Introduction
最後の30年間で、陽電子放射断層撮影(PET)は、癌の診断と管理に不可欠な臨床ツールとなっている。抗体は、長い癌バイオマーカーに対するそれらの絶妙な親和性および特異性に起因する腫瘍への陽電子放出放射性同位元素の送達のための有望なベクターであると考えられている。抗体の1,2-しかしながら、比較的遅いインビボでの薬物動態は、複数日と放射性同位元素の使用を義務付け物理的半減期。この組み合わせは、患者の非標的器官、放射性免疫複合体を静脈内、したがって注入されるので、特定の臨床的意義のある重要な合併症に高い放射線量を得ることができる - 部分ボディCTスキャンとは異なり - 身体のあらゆる部分に吸収線量をもたらす、尋問組織の関係なく。
この問題を回避するためには、かなりの努力がdeveloに専念してきました同時に、それらの固有の薬物動態学的限界を幅木つつ抗体の有利な特性を活用し、放射性同位体と標的部分を切り離すPETイメージング戦略のpment。これらの戦略は-最も頻繁にプレターゲッティングまたは多段階のターゲティングと呼ばれる- 典型的には4つのステップを使用する:(1)抗原および放射性リガンドの両方に結合することができる抗体を投与する。 (2)標的組織及び血液からのそのクリアランスにおける抗体の蓄積。 (3)小分子、放射性リガンドを投与する。 (4)過剰な放射性リガンドの迅速なクリアランスによって。場合によっては3-8続い抗体に対する放射性リガンドのインビボでの連結は、追加のクリアリング剤は、任意の抗体の排泄を促進するために、手順2と3の間に注入されるそれは、腫瘍をバインドするためにまだあり、血液中に残っている。5
広義には、TWを話すプレターゲッティング戦略のO型は、文学の中で最も普及している。両方の前臨床モデルで成功を収めているが、それらはまた、それらの臨床適用を妨げている重要な制限を有する。最初の戦略は、ストレプトアビジン結合抗体およびビオチン修飾放射標識の間に高い親和性に依存しています。しかし、ストレプトアビジンで修飾された抗体の免疫原性は、翻訳に関して気になる問題があることが証明されている。 メタノシクロオクタ第二の戦略は、対照的に、癌の両方に結合するように遺伝子操作された二重特異性抗体を用いてバイオマーカー抗原と小分子、放射性標識ハプテン。3,11-14この後者のルートは確かに創造的である一方、その広範な適用は複雑さ、費用、およびシステムのモジュール性の欠如によって制限されている。
最近、我々は、逆電子需要ディールス - アルダーに基づくプレターゲッティングPET画像化方法論を開発し、公開された(Iトランス -cyclooctene(TCO)とテトラジン(Tzの間EDDA)付加環化反応; 図1)11反応自体は何十年も知られているがで示されるように、IEDDA化学は、クリック化学バイオコンジュゲーション技術として、近年、ルネッサンスを経験しているとりわけラルフ·ワスリーダー、ジョセフ·フォックス、そしてピーター·コンティのグループの魅力的な作品。12-15 IEDDAの環は、蛍光ペプチドでのイメージング、抗体、およびナノ粒子だけでなく、核画像を含め、設定の広い範囲で適用されている。批判- -バイオ直交27とクリックケミストリーの種類数ながら。放射性ハロゲンと放射性金属の両方で16-26ライゲーションは高い収穫、清潔、迅速な(K 1>3万M -1秒-1)、選択され、 -銅触媒によるアジド - アルキン付加環、ストレイン·昇格アジド - アルキン付加環、及びシュタウディンガーLIG含む管理ポイント- 。それは生物全体でアプリケーションをプレターゲッティングに適しとてもよくIEDDA化学を行い、反応速度が速くとbioorthogonalityのユニークな組み合わせであるだけでなく、バイオ直交であるこれらの線に沿って28,29、それがあることを私たちの最近の報告に注意することが重要である研究所は、プレターゲッティングにIEDDA化学を適用することが第一ではなかった:IEDDAと予め標的イメージングの最初の報告は、 ら Rossin、の仕事から生じたと111 In標識テトラジンを採用したSPECTの方法論を特色にした30。。
我々は、上述のように、プレターゲッティング方法は、4つの非常に単純な手順( 図2)を有している。手元プロトコルでは、64のCu-NOTA標識テトラジン放射性リガンド及びhuA33抗体のTCO変性共役を用いた結腸直腸癌のPET画像化のためのプレターゲッティング戦略を説明する。しかし、最終的にはこの方法論のモジュールは、そのGRの一つですトランス -cyclooctene部分としてeatest資産は、非内在化抗体に付加することができ、テトラジン、放射性レポーターの多種多様に取り付けることができる。
