er i den korrekte pH, tilsættes et volumen af ​​TCO-NHS opløsning svarende til 8 molækvivalenter af aktiveret ester. For eksempel tilsættes 7,9 pi af 1 mg / ml TCO-NHS-opløsning (1,07 x 10 -7 mol TCO-NHS) til 1 ml 2 mg / ml huA33 antistof opløsning (1,33 x 10 -8 mol huA33). Du må ikke overstige 5% DMF i volumen i opløsningen.
  5. Bland forsigtigt opløsningen ved at vende mikrocentrifugerør flere gange.
  6. Pak mikrocentrifugerør i uigennemsigtig aluminiumsfolie.
  7. Lad opløsningen inkuberes i 1 time ved stuetemperatur med let omrøring.
  8. Efter 1 time ved stuetemperatur, rense det resulterende immunokonjugat ved hjælp af en færdigpakkede engangs size udelukkelse afsaltningssøjle. Først skylles kolonnen størrelse eksklusion som beskrevet af leverandøren for at fjerne eventuelle konserveringsmidler til stede på søjlen under opbevaring. Derefter tilsættes reaktionsblandingen til kolonnen størrelse eksklusion, skylles søjlen med 1,5 ml 0,9% sterilt saltvand og derefter opsamle produktet med 2 ml 0,9% sterilt saltvand som elueringsmiddel.
    BEMÆRK: Dette trin vil give den udfyldte huA33-TCO som en 2 ml opløsning.
  9. Måle koncentrationen af ​​den resulterende huA33-TCO på et UV-Vis spektrofotometer.
  10. Hvis der ønskes en højere koncentration, koncentrere huA33-TCO opløsning under anvendelse af en centrifugal filterenhed med en 50.000 molekylvægt cut-off.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at mens huA33 og en række andre kendte antistoffer (fx bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, og J591) er meget tolerante over for at blive koncentreret, kan aggregering og udfældning forekomme ved koncentration i andre tilfælde. Forskere forsøger dette procedure med en ny antistof skal have tillid til litteraturen eller deres egen viden af ​​antistoffet pågældende med hensyn til, om der skal koncentrere antistoffet.
  11. Opbevar den udfyldte huA33-TCO immunkonjugatet ved 4 ° C i mørke.
    BEMÆRK: Dette er en acceptabel standsning punkt i proceduren. Den udfyldte mAb-TCO konjugat skal være stabilt i mindst 3 måneder under disse opbevaringsbetingelser.

3. 64 Cu Radiomærkning af Tz-Bn-NOTA

BEMÆRK: Dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin - eller udfører andet arbejde med radioaktivitet - forskere bør rådføre sig med deres hjem institutions Radiation Safety afdeling. Tage alle mulige skridt til at minimere udsættelse for ioniserende stråling.

