Sfruttando la domanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder cicloaddizione per Pretargeted PET Imaging

Introduction

Negli ultimi trent'anni, tomografia ad emissione di positroni (PET) è diventato uno strumento indispensabile clinica nella diagnosi e gestione del cancro. Anticorpi sono stati a lungo considerati vettori promettenti per la fornitura di radioisotopi ad emissione di positroni per tumori a causa della loro affinità squisita e specificità per biomarcatori tumorali. ^1,2, tuttavia, relativamente lenti farmacocinetica in vivo di anticorpi mandati l'uso di radioisotopi con più giorni emivita fisica. Questa combinazione può produrre alte dosi di radiazioni agli organi non bersaglio di pazienti, una complicazione importante che è di particolare rilevanza clinica poiché radioimmunoconjugates vengono iniettati per via endovenosa e quindi - a differenza parziali scansioni corpo CT - risultato in dosi assorbite in ogni parte del corpo, indipendentemente tessuti interrogati.

Per evitare questo problema, notevole sforzo è stato dedicato alla svipment di strategie di imaging PET che disaccoppiare radioisotopo e la frazione di targeting, sfruttando in tal modo le proprietà vantaggiose di anticorpi e contemporaneamente costeggiando i loro limiti farmacocinetiche intrinseche. Queste strategie - spesso definito pretargeting o il targeting più fasi - tipicamente impiegano quattro fasi: (1) la somministrazione di un anticorpo in grado di legare sia un antigene ed un radioligando; (2) l'accumulo dell'anticorpo nel tessuto bersaglio e la sua clearance dal sangue; (3) la somministrazione di una piccola molecola radioligando; e (4) la legatura in vivo del radioligando all'anticorpo seguita dalla rapida clearance dell'eccesso radioligando. ^3-8 In alcuni casi, un agente di compensazione addizionale viene iniettato tra i passaggi 2 e 3, al fine di accelerare l'escrezione di qualsiasi anticorpo che deve ancora impegnare il tumore e rimane nel sangue. ⁵

In generale, two tipi di strategie pretargeting sono più diffusi in letteratura. Mentre entrambi hanno dimostrato con successo in modelli preclinici, possiedono anche limitazioni chiave che hanno impedito la loro applicabilità clinica. La prima strategia si basa sul alta affinità tra streptavidina anticorpi coniugati e radiolabels biotina-modificato; Tuttavia, l'immunogenicità degli anticorpi streptavidina-modificato ha dimostrato di essere un problema preoccupante per quanto riguarda la traduzione. ^5,6,9,10 La seconda strategia, al contrario, impiega anticorpi bispecifici geneticamente ingegnerizzati per legare sia un cancro biomarker antigene e una piccola aptene radiomarcato molecola. ^3,11-14 Mentre quest'ultimo rotta è certamente creativo, la sua ampia applicabilità è limitata dalla complessità, spesa, e la mancanza di modularità del sistema.

Recentemente, abbiamo sviluppato e pubblicato una metodologia di imaging PET pretargeted basato sulla domanda inversa elettrone Diels-Alder (IEDDA) reazione di cicloaddizione tra -cyclooctene trans (TCO) e tetrazina (Tz;. Figura 1) ¹¹ Mentre la reazione si è stato conosciuto per decenni, IEDDA chimica ha conosciuto una rinascita negli ultimi anni come una tecnica bioconjugation click chemistry, come illustrato da l'affascinante lavoro dei gruppi di Ralph Weissleder, Giuseppe Volpe, e Peter Conti, tra gli altri. ^12-15 L'IEDDA cicloaddizione è stato applicato in una vasta gamma di impostazioni, tra cui imaging di fluorescenza con peptidi, anticorpi, e nanoparticelle e di imaging nucleare . con entrambi radiohalogens e radiometalli ^16-26 La legatura è ad alto rendimento, pulito, veloce (k _1> 30.000 M ^-1 sec ^-1), selettivo, e - critica -. bioorthogonal ²⁷ E mentre un certo numero di tipi di click chemistry - compresi azide-alkyne cicloaddizioni Cu-catalizzata, cicloaddizioni azide-alkyne ceppo-promossa, e Staudinger ligzioni -. bioorthogonal sono pure, è la combinazione unica di cinetica di reazione veloci e bioorthogonality che rende IEDDA chimica così adatto per applicazioni pretargeting in organismi interi ^28,29 Lungo queste linee, è importante notare che la recente relazione nostro laboratori non è stato il primo ad applicare IEDDA chimica per pretargeting: il primo rapporto delle immagini pretargeted con IEDDA sorto dal lavoro di Rossin, et al e caratterizzato da una metodologia SPECT impiegando un ¹¹¹ In marcato tetrazina ^30..