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Protocol
倫理STATEMENT:記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会(IACUC)の倫理指針の下で実施した。
TZ-BN-NOTAの1の合成
- 小さ な反応容器中で、600μlの飽和NaHCO 3緩衝液(0.1M、pHが8.1)に7mgのNH 2 -Bn-NOTA(1.25×10 -2ミリモル)を溶解する。溶液のpHを確認してください。必要に応じて、0.1 MのNa 2 CO 3の少量のアリコートを用いて8.1に溶液のpHを調節する。
- 1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに0.5mgのTZ-NHS(1.25×10 -3 mmol)のNH 2 -Bn-NOTAソリューションを追加します。
注:TZ-NHSは、乾式を秤量または乾燥DMFまたはDMSO(<50μL)のストック溶液から追加することができます。 - 得られた反応溶液を室温で30分間反応させる穏やかに撹拌しながら。
- 30分後、未反応のNH 2 -Bn-NOTAを除去し、逆相C 18 HPLCクロマトグラフィーを用いて生成物を精製する。 TZ-NHSおよびTZ-BN-NOTAは最高の525の波長で監視されながら、NH 2 -Bn-NOTAは、254nmの波長でモニターすることができます。
注:保持時間は、明らかに、各研究室(ポンプ、カラム、チューブなど )のHPLC機器設定に大きく依存している。 100〜100のMeCN / H 2 O(0.1%TFA両方):0のMeCN / H 2 O 25分および分析4.6×250ミリメートルC 18カラムを使用した0の勾配は場合は、例を提示する、Tzを-Bnは、NOTA、Tzを-NHSおよびNH 2 -Bn-NOTAの保持時間は、それぞれ、約15分、16.5分、および10分であろう。生成物は、単一の実行またはセミ分取または分取C 18 HPLCカラムを使用して複数の実行のいずれかの他の反応成分から精製することができる。1 H-NMR、肛門ytical HPLCおよびESI-MS完了Tzを-Bnは、NOTA前駆体の純度を確認するために使用することができるすべての方法である。11 - 液体窒素を使用して収集HPLC溶出液を凍結する。
- 不透明なアルミホイルで凍結されたコレクションチューブを包みます。
- HPLC移動相を除去するために凍結乾燥容器のO / Nで凍結されたコレクションチューブを置きます。
- -80℃で暗所に精製された生成物(固体明るいピンク)を保管してください。
注:この手順で許容停止点である。完成Tzを-Bnは、NOTA前駆体は、これらの条件下で少なくとも1年間安定である。
huA33-TCO免疫複合の調製
- 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、1 mg / mlの乾燥DMF中のTCO-NHSの(2.7 mM)の溶液を調製。
- 1.7 mlのマイクロ遠心チューブにおいて、リン酸緩衝生理食塩水1mlにhuA33の2mg / mlの(13.3μM)溶液を調製し、pHを7.4(0.01 M PO 4 3-
- 0.1 MのNa 2 CO 3の少量のアリコート(<5μl)を使用して、8.8から9.0への抗体溶液のpHを調整。 pHを監視するために微小電極でpH試験紙またはpH計のいずれかを使用し、pHが9.0を超えて上昇することを可能にしないように注意してください。
- 抗体溶液は、適切なpHであると、活性化エステルの8モル当量に対応するTCO-NHS溶液の容量を追加する。例えば、2 mg / mlのhuA33抗体溶液(1.33×10 -8モルhuA33)1mlに1mg / mlのTCO-NHSの溶液(1.07×10 -7モルTCO-NHS)7.9μlを添加する。溶液中で5体積%DMFを超えないようにしてください。
- 静かにマイクロ遠心チューブを数回反転させた溶液を混合。
- 不透明なアルミホイルでマイクロ遠心チューブを包みます。