  1. I en 1,7 ml mikrocentrifugerør, forberede en 0,5 mg / ml (723 uM) opløsning af Tz-Bn-NOTA.
  2. I et 1,7 ml microcentrifuge rør tilsættes 10 pi af Tz-Bn-NOTA opløsning (5 ug) til 400 pi 0,2 M NH4OAc pH 5,5 buffer.
  3. Af hensyn til korrekt radiokemiske note-føring, måle og registrere mængden af ​​radioaktivitet i prøven ved hjælp af en dosiskalibrator før og efter de efterfølgende trin i protokollen nedenfor (3,4-3,8). Dette vil hjælpe med nøjagtig bestemmelse af radiokemiske udbytte.
  4. Tilføj 2.000 uCi (74 MBq) 64 Cu TZ-Bn-NOTA opløsning.
    BEMÆRK: Typisk [64 Cu] CuCl2 leveres i et lille volumen (<30 pi) af 0,1 N HCI, og således kun små mængder (<10 pi) af denne stamopløsning er nødvendige for radioaktiv mærkning reaktion. Hvis der er behov større mængder af den [64 Cu] CuCl2 bestand, den radiomærkning reaktion er tolerant over for at øge den samlede reaktion volumen. Imidlertid bør pH af radiomærkning reaktionsopløsningen overvåges omhyggeligt for at sikreat det ikke falder under pH 4,0.
  5. Lad opløsningen inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur med let omrøring.
  6. Efter 10 min inkubation oprense produktet ved hjælp af omvendt fase C18 HPLC-kromatografi. Retentionstider er naturligvis stærkt afhængig af HPLC-udstyr opsætning af hvert laboratorium (pumper, søjler, slanger, etc.). Men for at præsentere et eksempel, hvis en gradient af 5:95 MeCN / H2O (begge med 0,1% TFA) til 95: 5 MeCN / H2O løbet af 15 minutter anvendes, retentionstiden for 64 Cu-Tz- Bn-NOTA bør være omkring 9,8 min mens fri, ikke-kompleksbundet 64 Cu vil elueres med opløsningsmiddelfronten på omkring 2-4 min.
  7. Ved hjælp af en rotationsfordamper, fjerne HPLC eluent.
  8. Genopløs 64 Cu-Tz-Bn-NOTA produkt i 0,9% sterilt saltvand.
    BEMÆRK: I betragtning af 12,7 HR fysisk halveringstid på 64 Cu, er dette ikke en acceptabel standsning punkt i proceduren. Udfør syntesen af 64 Cu-Tz-Bn-NOTEt umiddelbart før injektionen af ​​radioliganden, og følg Trin 3.7 straks for trin 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

BEMÆRK: Som i protokol afsnit 3, dette trin i protokollen indebærer håndtering og manipulation af radioaktivitet. Før du udfører disse trin forskere bør rådføre sig med deres hjem institutions Radiation Safety afdeling. Tage alle mulige skridt til at minimere udsættelse for ioniserende stråling.

  1. I en kvindelig athymiske nøgne mus, subkutant implantat 1 x 10 6 SW1222 colorectal cancer celler og tillade disse at vokse til en 100-150 mm 3 xenograft (9-12 dage efter inokulering). 11
  2. Fortyndes en alikvot af huA33-TCO løsning fra protokol afsnit 2 til en koncentration på 0,5 mg / ml i 0,9% sterilt saltvand.
  3. Injicer 200 pi af huA33-TCO opløsning (100 ug) i halevenen af ​​xenograft-bærende mus.
  4. Tillad 24 timer til akkumulering af huA33-TCO i tumoren på musen.
  5. Fortynd 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand til en koncentration på 1,5 mCi / ml i 0,9% sterilt saltvand.
  6. Injicer 200 pi af 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radioligand opløsning (300 uCi, 11,1 MBq, 1,6 nmol 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, under forudsætning af en specifik aktivitet på 6,7 MBq / nmol) i halevenen af xenograft-bærende mus.
  7. Ved det ønskede imaging tidspunkt (f.eks, 2, 6, 12 eller 24 timer efter injektion), bedøver musen med en 2% isofluran: gasblanding oxygen.
  8. Placer musen på sengen af ​​den lille dyr PET-scanner. Opretholde anæstesi under scanningen ved hjælp af en 1% isofluran: gasblanding ilt. Forud for at placere dyret på scannerpladen, kontrollere anæstesi ved hjælp af tå-pinch metode og anvende veterinær salve til øjnene på musen for at forhindre udtørring under anæstesi.
  9. Erhverve PET data for mus via en statiskscan med et minimum af 20 millioner sammenfaldende begivenheder ved hjælp af en energi vindue på 350-700 keV og en tilfældighed timing vindue på 6 ns. Efter at have afsluttet købet af billedet, ikke forlader musen uden opsyn og ikke placere den i et bur med andre mus, indtil det har genvundet bevidstheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De første tre trin af forsøget - syntesen af Tz-Bn-NOTA, konjugeringen af TCO til huA33 og radiomærkning af Tz-Bn-NOTA konstruktion (figur 3 og 4) - er meget pålidelige. I tilfælde af den ovennævnte procedure blev TZ-Bn-NOTA konstruktion syntetiseret i højt udbytte og renhed. Den huA33 antistof blev modificeret med 4,2 ± 0,6 TCO / mAb og Tz-Bn-NOTA blev radiomærket med 64 Cu til opnåelse af oprensede radioligand i> 99% radiokemisk renhed,> 85% henfald korrigeret udbytte, og en specifik aktivitet på ~ 6.7 MBq / nmol (figur 5). Reaktiviteten af ​​huA33-TCO konjugat og tetrazin radioligand kan testes under anvendelse af radioaktivt øjeblikkelig tyndtlagskromatografi (ITLC). Dette gøres ved at blande det radiomærkede tetrazin (100 uCi; 0,55 nmol, under forudsætning af en specifik aktivitet på 6,7 MBq / nmol) med et lille overskud af huA33-TCO (50 ug; 0,66 nmol) i pHosphate-bufret saltvand (pH 7,4) ved stuetemperatur i 5 min. Derefter ca. 1 uCi af opløsningen spottet på en omvendt fase C18 TLC-plade og fik lov at tørre. TLC køres i 9: 1 MeCN: H2O, og pladen analyseret under anvendelse af en radioaktiv TLC pladelæser. Hvis klik reaktionen fungerer som planlagt, bør ligeret 64 Cu-NOTA-A33 forblive på baseline; Hvis på den anden side, at reaktionen mislykkes, vil gratis 64 Cu-Tz-Bn-NOTA vises på eller nær opløsningsmiddelfronten.