Come abbiamo discusso in precedenza, la metodologia pretargeting ha quattro abbastanza semplici passaggi (Figura 2). Nel protocollo a portata di mano, sarà descritta una strategia pretargeted per imaging PET di tumore del colon-retto, che si avvale di un Cu-NOTA-marcato radiolegante ⁶⁴ tetrazina e un coniugato TCO modificato dell'anticorpo huA33. Tuttavia, in ultima analisi, la modularità di questa metodologia è uno dei suoi grbeni ne mangerai, come la frazione -cyclooctene trans possono essere aggiunti a qualsiasi anticorpo non interiorizzare, e la tetrazina può essere collegato a una grande varietà di giornalisti radioattive.

Protocol

ETICA DICHIARAZIONE: Tutti gli esperimenti sugli animali in vivo descritti sono stati eseguiti secondo un protocollo approvato e alle linee guida etiche del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Sintesi di Tz-Bn-NOTA

1. In un piccolo recipiente di reazione, sciogliere 7 mg NH _2--BN NOTA (1,25 x 10 ^-2 mmoli) in 600 microlitri tampone di _NaHCO3 (0,1 M, pH 8,1). Controllare il pH della soluzione. Se necessario, regolare il pH della soluzione a 8,1 utilizzando piccole aliquote di 0,1 M Na ₂ CO _3.
2. Aggiungere la soluzione di NH ₂ -BN-NOTA a 0,5 mg Tz-NHS (1,25 x 10 ^-3 mmol) in una provetta 1,7 ml microcentrifuga.
   NOTA: Il Tz-NHS può essere sia pesato secco o aggiunta di una soluzione madre di DMF secco o DMSO (<50 ml).
3. Lasciare la soluzione di reazione risultante a reagire per 30 minuti a RTcon agitazione lieve.
4. Dopo 30 minuti, purificare il prodotto con fase inversa C ₁₈ cromatografia HPLC per rimuovere reagito NH ₂ -BN-NOTA. L'NH ₂ -BN-NOTA può essere monitorato alla lunghezza d'onda di 254 nm, mentre il TZ-NHS e Tz-Bn-NOTA sono meglio controllati alla lunghezza d'onda di 525 nm.
   NOTA: I tempi di ritenzione sono ovviamente fortemente dipendente dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 0: / H ₂ O (entrambi con 0,1% TFA) a 100 100 MeCN: 0 MeCN / H ₂ O oltre 25 min ed una analitica 4,6 x 250 millimetri C ₁₈ colonna viene utilizzata , i tempi di ritenzione di Tz-Bn-NOTA, Tz-NHS, e NH ₂ -BN-NOTA si aggirano intorno a 15 min, 16.5 min, e 10 minuti rispettivamente. Il prodotto può essere purificato dagli altri componenti della reazione in un singolo run o più corse con un C ₁₈ colonna HPLC semi-preparativa o preparativo. ¹ H-NMR, analeytical HPLC, e ESI-MS sono tutti i metodi che possono essere utilizzati per verificare la purezza del completamento precursore Tz-Bn-NOTA. ¹¹
5. Congelare l'eluente HPLC raccolti con azoto liquido.
6. Avvolgere il tubo di raccolta congelato in un foglio di alluminio opaco.
7. Posizionare il tubo di raccolta congelati in un recipiente liofilizzazione O / N per rimuovere la fase mobile HPLC.
8. Conservare il prodotto purificato (un rosa brillante solido) al buio a -80 ° C.
   NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il precursore Tz-Bn-NOTA completato è stabile per almeno 1 anno in queste condizioni.