- ソリューションは、穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートすることを許可する。
- 室温で1時間後、プレパック使い捨てSIZを使用して生じた免疫複合体を精製しE除外脱塩カラム。貯蔵中のカラム上に存在する任意の防腐剤を除去するために供給者によって記載されているように、まず、サイズ排除カラムをリンスする。その後、1.5mlの0.9%滅菌生理食塩水でカラムを洗い流し、サイズ排除カラムに反応混合物を追加し、続いて溶離液として0.9%滅菌生理食塩水2 mlを使用して製品を収集する。
注:このステップは2ミリリットルソリューションとして完成huA33-TCOが得られます。 - UV-Vis分光光度計に生じたhuA33-TCOの濃度を測定します。
- より高い濃度が望まれる場合には50,000分子量カットオフ遠心フィルターユニットを用いhuA33、TCO液を濃縮する。
注:それはhuA33と他のよく知られた種々の抗体( 例えば、ベバシズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、およびJ591)が集中しているのは非常に寛容である一方で、凝集および沈殿が他のケースでは濃度に発生する可能性があることに注意することが重要である。このPROCEDを試みる研究者新しい抗体とのUREは文献または抗体を集中させるかどうかに関しては問題の抗体の独自の知識を信頼する必要があります。 - 暗闇の中で4℃で完了しhuA33-TCOの免疫複合体を保管してください。
注:この手順で許容停止点である。完成したmAbを、TCOコンジュゲートは、これらの保存条件下で少なくとも3ヶ月間安定であるべきである。
3. TZ-BN-NOTAの64 Cuの放射性標識
注:プロトコルのこの手順では、放射能の取り扱いと操作を含む。または放射能を持つ他の作業を行う - - これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるために可能なすべての手順を実行します。
- 1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、0.5 mg / mlの(723μM)TZ-BN-NOTAの溶液を調製。
- 1.7ミリリットルのMicroCでentrifugeチューブ、0.2 M NH 4 OAcのpHが5.5の緩衝液400μlにTZ-BN-NOTA溶液10μl(5μgの)を追加します。
- 適切な放射化学ノートキーピングの利益のために、以下のプロトコル(3.4から3.8)でその後の工程の前と後の投与量キャリブレータを用いて試料中の放射能の量を測定し、記録します。これは放射化学的収率での正確な決定に役立ちます。
- TZ-BN-NOTA溶液に64のCuの2000μCiの(74 MBqの)を追加します。
注:典型的には、[64のCu]のCuCl 2を 0.1NのHClの小体積(<30μlの)で供給されるので、この原液のほんの体積(<10μl)を、放射標識反応のために必要とされる。 【64のCu]のCuCl 2株式の大きなボリュームが必要な場合は、放射標識反応は、全反応容積を増大は許容される。しかし、放射性標識反応液のpHを確保するために注意深く監視されるべきであるそれはpHが4.0を下回らないこと。 - ソリューションは、穏やかに撹拌しながら室温で10分間インキュベートすることを許可する。
- インキュベーションの10分後、逆相C 18 HPLCクロマトグラフィーを用いて生成物を精製する。保持時間は、明らかに、各研究室(ポンプ、カラム、チューブなど )のHPLC機器設定に大きく依存している。 64のCu-Tz-の保持時間、分が使用されている15以上5のMeCN / H 2 O:95から5:95のMeCN / H 2 O(0.1%TFAの両方)の勾配場合は、例を提示する無料で、非複合体64 Cuが周りに2-4分で溶媒先端で溶出する一方BN-NOTAは約9.8分であるべきである。
- ロータリーエバポレーターを用いて、HPLCの溶離液を取り除く。
- 0.9%滅菌生理食塩水で64のCu-TZ-BN-NOTA製品を再溶解。
注:64のCuの12.7時間の物理的半減期を考えると、これは手続きで許容停止点ではありません。 64のCu-TZ-BN-NOTの合成を行う放射性リガンドの注射の直前に、ステップ4.5によってすぐにステップ3.7に従ってください。
生体内 、プレターゲッティングPETイメージング4.