Går videre til in vivo imaging eksperimenter, i protokollen beskrevet ovenfor blev athymiske nøgne mus med A33 antigen-udtrykkende, SW1222 kolorektal cancer xenotransplantater ansat. Både akutte biodistribution (n = 5 per tidspunkt) og PET-billeddannelse (n = 12) forsøg viser, at pretargeting strategi er i stand til at afgrænse kolorektal tumorvækst med fremragende billede kontrast og høje tumor-til-baggrund aktivitet forhold (Figur 6). Optagelse af 64 Cu-Tz-Bn-NOTA i tumoren fremgår på tidlige tidspunkter: 3.5% ± 0,6% ID / g og 4,1% ± 0,6% ID / g ved 1 time og 4 timer efter injektion hhv. Men ved disse tidlige punkter, er det nemt skjules af mængden af ​​radioaktivitet clearing gennem tarmkanalen af ​​mus (11,9% ± 4,4% ID / g og 8,8% ± 3,4% ID / g i fæces på 1 time og 4 HR pi, henholdsvis). I løbet af flere timer, overskydende radioligand sender gennem fæces (1,4% ± 0,5% ID / g ved 24 timer pi), og tumoren bliver det mest fremtrædende træk i billedet (4,0% ± 0,9% ID / g ved 24 hr pi). På disse senere tidspunkter, er tumoren godt afgrænset i billedet, og tumor-til-baggrund aktivitet nøgletal er temmelig høje; for eksempel strategien giver tumor: muskel-forhold på 26,6 ± 6,6 ved 12 timer pi og 27,0 ± 7,4 ved 24 timer pi Ikke overraskende kontrolforsøg under anvendelse af kun 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, ikke-specifikke antistoffer, or huA33 uden konjugeret TCO dele alt resulteret i minimal optagelse i tumoren.