2. Preparazione di huA33-TCO immunoconiugato

1. In una provetta 1,7 ml, preparare un 1 mg / ml (2,7 mM) soluzione TCO-NHS in secca DMF.
2. In una provetta 1,7 ml microcentrifuga, preparare un 2 mg / ml (13,3 micron) di huA33 in 1 ml di tampone fosfato, pH 7.4 (0,01 M PO _{4 ^3-,}
3. Utilizzando piccole aliquote (<5 microlitri) di 0,1 M Na ₂ CO _3, regolare il pH della soluzione a 8,8-9,0 anticorpi. Utilizzare la carta pH o pH-metro con un microelettrodo per monitorare il pH, e fare attenzione a non permettere il pH di elevarsi al di sopra di pH 9,0.
4. Una volta che la soluzione di anticorpo è alla giusta pH, aggiungere un volume della soluzione TCO-NHS corrispondenti a 8 equivalenti molari di dell'estere attivato. Ad esempio, aggiungere 7,9 ml di 1 mg / ml soluzione TCO-NHS (1,07 x 10 ^-7 mol TCO-NHS) per il 1 ml di soluzione di 2 mg / ml di anticorpi huA33 (1.33 x 10 ^-8 mol huA33). Non superare il 5% in volume DMF nella soluzione.
5. Mescolare delicatamente la soluzione invertendo la provetta diverse volte.
6. Avvolgere la provetta in un foglio di alluminio opaco.
7. Lasciare che la soluzione per incubare per 1 ora a temperatura ambiente con agitazione lieve.
8. Dopo 1 ora a RT, purificare l'immunoconiugato risultante con un siz getta preconfezionatoe l'esclusione colonna dissalazione. Innanzitutto, lavare la colonna esclusione dimensionale come descritto dal fornitore per rimuovere eventuali conservanti presenti nella colonna durante la conservazione. Quindi, aggiungere la miscela di reazione alla colonna esclusione dimensionale, lavare la colonna con 1,5 ml 0,9% soluzione salina sterile, e successivamente raccogliere il prodotto con 2 ml di 0,9% soluzione salina sterile come eluente.
   NOTA: Questo passaggio produrrà il completamento huA33-TCO come soluzione 2 ml.
9. Misurare la concentrazione della risultante huA33-TCO su un UV-Vis spettrofotometro.
10. Se una concentrazione maggiore è desiderato, concentrare la soluzione huA33-TCO utilizzando un'unità filtro centrifugo con un peso molecolare di 50.000 cut-off.
    NOTA: E 'importante notare che, mentre huA33 e una varietà di altri anticorpi noti (ad esempio, bevacizumab, trastuzumab, cetuximab, e J591) sono molto tolleranti di essere concentrato, l'aggregazione e la precipitazione può verificarsi dalla concentrazione in altri casi. I ricercatori di tentare questo procedUre con un nuovo anticorpo dovrebbe fidarsi letteratura o la propria conoscenza di anticorpo in questione per quanto riguarda se non concentrare l'anticorpo.
11. Conservare il completamento immunoconiugato huA33-TCO a 4 ° C al buio.
    NOTA: Questo è un punto di sosta accettabile nella procedura. Il completamento coniugato mAb-TCO deve essere stabile per almeno 3 mesi in queste condizioni di conservazione.

3. ⁶⁴ Cu radiomarcatura di Tz-Bn-NOTA

NOTA: Questo passaggio del protocollo comporta il trattamento e la manipolazione di radioattività. Prima di eseguire questi passi - o l'esecuzione di qualsiasi altro lavoro con radioattività - i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

1. In una provetta 1,7 ml, preparare un 0,5 mg / ml (723 um) soluzione di Tz-Bn-NOTA.
2. In un MicroC 1,7 mltubo entrifuge, aggiungere 10 ml di soluzione di Tz-Bn-NOTA (5 mg) per 400 ml di 0,2 M NH ₄ OAc pH 5,5 _tampone.
3. Nell'interesse di una corretta radiochimica nota-keeping, misurare e registrare la quantità di radioattività nel campione con un calibratore di dosi prima e dopo i passi successivi nel protocollo di seguito (3,4-3,8). Ciò contribuirà con la determinazione precisa dei rendimenti radiochimica.
4. Aggiungi 2.000 uCi (74 MBq) di ⁶⁴ Cu alla soluzione Tz-Bn-NOTA.
   NOTA: in genere, ^[64 Cu] CuCl ₂ viene fornito in un piccolo volume (<30 ml) di 0,1 N HCl, e quindi solo piccoli volumi (<10 ml) di questa soluzione madre sono necessarie per la reazione radiomarcatura. Se sono necessari grandi volumi della ^[64 Cu] CuCl ₂ stock, la reazione radiomarcatura è tollerante di aumentare il volume di reazione complessiva. Tuttavia, il pH della soluzione di reazione radiomarcatura devono essere monitorati attentamente per garantireche non scenda al di sotto di pH 4,0.
5. Lasciare che la soluzione per incubare per 10 min a RT con agitazione lieve.
6. Dopo 10 min di incubazione, purificare il prodotto con fase inversa C ₁₈ cromatografia HPLC. I tempi di ritenzione sono ovviamente altamente dipendenti dalla configurazione apparecchiature HPLC di ogni laboratorio (pompe, colonne, tubi, ecc). Tuttavia, per presentare un esempio, se un gradiente di 5:95 MeCN / H ₂ O (entrambi con 0,1% TFA) a 95: 5 MeCN / H ₂ O oltre 15 min viene utilizzato, il tempo di ritenzione di ⁶⁴ Cu-Tz- Bn-NOTA dovrebbe essere di circa 9,8 minuti, mentre la connessione, non complessato ⁶⁴ Cu si eluire con il fronte del solvente a circa 2-4 min.
7. Utilizzando un evaporatore rotante, rimuovere l'eluente HPLC.
8. Riprendere il prodotto ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA nello 0,9% soluzione salina sterile.
   NOTA: Dato il 12,7 hr fisica emivita di ⁶⁴ Cu, questo non è un punto di arresto accettabile nel procedimento. Eseguire la sintesi di ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA immediatamente prima dell'iniezione del radiolegante, e seguire passo 3.7 immediatamente by Step 4.5.

4. In Vivo Pretargeted PET Imaging

NOTA: Come nella sezione protocollo 3, questa fase del protocollo comporta la gestione e la manipolazione della radioattività. Prima di effettuare questa procedura i ricercatori dovrebbero consultarsi con il Dipartimento di sicurezza di radiazione del proprio istituto. Adottare tutte le misure possibili per ridurre al minimo l'esposizione alle radiazioni ionizzanti.

1. In una femmina atimici topo nudo, impianto sottocute 1 x 10 ⁶ SW1222 cellule tumorali del colon-retto e permettere a questi di crescere in un xenotrapianto 100-150 mm ³ (9-12 giorni dopo l'inoculazione). ¹¹
2. Diluire un'aliquota della soluzione huA33-TCO dalla sezione protocollo 2 ad una concentrazione di 0,5 mg / ml in 0,9% soluzione salina sterile.
3. Iniettare 200 microlitri della soluzione di huA33-TCO (100 ug) nella vena della coda del topo xenotrapianto-cuscinetto.
4. Consentire 24 ore per l'accumulo del huA33-TCO nel tumore del mouse.
5. Diluire il ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA radioligando ad una concentrazione di 1,5 mCi / ml in 0,9% soluzione salina sterile.
6. Iniettare 200 ml di soluzione di radiolegante ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (300 uCi; 11,1 MBq; 1.6 nmol di ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA, assumendo una specifica attività di 6,7 MBq / nmol) nella vena della coda del xenotrapianto-cuscinetto topi.
7. Al punto di tempo di imaging desiderato (ad esempio, 2, 6, 12 o 24 ore post-iniezione), anestetizzare il mouse con isoflurano 2%: miscela di gas ossigeno.
8. Posizionare il mouse sul letto del piccolo scanner PET animali. Mantenere l'anestesia durante la scansione utilizzando una isoflurane 1%: miscela di ossigeno. Prima di mettere l'animale sul piatto dello scanner, verificare l'anestesia con il metodo punta pinch e applicare pomata veterinaria agli occhi del mouse per evitare l'essiccazione durante l'anestesia.
9. Acquisire i dati di PET per il mouse con una staticascansione con un minimo di 20 milioni di eventi coincidenti utilizzando una finestra di energia di 350-700 keV ed una finestra di temporizzazione coincidenza di 6 nsec. Dopo aver completato l'acquisizione delle immagini, non lasciare incustodito il mouse e non metterlo in una gabbia con altri topi fino a quando non ha ripreso conoscenza.