注:プロトコルセクション3のように、プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるために可能なすべての手順を実行します。
- 雌の無胸腺ヌードマウス、皮下インプラント1×10 6 SW1222大腸癌細胞における、これらは(9-12日接種後)100〜150ミリメートル3異種移植片へと成長することができます。11
- 0.9%滅菌生理食塩水で0.5 mg / mlの濃度にプロトコル部2からhuA33-TCO溶液のアリコートを希釈する。
- 異種移植片担持マウスの尾静脈にhuA33、TCO溶液200μl(100μgの)を注入する。
- マウスの腫瘍におけるhuA33-TCOの蓄積のための24時間を許可する。
- 0.9%滅菌生理食塩水で1.5 mCiの/ mlの濃度になるように64のCu-Tzを-Bnは、NOTAの放射性リガンドを希釈する。
- の尾静脈に(6.7 MBqで/ナノモルの比活性を仮定して、64のCu-TZ-BN-NOTAの1.6ナノモル; 11.1 MBqの300μCiの)64のCu-TZ-BN-NOTAの放射性リガンド溶液200μlを注入異種移植片担持マウス。
- 酸素ガス混合物:所望の撮影時点( 例えば、2、6、12、または24時間後に注射)で、2%イソフルランでマウスを麻酔。
- 小動物PETスキャナーのベッドの上にマウスを置きます。酸素ガス混合物:1%イソフルランを使用して、スキャン中に麻酔を維持。スキャナベッド上に動物を配置する前に、つま先ピンチ方式を使用して麻酔を確認し、麻酔中の乾燥を防止するために、マウスの眼に獣医軟膏を適用する。
- 静的介してマウス用PETデータを取得する350〜700 keVのエネルギーウィンドウと6ナノ秒の一致タイミングウィンドウを使用して2000万一致するイベントを最小限に抑えてスキャンします。画像の取得を完了した後、無人のマウスを残していないし、それが意識を取り戻したまで他のマウスとケージに入れないでください。
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Representative Results
実験の最初の三つのステップ- TZ-BN-NOTA、huA33にTCOの結合の合成、およびTZ-BN-NOTAの放射性標識( 図3、図4)を構築は-信頼性が高いです。上記の手順の場合には、Tzを-Bnは、NOTA構築物を高収率および高純度で合成した。 〜huA33抗体は4.2±0.6、TCO / mAbで変更された、とTZ-BN-NOTAは、> 85%の減衰補正後の収量、および比活性> 99%の放射化学的純度に精製された放射性リガンドを得るのに64 Cuとの放射性標識した6.7 MBqを/ナノモル( 図5)。 huA33-TCOコンジュゲートおよびテトラジン放射性リガンドの反応性は、放射性インスタント薄層クロマトグラフィー(ITLC)を用いて試験することができる。 huA33-TCOのわずかに過剰で、(6.7 MBqで/ナノモルの比活性を仮定して、0.55 nmolの100μCiの)これは、放射性標識テトラジンを混合することによって行われます(50μgの、0.66ナノモル)pHの5分間室温でosphate緩衝生理食塩水(pH7.4)。その後、溶液の約1μCiの逆相C 18 TLCプレート上にスポットし、乾燥させる。 H 2 O、およびプレートは、放射性TLCプレートリーダーを用いて分析:1のMeCN:TLC 9で実行される。クリック反応は、計画通りに動作する場合、連結した64のCu-NOTA-A33は、ベースラインのまま必要があります。反応が失敗した場合、一方で、無料の64のCu-TZ-BN-NOTAは、溶媒先端またはその近くに表示されます。
上述のプロトコルでは、 インビボイメージング実験に移り、A33抗原を発現し、SW1222結腸直腸癌異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスを用いた。急性生体内分布(nは時点当たり5)及びPETイメージングた(n = 12)の実験の両方が、図6(プレターゲティング戦略は、優れた画像コントラストと高い腫瘍対バックグラウンド活性比の結腸直腸腫瘍増殖の輪郭を描くことが可能であることを明らかにした)。腫瘍における64のCu-TZ-BN-NOTAの取り込みは、早期の時点では明らかである:それぞれ1時間及び4時間後、注射、0.6%のID / gの±0.6%ID / gおよび4.1%±3.5%。しかし、これらの初期の点で、それは容易に4.4%のID / gで1時間で糞便中の3.4%のID / gの±8.8%及び4±マウスの腸管を通してクリアした放射能の量(11.9%によって隠されている時間のPI、それぞれ)。数時間かけて、過剰放射性リガンドは、(1.4%±0.5%ID / gの24時間のPIで)糞を通してクリアし、腫瘍が画像(4.0%±0.9%ID / gの中で最も顕著な特徴でなり、 24時間のパイ)。これらの後の時点で、腫瘍が十分に画像に描写し、腫瘍対バックグラウンド活性比は非常に高いされる。 12時間のπと27.0±7.4℃で24時間のπ驚くべきことではないが、わずか64のCu-Tzを-Bnは、NOTA、非特異的抗体を用いた対照実験では、Oで26.6±6.6の筋肉比:例えば、戦略は、腫瘍を生じるR huA33体化TCO部分なしには、すべての腫瘍で最小限の取り込みをもたらした。
さらに後述するように、このプレターゲティング戦略 - すべてのプレターゲティング戦略のような - 新しい抗体/抗原系に適用した場合の最適化を必要とする変数の数を有している。最も重要なのは、注入された二つのmAb-TCO構築物の質量およびmAb-TCO構築物の注入及び放射性リガンド注射間の間隔の長さである。 mAbは、TCOコンジュゲートの量が多すぎるまたは噴射間のインターバル時間が短すぎると、血中の遊離のmAb-TCOの量が上昇し、クリック反応の可能性は、血液中ではなく、腫瘍の増加で発生する。たとえば、64のCu / huA33システムでhuA33(ではなく100μgの)または12時間間隔時間(というよりも、24時間)の使用μgのがTに顕著な増加をもたらした300の投与の両方、ここで議論マウス(それぞれ図7Aおよび図7B)の中心部に見える放射能の彼は量。初期の時点での腫瘍取り込み量によって示されるようにいずれの場合も、クリック反応は、まだ明らかに、腫瘍で発生している。しかし、血液中の放射性標識抗体の形成もまた明らかである。これが血液中に形成された放射性標識抗体は、まだ最終的には腫瘍への道を見つけるため却下する魅力的ですが、これはややそれが腫瘍に到達し、それによって上げる前に、放射性標識抗体がゆっくりと循環するように、プレターゲッティング方法論を使用することの目的に反し非標的臓器への線量率。あまりに少ない抗体が使用される場合、逆に、腫瘍における取り込み量が自然に低下します。過度に長い間隔時間も遅い抗体内在化、transcyclooctene異性化、又は抗体/抗原の脱落の結果として、腫瘍取り込みのレベルを低下させることができる。目の診断eseの問題はより困難であり、単純にPETデータの検査を介して達成することができない。明らかに、微妙なバランスが維持されなければならない。そのため、新たな抗体/抗原システムにこの戦略を適用しようとするすべての研究者は、出発点としてのmAb-TCO構築物(≥200μgの)と短い間隔時間(≤24時間)を大量に使用して、そこから最適化することをお勧めします。
図1.逆電子デマンド·アルダーテトラジンとtranscyclooctene間の[4 + 2]環のクリックライゲーション。
図2.プレターゲッティング方法論の4つのステップの図示は。この数字は、もともとJNMに発表された研究に基づいています。 Zeglis、BM らプレターゲッティングPETイメージング戦略浅核医学の ED bioorthgonalディールス·アルダークリックケミストリーに。 ジャーナル 。54、1389年から1396年(2013年)。 ©2013核医学と分子イメージング学会により、Inc.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. TCO-NHSとhuA33の修正のためのスキーム。
図4.合成およびTZ-BN-NOTAの64銅放射性標識のためのスキームは。この数字は、もともとJNMに発表された研究に基づいています。 Zeglis、BM ら bioorthgonalディールス·アルダーに基づいて、プレターゲッティングPETイメージング戦略は、化学をクリックします。 核医学誌 。54、1389から1396(2013)。 &#169; 2013核医学と分子イメージング学会により、Inc.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.精製された64のCu-TZ-BN-NOTAのラジオ-HPLCトレース。
図戦略をプレターゲッティング64のCu-TZ-BN-NOTA / A33-TCOの6 PET画像。皮下SW1222異種移植片(100〜150ミリメートル3)を有するマウスを、尾静脈注射を介してhuA33-TCO(100μgの)を投与した。 24時間後、同じマウスの尾静脈注射を介して64のCu-Tzを-Bnは、NOTA(10.2から12.0 MBqの[275〜μCiの])を投与し、その後の投与後2,6,12、および18時間後に画像化さ放射性医薬品。 Trはansverse(上)および冠状(下)の平面画像は、腫瘍の中心と交差する。明確12及び18時間後に注射して、すべての非標的組織から線引き腫瘍(白矢印)を残して、12時間の影響をほとんど透明な初期の時点( すなわち、2および6時間)での腸内取り込みの高レベル。この数字は、もともとJNMに発表された研究に基づいています。 Zeglis、BM ら bioorthgonalディールス·アルダーに基づいて、プレターゲッティングPETイメージング戦略は、化学をクリックします。 核医学誌 。54、1389から1396(2013)。 ©2013核医学と分子イメージング学会により、Inc.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図実験をプレターゲッティング次善の7 PET画像。(A)マウスBEAリング皮下SW1222異種移植片(100〜150ミリメートル3、矢印)が尾静脈注射を介して、huA33、TCO(100μgの)を投与した。 12時間後、同じマウスは、64のCu-Tzを-Bnは、NOTA(10.2から12.0 MBqの[275〜μCiの])を尾静脈注射を投与した。 (B)皮下SW1222異種移植片(100〜150ミリメートル3、矢印)を有するマウスは、尾静脈注射を介して、A33-TCO(300μgの)を投与した。 24時間後、同じマウスは、64のCu-Tzを-Bnは、NOTA(10.2から12.0 MBqの[275〜μCiの])を尾静脈注射を投与した。両方の場合において、マウスは、64のCu-Tzを-Bnは、NOTAの注射後12時間後に画像化した。両方のパネルにおいては、横方向(上)および冠状(下)の平面画像は、腫瘍の中心と交差する。プレターゲティング戦略は明らかに、両方の場合において、腫瘍の輪郭を描く一方で、これらの画像の両方の結果は、 図6に表示されたものと比較して標準以下である。 図7の両方において、存在する心臓におけるバックグラウンド活性の取り込みのかなりの量。 図7Aの条件下では、これが最も可能性が高いhuA33-TCOの結果は腫瘍に局在するのに十分な時間を与えられていない構造である。 図7Bの条件下では、これは、おそらくあまりhuA33、TCOを注入し、注入後に血液中にも24時間循環依然として過剰な免疫複合体を有することの結果である。この数字は、もともとJNMに発表された研究に基づいています。 Zeglis、BM ら bioorthgonalディールス·アルダーに基づいて、プレターゲッティングPETイメージング戦略は、化学をクリックします。 核医学誌 。54、1389から1396(2013)。 2013核医学と分子イメージング学会により、Inc.は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプレターゲッティングPETイメージング戦略の主な利点は、直接標識された抗体によって生成バックグラウンド放射線量のほんの一部で標的対バックグラウンド画像コントラストを有する腫瘍の輪郭を描くことが可能であることである。例えば、ここに記載の結腸直腸癌のイメージングシステムにおいて、急性生体内分布実験からのデータは、直接標識された64のCu-NOTA-huA33 89のZr-DFO-huA33と共に64 Cu系プレターゲッティング戦略の線量計算を実行するために使用した。より臨床的に関連する89のZrで標識した抗体と比較した場合、これらの計算は、明らかに、特に、プレターゲッティング系の線量利点を示す。 0.4162ミリシーベルト/ MBqで:89のZr-DFO-huA33のそれは30倍以上高くなっている間プレターゲティング戦略の有効用量は、0.0124ミリシーベルト/ MBqである。 64と比較したときにプレターゲッティングの線量利点がそれほど顕著ではCuの標識ntibody(0.0359ミリシーベルト/ MBqで)、でも効果はまだ存在しています。
このIEDDAプレターゲッティング方法論の中で最も重要な強みのひとつは、そのモジュールです: トランス -cycloocteneは、内在化されていない任意の抗体に付加することができ、貨物の多種多様なテトラジンに結合させることができる。実際に、このプロトコルを記述するための我々の主要な動機は、異なる抗体/抗原/放射性同位体システムでは、この方法を採用する他の研究グループを有効にすることである。これらの線に沿って、我々はそれが他のシステムのために、この方法論を適応させる際に、研究者が検討すべき多くの問題を解決することが重要であると考えています。
まず、抗体の選択は、途方もなく重要です。簡単に言えば、抗体は、非内在または非常に遅い速度で内部化する必要があります。理想的な速度論的パラメーターがまだ決定されているが、抗体と反応性トランス -cyclooctene、それが上のままでなければならない運ぶ放射性リガンドの注入の前に、抗体の内在化および隔離のために細胞の外側には、飛躍的にインビボでの反応をクリック数を減少させるであろう。ここで説明するシステムでは、huA33抗体標的およびA33抗原、全結腸直腸癌の> 95%において発現される膜貫通糖タンパク質に結合する。重要なことに、それもその標的に結合した後、huA33抗体/抗原複合体が日間細胞の表面上に残ることが示されている。31-33非内在化抗体の必要性が戦略への限定が確かにあるが、非内在抗体の多種多様なRossinは、 ら。その優れたプレターゲッティング作業で検討している、おそらく最も顕著TAG72ターゲティングCC49抗体を知られている。30,34,35
第二に、このプレターゲティング戦略は - 他のどのような - の重要な最適化を必要とする。 Aのアイデンティティに加え、ntibodyとテトラジン放射性リガンドは、2重要な変数を考慮しなければならない:注射された抗体の量と抗体と放射性リガンドの噴射間の間隔時間。私たちは、上記の代表的な結果の項で、これらの両方の変数に対処しているが、簡単に繰り返すように、あまりにも多くの抗体または短すぎる間隔時間のどちらかが用いられる場合に、mAb-TCOの結合体のかなりの量は、注入時に血液中に残ります放射性リガンドの。これは、順番に、ライゲーションが血液中に発生したのではなく、腫瘍で、ゆっくりとしか時間をかけて腫瘍内に蓄積し循環する、放射性標識抗体を形成する]をクリックし、生体内になります。少な抗体または長すぎる時間間隔のいずれかが使用される場合、逆に、腫瘍中の放射能の最終量は、最適ではないであろう。私どもの意見では、直接標識抗体itseで厳格なイメージング、または好ましくは、急性の生体内分布実験を行うLFはどんなプレターゲッティング実験に先立って必要とされる抗体の量と抗体構築の最初の注射後の理想的な間隔時間について学ぶための最も信頼性の高い方法です。放射性標識mAbの異なる注入し大衆のために、これらの実験は、プレターゲッティング実験のための最も有望な条件の選択を可能にする、血液からの放射性免疫複合体のクリアランス、腫瘍での蓄積の両方に具体的なデータを提供する。