Som det vil blive diskuteret yderligere nedenfor, dette pretargeting strategi - ligesom alle pretargeting strategier - har en række variabler, som vil kræve optimering, når den anvendes til nye antistof / antigen-systemer. To af de vigtigste er massen af ​​mAb-TCO konstrukt injiceres og længden af ​​intervallet mellem indsprøjtningen af ​​mAb-TCO konstruktionen og injektionen af ​​radioligand. Hvis mængden af mAb-TCO konjugat er for høj eller intervallet tid mellem injektionerne er for kort, mængden af fri mAb-TCO i blodet går op og sandsynligheden for klik reaktioner forekommer i blodet i stedet for på tumor stiger. For eksempel i 64 Cu / huA33 systemet diskuteret her, både indgivelse af 300 ug huA33 (snarere end 100 ug) eller anvendelse af en 12 HR interval (snarere end 24 timer) resulterede i betydelige stigninger i than mængden af radioaktivitet ses i hjertet af mus (figur 7A og figur 7B, henholdsvis). I begge disse tilfælde er klikket reaktionen stadig klart forekommer på tumoren, som illustreret ved mængden af ​​tumorale optagelse på tidlige tidspunkter; imidlertid dannelsen af ​​radioaktivt mærket antistof i blodet er også tydelig. Mens dette er fristende at afvise fordi det radioaktivt mærkede antistof dannet i blodet stadig i sidste ende vil finde vej til tumoren, denne noget nederlag formålet med anvendelse af en pretargeting metode, som det radioaktivt mærkede antistof cirkulere langsomt før den når tumoren og derved forhøje dosis satser på ikke-målorganer. Omvendt, hvis der anvendes for lidt antistof, mængden af ​​optagelse i tumoren vil naturligvis lide. Overdrevent lange interval tider kan også reducere niveauet af tumoroptagelse som følge af langsom antistof internalisering, transcyclooctene isomerisering eller antistof / antigen udgyde. Diagnosen thESE problemer er mere udfordrende og ikke kan opnås blot ved undersøgelsen af ​​PET data. Er klart, at en hårfin balance opretholdes. Det anbefales derfor, at eventuelle efterforskere forsøger at anvende denne strategi til et nyt antistof / antigen-systemet anvender store mængder af mAb-TCO konstruktion (≥ 200 ug) og kort interval gange (≤ 24 HR) som udgangspunkt og optimere derfra.

Figur 1
Figur 1. Den inverse elektron-demand Diels-Alder [4 + 2] cycloaddition klik ligering mellem tetrazin og transcyclooctene.

Figur 2
Figur 2. En illustration af de fire trin i pretargeting metodologi. Er Dette tal er baseret på forskning, der oprindeligt udgivet i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi based om bioorthgonal Diels-Alder klik kemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 af Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. En ordning om ændring af huA33 med TCO-NHS.