Representative Results

Le prime tre fasi dell'esperimento - la sintesi di Tz-Bn-NOTA, la coniugazione di TCO per huA33, e la radiomarcatura della Tz-Bn-NOTA costruiscono (figure 3 e 4) - sono altamente affidabili. Nel caso della procedura sopra, il costrutto Tz-Bn-NOTA stato sintetizzato con alta resa e purezza. L'anticorpo huA33 stato modificato con 4,2 ± 0,6 TCO / mAb e Tz-Bn-NOTA era radiomarcato con ⁶⁴ Cu a cedere il radiolegante purificato in> 99% di purezza radiochimica,> 85% di resa decadimento corretta, e una specifica attività di ~ 6.7 MBq / nmol (Figura 5). La reattività del coniugato huA33-TCO e il radioligando tetrazina possono essere testati utilizzando radioattiva immediata cromatografia su strato sottile (ITLC). Questo viene fatto miscelando il tetrazina radiomarcata (100 pCi; 0,55 nmol, assumendo una attività specifica di 6,7 MBq / nmol) con un leggero eccesso di huA33-TCO (50 mg; 0,66 nmol) in phosphate tamponata salina (pH 7,4) a temperatura ambiente per 5 min. Poi, circa 1 pCi della soluzione è macchiato su una piastra TLC C ₁₈ a fase inversa e lasciato asciugare. La TLC è gestito a 9: 1 MeCN: H ₂ O, e la piastra analizzato utilizzando un lettore di piastra di TLC radioattivo. Se la reazione click funziona come previsto, la legatura ⁶⁴ Cu-NOTA-A33 dovrebbe rimanere al basale; se, invece, la reazione non riesce, free ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA apparirà in prossimità o al fronte del solvente.

Passando agli esperimenti di imaging in vivo, nel protocollo sopra descritto, topi nudi atimici recanti A33 antigene-espressione, SW1222 xenotrapianti tumorali del colon-retto sono stati impiegati. Entrambi biodistribuzione acuta (n = 5 per punto di tempo) e PET (n = 12) esperimenti rivelano che la strategia pretargeting è capace di delineare la crescita del tumore colorettale con eccellente contrasto e alti rapporti tumore-to-bassa attività (Figura 6). Assorbimento del ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA nel tumore è evidente in momenti iniziali: 3,5% ± 0,6% ID / g e 4,1% ± 0,6% ID / g in 1 ora e 4 ore dopo l'iniezione, rispettivamente. Tuttavia, questi primi punti, è facilmente oscurato dalla quantità di radioattività compensazione attraverso il tratto intestinale del mouse (11,9% ± 4,4% ID / g e 8,8% ± 3,4% ID / g feci in 1 ora e 4 hr pi, rispettivamente). Nel corso di diverse ore, il radioligando eccesso elimina attraverso le feci (1,4% ± 0,5% ID / g in 24 ore pi), e il tumore diventa la caratteristica più importante nell'immagine (4,0% ± 0,9% ID / g 24 ore pi). In questi momenti successivi, il tumore è ben delineata nell'immagine, e il rapporto di attività tumorale-a-sfondo sono piuttosto elevati; per esempio, la strategia produce tumore: rapporti muscolari di 26,6 ± 6,6 a 12 ore pi e 27,0 ± 7,4 a 24 ore pi Non sorprende, esperimenti di controllo utilizzando solo ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-nota, anticorpi non specifici, or huA33 senza frazioni TCO coniugati tutto portato in assorbimento minimo nel tumore.

Come sarà discusso più avanti, questa strategia pretargeting - come tutte le strategie pretargeting - ha una serie di variabili che richiedono l'ottimizzazione quando applicata a nuovi sistemi anticorpo / antigene. Due dei più importanti sono la massa di mAb-TCO costrutto iniettato e la lunghezza dell'intervallo tra l'iniezione del costrutto mAb-TCO e l'iniezione del radioligando. Se la quantità di mAb-TCO coniugato è troppo alta o l'intervallo tra le iniezioni è troppo breve, la quantità di libera mAb-TCO nel sangue sale e la probabilità di reazioni click si verificano nel sangue piuttosto che aumenti tumorali. Ad esempio, nel sistema ⁶⁴ Cu / huA33 discusso qui, sia la somministrazione di 300 mg di huA33 (anziché 100 mg) o l'uso di un intervallo 12 ore (anziché 24 ore) ha causato aumenti notevoli nella tegli quantità di radioattività visibile nel cuore del mouse (Figura 7A e 7B Figura, rispettivamente). In entrambi i casi, la reazione click viene ancora chiaramente verificando a tumore, come illustrato dalla quantità di assorbimento tumorale in momenti iniziali; Tuttavia, la formazione di anticorpi radiomarcato nel sangue è anche evidente. Mentre questo è forte la tentazione di licenziare perché l'anticorpo radiomarcato formata nel sangue sarà ancora finalmente trovare la sua strada per il tumore, questo sconfigge in qualche modo lo scopo di utilizzare una metodologia pretargeting, come l'anticorpo radiomarcato circolerà lentamente prima che raggiunga il tumore e quindi aumentare dosare i tassi di organi non bersaglio. Viceversa, se si utilizza troppo poco anticorpo, la quantità di assorbimento nel tumore naturalmente soffrire. Eccessivamente lunghi tempi di intervallo possono ridurre i livelli di assorbimento tumorale come risultato di lenta internalizzazione anticorpi, transcyclooctene isomerizzazione, o anticorpo / antigene spargimento. La diagnosi di thproblemi ESE è più impegnativo e non può essere realizzato semplicemente attraverso l'esame dei dati PET. Chiaramente, un delicato equilibrio deve essere mantenuto. Pertanto, si raccomanda che ogni investigatori che cercano di applicare questa strategia per un nuovo sistema di antigene / anticorpo utilizzano grandi quantità di mAb-TCO costrutto (≥ 200 mg) e brevi tempi di intervallo (≤ 24 hr) come punti di partenza e di ottimizzare da lì.

Figura 1. L'inverso di elettroni-demand Diels-Alder [4 + 2] cicloaddizione click legatura tra tetrazina e transcyclooctene.

Figura 2. Un esempio dei quattro passaggi della metodologia pretargeting. Questa cifra si basa sulla ricerca pubblicato originariamente in JNM. Zeglis, BM et al. A PET pretargeted bas strategia di imaginged in bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 dalla Società di Medicina Nucleare e Imaging Molecolare, Inc. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Un sistema per la modifica di huA33 con TCO-NHS.

Figura 4. Uno schema per la sintesi e ⁶⁴ Cu radiomarcatura di Tz-Bn-NOTA. Questa cifra si basa sulla ricerca pubblicato originariamente in JNM. Zeglis, BM et al. Una strategia di imaging PET pretargeted basato su bioorthgonal Diels-Alder clic chimica. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). &# 169; 2013 dalla Società di Medicina Nucleare e Imaging Molecolare, Inc. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Una traccia radio-HPLC purificato ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA.

Figura 6. immagini PET di ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA / A33-TCO pretargeting strategia. I topi recanti xenotrapianti SW1222 sottocutanei (100-150 mm ³⁾ sono stati somministrati huA33-TCO (100 mg) tramite iniezione coda vena. Dopo 24 ore, gli stessi topi sono stati somministrati ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325] uCi) tramite iniezione coda vena e poi ripreso 2, 6, 12, e 18 ore dopo la somministrazione del radiofarmaco. Transverse (in alto) e coronali (in basso) immagini planari intersecano centro dei tumori. Alti livelli di assorbimento nell'intestino a tempi precoci (cioè, 2 e 6 ore) in gran parte trasparenti da 12 ore, lasciando il tumore (freccia bianca) chiaramente delineata da tutti i tessuti non bersaglio del 12 e 18 ore dopo l'iniezione. Questa cifra si basa sulla ricerca pubblicato originariamente in JNM. Zeglis, BM et al. Una strategia di imaging PET pretargeted basato su bioorthgonal Diels-Alder clic chimica. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 dalla Società di Medicina Nucleare e Imaging Molecolare, Inc. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7. immagini PET di esperimenti pretargeting non ottimali. (A) Mouse beaanello xenotrapianti sottocutanei SW1222 (100-150 mm ^3, freccia) sono stati somministrati huA33-TCO (100 mg) tramite iniezione coda vena. Dopo 12 ore, gli stessi topi sono stati somministrati ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) iniezione vena della coda. (B) Mouse recanti xenotrapianti sottocutanei SW1222 (100-150 mm ^3, freccia) sono stati somministrati A33-TCO (300 mg) tramite iniezione coda vena. Dopo 24 ore, gli stessi topi sono stati somministrati ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) iniezione vena della coda. In entrambi i casi, i topi sono stati ripreso 12 ore dopo l'iniezione di ⁶⁴ Cu-Tz-Bn-NOTA. In entrambi i pannelli, trasversale (top) e coronale (inferiore) immagini planari intersecano centro dei tumori. Mentre la strategia pretargeting delinea chiaramente il tumore in entrambi i casi, i risultati in entrambe queste immagini sono sub-standard rispetto a quelle indicate nella figura 6. Sia 7A e 7B, vi è unnotevole quantità di attività sfondo assorbimento nel cuore. Nelle condizioni di Figura 7A, questo è probabilmente il risultato della huA33-TCO costruire non essere dato tempo sufficiente per localizzarsi nel tumore. Nelle condizioni della figura 7B, è probabile una conseguenza di iniettare troppa huA33-TCO ed avente eccesso immunoconiugato ancora circolanti nel sangue, anche 24 ore dopo l'iniezione. Questa cifra si basa sulla ricerca pubblicato originariamente in JNM. Zeglis, BM et al. Una strategia di imaging PET pretargeted basato su bioorthgonal Diels-Alder clic chimica. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013). 2013 dalla Società di Medicina Nucleare e Imaging Molecolare, Inc. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il principale vantaggio di questa strategia PET pretargeted è che è in grado di delineare tumori con contrasto immagine target-to-background soltanto ad una frazione della dose di radiazione di fondo prodotto da anticorpi marcati direttamente. Ad esempio, nel sistema di imaging del cancro del colon-retto qui descritto, i dati provenienti da esperimenti biodistribuzione acuti sono stati impiegati per eseguire i calcoli di dosimetria per la strategia basata pretargeting-Cu ⁶⁴ con direttamente marcato ⁶⁴ Cu-NOTA-huA33 e ⁸⁹ Zr-DFO-huA33. Questi calcoli illustrano chiaramente i vantaggi dosimetrici del sistema pretargeting, soprattutto se paragonato ai più clinicamente rilevante anticorpo ⁸⁹ Zr-marcato. La dose efficace della strategia pretargeting è 0,0124 mSv / MBq, mentre quella del ⁸⁹ Zr-DFO-huA33 è oltre 30 volte superiore: 0,4162 mSv / MBq. Il vantaggio dosimetrica di pretargeting è meno pronunciata quando si confrontano al ⁶⁴ Cu-etichettato comentibody (0,0359 mSv / MBq), anche se l'effetto vantaggioso esiste ancora.

Uno dei più significativi punti di forza di questo IEDDA pretargeting metodologia è la sua modularità: il -cyclooctene trans può essere aggiunto a qualsiasi anticorpo che non è interiorizzando, e una vasta gamma di carichi può essere collegato al tetrazina. Infatti, la nostra motivazione principale per la scrittura di questo protocollo è quello di consentire ad altri gruppi di ricerca di utilizzare questo metodo con diversi sistemi di anticorpo / antigene / radioisotopi. Lungo queste linee, riteniamo che sia fondamentale per affrontare una serie di questioni che i ricercatori dovrebbero prendere in considerazione al momento di modificare questa metodologia per altri sistemi.

Innanzitutto, la selezione dell'anticorpo è estremamente importante. In poche parole, l'anticorpo deve essere non interiorizzazione o interiorizzato ad un ritmo molto lento. Mentre i parametri cinetici ideali sono ancora state determinate, l'anticorpo e la -cyclooctene trans reattiva porta deve rimanere sul'esterno della cellula, per l'internalizzazione e sequestro dell'anticorpo prima dell'iniezione del radiolegante diminuirebbe notevolmente il numero di reazioni in vivo click. Nel sistema qui descritto, gli obiettivi di anticorpi huA33 e si lega alla A33 all'antigene, una glicoproteina transmembrana espressa in> 95% di tutti i tumori del colon-retto. Importante, è stato dimostrato che anche dopo vincolante suo bersaglio, il complesso huA33 anticorpo / antigene rimane sulla superficie della cellula per giorni. ^31-33 Mentre la necessità di un anticorpo non interiorizzazione è certamente una limitazione alla strategia, un Un'ampia varietà di anticorpi non internalizzanti sono noti, forse più in particolare il-TAG72 rivolti CC49 anticorpo che Rossin, et al. hanno esplorato nel loro lavoro pretargeting eccellente. ^30,34,35

In secondo luogo, questa strategia pretargeting - come ogni altro - richiede significativa ottimizzazione. Oltre alla identità del unntibody e il radioligando tetrazina, due variabili critiche devono essere considerati: la quantità di anticorpo iniettato e l'intervallo tra le iniezioni di anticorpo e il radioligando. Abbiamo affrontato entrambe queste variabili nella sezione Risultati rappresentativi sopra, ma ribadire brevemente, se è impiegato sia troppo anticorpo o troppo breve intervallo di tempo, notevoli quantità di mAb-TCO coniugato rimarrà nel sangue al momento dell'iniezione del radioligando. Questo, a sua volta, comporta in vivo click legatura si verificano nel sangue piuttosto che al tumore, formando circolanti, anticorpo radiomarcato che solo lentamente accumulano nel tumore nel tempo. Al contrario, se è impiegato troppo poco anticorpo o troppo a lungo un intervallo di tempo, l'importo finale di radioattività nel tumore sarà ottimale. A nostro parere, l'esecuzione di immagini rigoroso, o, preferibilmente, esperimenti biodistribuzione acute con la itse anticorpi direttamente marcatolf prima di eventuali esperimenti pretargeting è il modo più affidabile per conoscere la quantità di anticorpi necessaria e l'intervallo di tempo ideale dopo la prima iniezione di anticorpi costrutto. Per masse diverse iniettati di mAb radiomarcato, questi esperimenti fornirà dati concreti sia il passaggio del radioimmunoconjugate dal sangue e l'accumulo nel tumore, consentendo la selezione delle condizioni più promettenti per gli esperimenti pretargeting.

Infine, la farmacocinetica della radiolegante basato tetrazina-devono essere considerati quando si sceglie un radioisotopo adeguato. Nel sistema qui descritto, il radiomarcato Tz-Bn-NOTA frazione è escreto dal corpo attraverso l'intestino con un tempo di dimezzamento biologico di circa 3-4 ore, rendendo ⁶⁴ Cu radioisotopo ad emissione di positroni con la mezza fisico più complementare vita. Purtroppo, il tempo di dimezzamento biologico della frazione tetrazina è troppo lungo per essere compatibile con the più rapidamente decadendo radiometalli ⁶⁸ Ga (t _1/2 = 68 min). In questo caso, qualsiasi radioattività nel tumore decadrebbe attraverso parecchi emivite prima radiolegante eccesso finito compensazione dal corpo. Come risultato, le immagini dovrebbero essere acquisite in momenti iniziali, quando i rapporti di attività tumorale-a-sfondo rimangono bassi ³⁶ Idealmente, le future generazioni di radioleganti tetrazina sarebbero progettati -. Forse via PEGylation, glicazione, o altri mezzi - di espellere dal corpo più rapidamente. Ciò consentirebbe di radiomarcatura con più rapidamente decadono radioisotopi quali ⁶⁸ Ga e ¹⁸ F, che a sua volta migliorare ulteriormente i benefici dosimetriche della strategia di imaging pretargeted. In definitiva, i ricercatori adattare questa tecnologia per l'uso con altri radioisotopi per immagini (ad esempio, ¹²⁴ I, ¹¹¹ In, ¹⁸ F, ⁸⁹ Zr, ⁶⁸ Ga, ecc) o terapia (per esempio, 177 Lu, ²²⁵ Ac, ¹²⁵ I, ecc), dovrà essere sviluppato per integrare diverse chelanti o radiomarcatura gruppi prostetici nuovi leganti a base tetrazina-. L'indagine approfondita della farmacocinetica di questi nuovi costrutti sarà essenziale per assicurare corrispondenze vantaggiose tra le proprietà di liquidazione dei leganti e l'emivita fisica dei radionuclidi.

Alla fine, ci auguriamo vivamente che altri ricercatori vedono la promessa di questa tecnologia pretargeting e impiegano con nuovi sistemi di anticorpo / antigene. Mentre i paragrafi precedenti mostrano che questo processo di adattamento può non essere sempre facile, è nostra convinzione che questo metodo potrebbe avere un impatto significativo sulla imaging nucleare, la terapia radionuclide mirata, e non solo.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	Store at -80 °C