適切な放射性同位元素を選択する際に最後に、テトラジンベースの放射性リガンドの薬物動態を考慮しなければならない。ここに記載されているシステムでは、放射性標識Tzを-Bnは、NOTA部分は、最も相補的な物理的半減期と64のCuポジトロン放出放射性同位体を作り、約3~4時間の生物学的半減期を有する腸を介して身体から排出される人生。それは目に適合するように残念なことに、テトラジン部分の生物学的半減期が長すぎるeは、より迅速に放射性金属の68 Ga(T 1/2 = 68分)を減衰する。過剰な放射性リガンドは、身体からのクリアが完了する前に、この場合には、腫瘍内の任意の放射活性は、いくつかの半減期を通って減衰う。その結果、画像は、腫瘍対バックグラウンド活性比は低いままである場合には、初期の時点で取得しなければならない36理想的には、テトラジン放射性リガンドの将来の世代を設計することであろう-多分PEG化、糖化、または他の手段を介して-排泄する身体からより迅速に。これはさらに、プレターゲッティングイメージング戦略の線量の利点を増強するような68 Ga及び18 Fのようなより急速に減衰する放射性同位体で放射性標識を可能にするであろう。最終的に、研究者は、イメージングのための他の放射性同位体( 例えば 、124 I、111で、18 F、 など 89のZr、68 Ga は 、)または療法( 例えば、で使用するためにこの技術を適応させるようにY、177 Luは、225 Acを、125 I 等 )、新しいテトラジン系リガンドは、異なるキレート剤または放射性標識補欠分子族を組み込むために開発される必要がある。これらの新規の構築物の薬物動態の徹底的な調査は、リガンドのクリアランス特性と放射性核種の物理的半減期との間に有利なマッチを確保するために不可欠となります。
最後に、我々は非常に多くの他の研究者は、このプレターゲッティング技術の約束を確認し、新しい抗体/抗原系でそれを採用することを願っています。前の段落では、この適応プロセスは、常に簡単でないことを示しているが、この方法は超えて核イメージングに大きな影響、標的化放射性核種療法などを有することができるという信念である。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tetrazine NHS Ester | Sigma-Aldrich | 764701 | Store at -80 °C |
Trans-cyclooctene NHS Ester | Sigma-Aldrich | 764523 | Store at -80 °C |
p-NH2-Bn-NOTA | Macrocyclics | B-601 | Store at -80 °C |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
- Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
- Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
- Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
- Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
- Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
- Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
- Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
- Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
- Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
- Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
- Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
- Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
- Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
- Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
- Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
- Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).
- Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
- Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
- Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
- Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
- Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
- Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
- Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
- Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
- Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
- Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
- Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
- Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
- Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
- Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).