Figur 4
Figur 4. En ordning for syntesen og 64 Cu radioaktiv mærkning af Tz-Bn-NOTA. Er Dette tal er baseret på forskning, der oprindeligt udgivet i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baseret på bioorthgonal Diels-Alder klik kemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 af Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 5
Figur 5. En radio-HPLC spor af oprenset 64 Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figur 6
Figur 6. PET billeder af 64 Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pretargeting strategi. Mus bærende subkutane SW1222 xenotransplantater (100-150 mm3) blev indgivet huA33-TCO (100 ug) via injektion i halevenen. Efter 24 timer blev de samme mus indgives 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) via injektion i halevenen og derefter afbildes 2, 6, 12 og 18 timer efter administrationen af radioaktivt lægemiddel. Transverse (øverst) og koronale (nederst) plane billeder skærer centrum af tumorerne. Høje niveauer af optagelse i tarmen på tidlige tidspunkter (dvs. 2 og 6 timer) i høj grad klar med 12 timer, der forlader tumor (hvid pil) klart afgrænset fra alle ikke-målvæv med 12 og 18 timer efter injektion. Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baseret på bioorthgonal Diels-Alder klik kemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 af Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 7
Figur 7. PET billeder af suboptimale pretargeting eksperimenter. (A) Mus bearing subkutane SW1222 xenotransplantater (100-150 mm3, pil) blev administreret huA33-TCO (100 ug) via injektion i halevenen. Efter 12 timer blev de samme mus indgives 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) haleveneinjektion. (B) mus, der bærer subkutane SW1222 xenotransplantater (100-150 mm3, pil) blev administreret A33-TCO (300 ug) via injektion i halevenen. Efter 24 timer blev de samme mus indgives 64 Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) haleveneinjektion. I begge tilfælde blev musene afbildet 12 timer efter injektionen af 64 Cu-Tz-Bn-NOTA. I begge paneler, tværgående (øverst) og koronale (nederst) plane billeder skærer midten af ​​tumorer. Mens pretargeting strategi klart beskriver den tumor i begge tilfælde resultaterne i begge disse billeder er sub-standard i forhold til dem, der vises i figur 6. I både 7A og 7B, er der enbetydelig mængde baggrund aktivitet optagelse i hjertet. Under betingelserne i figur 7A, er mest sandsynligt resultatet af huA33-TCO konstruere ikke får tilstrækkelig tid til at lokalisere tumoren. Under betingelserne for figur 7B, dette sandsynligvis en konsekvens af at injicere for meget huA33-TCO og have overskydende immunkonjugat stadig cirkulerer i blodet, selv 24 timer efter injektion. Dette tal er baseret på forskning oprindeligt udgivet i JNM. Zeglis, BM et al. En pretargeted PET imaging strategi baseret på bioorthgonal Diels-Alder klik kemi. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 af Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Inc. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den primære fordel ved denne pretargeted PET imaging strategi er, at det er i stand til at afgrænse tumorer med mål-til-baggrund billedets kontrast på kun en brøkdel af den baggrundsstråling dosis produceret af direkte mærkede antistoffer. For eksempel i kolorektal cancer imaging system her beskrevne data fra akutte biodistributionsmodificerende eksperimenter blev anvendt til at udføre dosimetri beregninger for 64 Cu-baserede pretargeting strategi sammen med direkte-mærkede 64 Cu-NOTA-huA33 og 89 Zr-DFO-huA33. Disse beregninger viser tydeligt dosimetriske fordele ved pretargeting systemet, især i forhold til de mere klinisk relevant 89 Zr-mærket antistof. Den effektive dosis af pretargeting strategi er 0,0124 mSv / MBq, medens 89 Zr-DFO-huA33 er over 30 gange højere: 0,4162 mSv / MBq. Den dosimetrisk fordel pretargeting er mindre udtalt, når man sammenligner med 64 Cu-mærkede enntibody (0,0359 mSv / MBq), selv om den fordelagtige effekt eksisterer stadig.

En af de mest betydningsfulde styrker af dette IEDDA pretargeting metode er dens modulopbygning: trans -cyclooctene kan tilføjes til ethvert antistof, som ikke er internaliserende, og en bred vifte af laster kan fastgøres til tetrazin. Faktisk vores primære motivation for at skrive denne protokol er at gøre det muligt for andre forskergrupper at ansætte denne metode med forskellige antistof / antigen / radioisotoper systemer. Langs disse linjer, mener vi, det er afgørende for at løse en række spørgsmål, som forskere bør overveje, når at tilpasse denne metode til andre systemer.

Første udvælgelse af antistoffet er uhyre vigtig. Kort sagt, skal antistoffet være ikke-internalisere eller internaliseres i et meget langsomt tempo. Mens de ideelle kinetiske parametre er endnu ikke fastlagt, antistoffet og det reaktive trans -cyclooctene det udøver skal forblive påydersiden af cellen, internalisering og binding af antistoffet før injektionen af radioligand ville dramatisk formindske antallet af in vivo klik reaktioner. I det her beskrevne system, huA33 antistof mål og binder til A33-antigen, et transmembrant glycoprotein udtrykt i> 95% af alle colorektale cancere. Vigtigere er det blevet vist, at selv efter binding sit mål, den huA33 antistof / antigen-kompleks forbliver på overfladen af cellen i dagevis. 31-33 Mens behovet for et ikke-internaliserende antistof er ganske vist en begrænsning til den strategi, en bred vifte af ikke-internaliserende antistoffer er kendt, måske især i TAG72 målretning CC49 antistof, Rossin et al. har udforsket i deres fremragende pretargeting arbejde. 30,34,35

For det andet, denne pretargeting strategi - som enhver anden - kræver betydelig optimering. Ud over identiteten af ​​enntibody og tetrazin radioliganden skal to kritiske variabler overvejes: mængden af ​​antistof injiceres og intervallet tid mellem injektioner af antistoffet og radioliganden. Vi har behandlet begge disse variabler i afsnittet Repræsentative resultater ovenfor, men kort at gentage, hvis enten for meget antistof eller for kort et interval tid er ansat, betydelige mængder af mAb-TCO konjugat vil forblive i blodet på tidspunktet for injektionen af radioligand. Dette vil igen resultere i in vivo klik ligering forekommer i blodet snarere end på tumor, danner cirkulerende radioaktivt mærket antistof, som kun langsomt ophobes i tumoren over tid. Omvendt, hvis enten for lidt antistof eller for lang en interval tid anvendes, vil den endelige mængde radioaktivitet i tumoren være optimal. Det er vores opfattelse, at udføre streng billeddannelse eller fortrinsvis akutte biofordeling eksperimenter med direkte mærkede antistof itseLF forud for enhver pretargeting eksperimenter er den mest pålidelige måde at lære om mængden af ​​antistof behov og den ideelle interval tid efter den første injektion af antistof-konstruktion. For forskellige injicerede masser af radioaktivt mærket mAb, vil disse eksperimenter i konkrete informationer om både clearance af radioimmunkonjugatets fra blodet og dets ophobning i tumoren, der giver mulighed for at udvælge de mest lovende forhold for pretargeting eksperimenter.

Endelig skal farmakokinetik tetrazin-baserede radioligand overvejes ved valg af en egnet radioisotop. I det her beskrevne system, er det radiomærkede Tz-Bn-NOTA del udskilles fra kroppen via tarmen med en biologisk halveringstid på ca. 3-4 timer, hvilket gør 64 Cu positron-emitterende radioisotop med den mest komplementære fysiske halv- liv. Desværre biologiske halveringstid af tetrazin delen er for lang til at være forenelig med the hurtigere rådnende radiometal 68 Ga (t 1/2 = 68 min). I dette tilfælde vil enhver radioaktivitet i tumor henfalde gennem flere halveringstider før overskydende radioligand færdig clearing fra kroppen. Som et resultat, vil billederne skulle erhverves på tidlige tidspunkter, når tumor-til-baggrund aktivitet nøgletal forbliver lav 36 Ideelt set ville fremtidige generationer af tetrazin radioligander konstrueres -. Måske via PEGylering, glycering, eller på anden måde - at udskille fra kroppen hurtigere. Det ville give mulighed for radiomærkning med hurtigere rådnende radioisotoper såsom 68 Ga og 18 F, hvilket igen ville yderligere forbedrer dosimetriske fordele ved pretargeted imaging strategi. I sidste ende, som forskere tilpasse teknologien til brug med andre radioaktive isotoper til billeddannelse (f.eks 124 I, 111 I, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, etc.) eller terapi (fx 177 Lu, 225 Ac, 125I, etc.) vil nye tetrazin-baserede ligander skal udvikles til at indarbejde forskellige chelatorer eller radioaktiv mærkning af proteser grupper. Den grundige undersøgelse af farmakokinetikken af ​​disse nye konstruktioner vil være afgørende for at sikre fordelagtige kampe mellem clearance egenskaber af ligander og den fysiske halveringstid af radionuklider.

I sidste ende, vi håber meget, at andre forskere ser løftet om dette pretargeting teknologi og beskæftiger det med nye antistof / antigen-systemer. Mens de foregående afsnit viser, at denne tilpasningsproces er ikke altid let, er det vores overbevisning, at denne metode kan have en betydelig indvirkning på nuklear billeddannelse, målrettet radionuklid terapi, og videre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Tags

Bioengineering Positron Emission Tomography Klik Kemi pretargeting tetrazin, Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition
Udnyttelse af Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. … More

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter