Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Укрощение Bioorthogonal Обратная электронной Demand Дильса-Альдера циклоприсоединения для Pretargeted ПЭТ

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52335
Automatic Translation
*1, 1, *1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Introduction

За последние тридцать лет, позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) стала незаменимым клиническим инструментом в диагностике и лечении рака. Антитела уже давно считаются перспективными векторы для доставки позитронно-эмиссионной радиоизотопов к опухолям из-за своей изысканной сродством и специфичностью для биомаркеров рака. 1,2 Тем не менее, относительно медленные Фармакокинетика в естественных условиях антител обязательное использование радиоизотопов с мульти-день физические периоды полураспада. Это сочетание может дать высокие дозы радиоактивного облучения для нецелевых органов пациентов, что является важным осложнением, что имеет особое клиническое значение, так как radioimmunoconjugates вводят внутривенно и поэтому - в отличие от частичных сканирований тела КТ - результат в поглощенных доз в каждой части тела, независимо от опрошенных тканей.

Для того, чтобы обойти эту проблему, значительные усилия были посвящены развитмат ветствующую защитную эк ПЭТ стратегий изображений, что отделить радиоизотоп и целевой части, таким образом, используя благоприятные свойства антител, одновременно обходя их внутренние ограничения фармакокинетические. Эти стратегии - наиболее часто называют pretargeting или многоступенчатый таргетинг - обычно используют четыре стадии: (1) введение антител, способных связываться как антиген и меченый лиганд; (2) накопление антитела в ткани-мишени и ее выведения из крови; (3) введение радиоактивного небольшой молекулы; и (4) лигирование в естественных радиолиганда с антителом с последующим быстрым выведением избыточных радиолиганда. 3-8 В некоторых случаях, дополнительной очистки агент вводят между этапами 2 и 3, чтобы ускорить выделение любого антитела что до сих пор, чтобы связать опухоли и остается в крови. 5

Вообще говоря, TWО типы pretargeting стратегий являются наиболее распространенными в литературе. В то время как оба оказались успешными в доклинических моделей, они также обладают ключевые ограничения, которые препятствуют их клиническое применение. Первая стратегия опирается на высоким сродством между стрептавидином, конъюгированным антител и биотин-модифицированный радиоактивные метки; Однако иммуногенность стрептавидином-модифицированного антитела, оказалось, беспокойство проблема в связи с переводом. 5,6,9,10 Вторая стратегия, напротив, использует биспецифических антител, которые были генетически сконструированных для связывания как рак биомаркеров антиген и малая молекула с радиоактивной меткой Гаптен. 3,11-14 Хотя этот последний маршрут, конечно, творческий, его широкое применение ограничивается сложностью, расходы, и отсутствие модульности системы.

Недавно мы разработали и опубликовали pretargeted методологии ПЭТ на основе спроса обратная электронного Дильса-Альдера (IEDDA) реакции циклоприсоединения между транс -cyclooctene (TCO) и тетразин (TZ;. Рисунок 1) 11, а сама реакция была известна на протяжении десятилетий, IEDDA химия пережила возрождение в последние годы в качестве метода биоконъюгации нажмите химии, как показано на увлекательная работа из групп Ральф Вейследер, Джозеф Фокс, и Питер Конти среди других. 12-15 IEDDA циклоприсоединение была применена в широком диапазоне параметров, в том числе флуоресценции изображений с пептиды, антитела, и наночастиц, а также ядерные изображений . с обеих radiohalogens и radiometals 16-26 перевязка высокие урожаи, чистый, быстрый (к 1> 30000 M -1 с -1), избирательное, а также - в критическом. - bioorthogonal 27 в то время как число типов клик химии - в том числе Cu-катализируемой азида алкин cycloadditions, процедить раскрученной азида алкин cycloadditions и Штаудингер Лигations -. являются bioorthogonal как хорошо, это уникальное сочетание быстрой кинетики реакции и bioorthogonality, что делает IEDDA химию так хорошо подходит для pretargeting приложений в целых организмах 28,29 Вдоль этих линий, важно отметить, что в недавнем докладе от наших лаборатории не было первым применил IEDDA химию pretargeting: первый доклад pretargeted изображений с IEDDA возник из-за работы Россина, и др, и в нем методологии ОФЭКТ, использующей 111 В-меченого тетразин 30..

Как мы уже говорили выше, pretargeting методология имеет четыре довольно простые шаги (рисунок 2). В протоколе в стороны, pretargeted стратегия для ПЭТ колоректального рака, который использует 64-Си NOTA-меченого тетразин радиолиганда и ТСО-модифицированный конъюгат антитела huA33 будет описано. Однако, в конечном счете модульность этой методологии является одним из его грешь активы, транс -cyclooctene фрагмента может быть добавлена ​​к любой не интернализации антитела и тетразин может быть присоединен к широкому спектру радиоактивных репортеров.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Все в естественных условиях экспериментов на животных, описанных проводились в соответствии с утвержденным протоколом и под этических принципов в Memorial Sloan Kettering онкологический центр Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC).

1. Синтез TZ-BN-НОТА

  1. В небольшой реакционный сосуд, растворите 7 мг NH 2 -bn-Примечание (1,25 х 10 -2 ммоль) в 600 мкл раствора NaHCO 3 буфера (0,1 М, рН 8,1). Проверьте рН раствора. Если необходимо, довести рН раствора до 8,1 с помощью небольших аликвот 0,1 М Na 2 CO 3.
  2. Добавить раствор NH 2 -Bn-NOTA до 0,5 мг TZ-NHS (1,25 × 10 -3 ммоль) в 1,7 мл микроцентрифужных трубки.
    Примечание: Tz-NHS либо могут быть взвешивают сухой или добавлены из маточного раствора сухого ДМФ или ДМСО (<50 мкл).
  3. Разрешить полученный реакционный раствор ют реагировать в течение 30 мин при комнатной температурес мягким агитации.
  4. Через 30 мин, очищают продукт с помощью обращенно-фазовой С18 ВЭЖХ, чтобы удалить непрореагировавший NH 2 -bn-NOTA. NH 2, -Bn-NOTA можно контролировать при длине волны 254 нм, в то время как Tz-NHS и Tz-n-NOTA лучше контролировали при длине волны 525 нм.
    Примечание: время удерживания, очевидно, сильно зависит от установки оборудования ВЭЖХ каждого лаборатории (насосы, колонки, трубы и т.д.). Тем не менее, чтобы представить, например, если градиент 0: 100 MeCN / H 2 O (оба с 0,1% TFA) до 100: 0 MeCN / H 2 O в течение 25 мин и аналитической 4,6 х 250 мм С 18 колонке используется , время удерживания TZ-BN-Нота, TZ-NHS, и NH 2 -Bn-NOTA будет около 15 мин, 16,5 мин и 10 мин, соответственно. Продукт может быть очищен от других компонентов реакционных в любом одном периоде или нескольких трасс с использованием полупрепаративной и препаративной С 18 колонку HPLC. 1 Н-ЯМР, анальныйytical ВЭЖХ и ESI-MS все методы, которые могут быть использованы для проверки чистоты законченного Tz-BN-NOTA предшественника. 11
  5. Замораживание собранную ВЭЖХ элюент с помощью жидкого азота.
  6. Оберните замороженную пробирку в непрозрачной алюминиевой фольги.
  7. Поместите замороженные пробирки в лиофилизации судна O / N, чтобы удалить ВЭЖХ подвижную фазу.
  8. Храните очищенный продукт (ярко-розовый твердый) в темноте при -80 ° C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приемлемо остановочный пункт в процедуре. Завершено Tz-BN-NOTA предшественником является стабильным в течение по крайней мере 1 год в этих условиях.

2. Подготовка huA33-TCO иммуноконъюгат

  1. В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 1 мг / мл (2,7 мМ) раствор TCO-NHS в сухом ДМФ.
  2. В 1,7 мл микроцентрифужных трубки, подготовить 2 мг / мл (13,3 мкмоль) раствор huA33 в 1 мл фосфатно-буферным раствором, рН 7,4 (0,01 М PO 4 3-,
  3. Использование небольших аликвот (<5 мкл) 0,1 М Na 2 CO 3, довести рН раствора антител к 8,8-9,0. Используйте либо индикаторную бумагу или рН-метр с микроэлектродом контролировать рН, и будьте осторожны, чтобы не допустить pH подняться выше рН 9,0.
  4. После того, как раствор антитела при правильном рН, добавить объем раствора ТСО-NHS, соответствующей 8 мол рных эквивалентов активированного сложного эфира. Например, добавьте 7,9 мкл 1 мг Раствор / мл TCO-NHS (1,07 х 10 -7 моль TCO-NHS) к 1 мл раствора 2 мг / мл huA33 антител (1,33 х 10 -8 моль huA33). Не более 5% по объему DMF в растворе.
  5. Аккуратно перемешайте раствор, переворачивая пробирку микроцентрифужных несколько раз.
  6. Оберните микроцентрифужную трубку в непрозрачной алюминиевой фольги.
  7. Разрешить раствор инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре при умеренном перемешивании.
  8. После 1 ч при комнатной температуре, в результате очистки иммуноконъюгата с использованием предварительно упакованные одноразовые Sizе исключение колонка для обессоливания. Во-первых, промыть эксклюзивной колонке, как описано поставщика, чтобы удалить какие-либо консерванты присутствует на колонке при хранении. Затем добавляют в реакционную смесь в колонке гель, промыть колонку с 1,5 мл 0,9% стерильного физиологического раствора, а затем собрать продукт, используя 2 мл 0,9% стерильного солевого раствора в качестве элюента.
    Примечание: Этот шаг даст заполненную huA33-совокупную стоимость владения в виде раствора в 2 мл.
  9. Измерьте концентрацию полученного в результате huA33-ТШО на УФ-Vis спектрофотометр.
  10. Если концентрация выше, желательно, концентрат раствор huA33-TCO с использованием центробежного блок фильтра с молекулярной массой 50000 отсечки.
    Примечание: Важно отметить, что в то время huA33 и множество других известных антител (например, бевацизумаб, трастузумаб, цетуксимаб и J591) очень терпим к концентрированием, агрегация и осаждение может происходить при концентрации и в других случаях. Исследователи, пытающиеся это ProcedЮр с новым антитела должен доверять литературе или их собственных знаний антитела идет речь в отношении того, действительно ли концентрировать антитела.
  11. Храните заполненную huA33-TCO иммуноконъюгат при 4 ° С в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это приемлемо остановочный пункт в процедуре. Завершения МАБ TCO сопряжены должен быть стабильным в течение по крайней мере 3 месяцев в этих условиях хранения.

3. 64 Cu радиоактивной из TZ-BN-НОТА

Примечание: Этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих действий - или при выполнении любых других работ с радиоактивностью - исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

  1. В 1,7 мл трубки микроцентрифужных, подготовить 0,5 мг / мл (723 мкм) решение TZ-BN-НОТА.
  2. В 1,7 мл MicroCentrifuge трубки, добавляют 10 мкл раствора Tz-n-Примечание (5 мкг), чтобы 400 мкл 0,2 М NH 4 OAc рН 5,5 буфер.
  3. В интересах надлежащего радиохимического ноте учета, измерения и регистрации количества радиоактивности в образце с помощью дозы калибратор до и после наступления шагов в приведенной ниже протокола (3,4-3,8). Это поможет с точного определения радиохимических урожайности.
  4. Добавить 2000 мкКи (74 МБк) от 64 Cu в растворе Tz-n-NOTA.
    Примечание: Как правило, [64 Cu] CuCl 2 подается в небольшом объеме (<30 мкл) 0,1 Н HCl, и, таким образом, только небольшие объемы (<10 мкл) этого раствора необходимо для реакции радиоактивной метки. Если крупные объемы [64 Cu] CuCl 2 акции необходимы, реакция радиоактивной терпимо увеличения общего объема реакционной смеси. Тем не менее, значение рН реакционной радиоактивной раствора следует тщательно контролировать, чтобы обеспечитьчто он не упадет ниже рН 4,0.
  5. Разрешить раствор инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре при умеренном перемешивании.
  6. После 10 мин инкубации, очищают продукт с помощью обращенно-фазовой С 18 ВЭЖХ. Время удерживания, очевидно, сильно зависит от установки оборудования ВЭЖХ каждого лаборатории (насосы, колонки, трубы и т.д.). Тем не менее, чтобы представить, например, если градиент 5:95 MeCN / H 2 O (оба с 0,1% TFA) до 95: 5 MeCN / H 2 O в течение 15 мин, используется, время удерживания 64 Cu-Tz- Bn-NOTA должна быть около 9,8 мин, а бесплатно, незакомплексованный 64 Cu будет элюирования с фронта растворителя составляет около 2-4 мин.
  7. С использованием роторного испарителя, удалить ВЭЖХ элюента.
  8. Повторного растворения продукта 64 Cu-Tz-n-NOTA в 0,9% стерильного солевого раствора.
    Примечание: данное 12,7 ч физический период полураспада 64 Cu, это не приемлемо остановочный пункт в процедуре. Выполните синтез 64 Cu-TZ-BN-НЕНепосредственно перед инъекцией радиоактивного и следовать шаг за 3,7 сразу за шагом 4,5.

4. В Vivo Pretargeted ПЭТ

Примечание: Как и в разделе 3 протокола, этот шаг протокола включает обработку и манипулирование радиоактивности. Перед выполнением этих шагов исследователи должны консультироваться с Департаментом радиационной безопасности их дома учреждения. Принять все возможные меры для сведения к минимуму воздействия ионизирующего излучения.

  1. В женской бестимусных голых мышей, подкожно имплантата 1 х 10 6 SW1222 колоректального рака клеток и позволить им расти в 100-150 мм 3 ксенотрансплантате (9-12 дней после прививки). 11
  2. Развести аликвоту раствора huA33-ППО от протокола разделе 2 до концентрации 0,5 мг / мл в 0,9% стерильного солевого раствора.
  3. Вводят 200 мкл раствора huA33-TCO (100 мкг) в хвостовую вену ксенотрансплантата мыши, несущей,
  4. Разрешить 24 ч для накопления huA33-ТШО в опухоли мыши.
  5. Развести 64 Cu-Tz-n-NOTA радиолиганда в концентрации 1,5 мКи / мл в 0,9% стерильного солевого раствора.
  6. Вводят 200 мкл 64 Cu-Tz-n-NOTA раствора радиолиганда (300 мкКи; 11,1 МБк; 1,6 нмоль 64 Cu-TZ-BN-Нота, при условии, удельную активность 6,7 МБк / нмоль) в хвостовую вену ксенотрансплантат мышей, несущих.
  7. В момент времени желательно изображений (например, 2, 6, 12 или 24 ч после инъекции), обезболить мышь с 2% изофлуран: газовую смесь кислорода.
  8. Наведите на кровати маленькое животное ПЭТ сканера. Поддержание анестезии во время сканирования с использованием 1% в ИФ: газовую смесь кислорода. До размещения животное на планшете сканера, убедитесь, анестезии по методу схождение щепотку и применять ветеринарный мазь для глаз мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии.
  9. Приобретать данные ПЭТ для мыши с помощью статическогосканирование с минимумом 20000000 совпадающих событий, используя окно энергии 350-700 кэВ и временную окно совпадение 6 нс. После завершения сделки по приобретению изображения, не оставляйте мышь без присмотра и не кладите его в клетку с другими мышами, пока он не пришел в сознание.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Начальные три этапа эксперимента - синтез TZ-BN-Нота, сопряжения ТШО huA33, и радиомечения в TZ-BN-НОТА построить (рис 3 и 4) - отличаются высокой надежностью. В случае описанной выше процедуре, конструкция Tz-n-NOTA был синтезирован с высоким выходом и чистотой. HuA33 антитела был изменен с 4,2 ± 0,6 TCO / монАТ, и Tz-n-NOTA метили с 64 Cu с получением очищенного радиолиганда в> 99% радиохимической чистоты,> 85% распада-скорректированный выход, и удельная активность ~ 6,7 МБк / нмоль (фиг.5). Реактивность конъюгата huA33-ППО и тетразин радиолиганда могут быть проверены с помощью радиоактивного мгновенный тонкослойной хроматографии (МТЛЦ). Это делается путем смешивания меченного радиоактивным изотопом тетразин (100 мкКи; 0,55 нмоль, при условии, удельную активность 6,7 МБк / нмоль) с небольшим избытком huA33-TCO (50 мкг; 0,66 нмоль) в телosphate-солевой буфер (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 5 мин. Тогда, приблизительно 1 мкКи раствора наносили на обращенно-фазовой C 18 ТСХ пластинки и дают высохнуть. ТСХ провод т в 9: 1 MeCN: H 2 O, и планшет анализировали с помощью ТСХ радиоактивный планшет-ридера. Если реакция нажмите работает, как и планировалось, лигировали 64 Cu-Нота-A33 должны оставаться в базовых данных; Если, с другой стороны, реакци не может, свободный 64 Cu-Tz-n-NOTA появится на или вблизи передней растворителей.

Переходя к в естественных условиях экспериментов с изображениями, в методике, описанной выше, были использованы бестимусных голых мышей, несущих A33 антиген-экспрессирующих, SW1222 ксенотрансплантаты колоректального рака. Как острый биораспределение (п = 5 в момент времени) и ПЭТ (п = 12) эксперименты показывают, что pretargeting стратегия способна разграничения колоректального рост опухоли с отличной контрастностью изображения и высокой скорости передачи данных опухолевой активности к фону (рис 6). Поглощение в 64 Cu-TZ-BN-НОТА в опухоли очевидно на ранних временных точках: 3,5% ± 0,6% ИД / г и 4,1% ± 0,6% ИД / г в 1 ч и 4 ч после инъекции, соответственно. Тем не менее, в этих ранних точек, легко видно из-за количества радиоактивности очистки через кишечный тракт мыши (11,9% ± 4,4% ИД / г и 8,8% ± 3,4% ИД / г в кале в 1 ч и 4 ч пи, соответственно). В течение нескольких часов, избыток радиолиганд очищает через фекалии (1,4% ± 0,5% ID / г при 24 ч пи), и опухоль становится наиболее характерной чертой в изображении (4,0% ± 0,9% ID / г в 24 ч PI). В этих более поздних временных точках, опухоль хорошо очерчены в изображении, и отношения опухолевой активности к фону довольно высокие; Например, стратегия дает опухоли: мышечные отношения 26,6 ± 6,6 на 12 ч пи и 27,0 ± 7,4 при 24 ч пи Не удивительно, что контрольные эксперименты с использованием только 64 Cu-TZ-BN-Нота, неспецифических антител, ØR huA33 без сопряженных ТШО фрагментов все это привело к минимальной поглощения в опухоли.

Как будет рассмотрено ниже, это pretargeting стратегия - как и все pretargeting стратегий - имеет несколько переменных, которые требуют оптимизации применительно к новым системам антитела / антиген. Два из наиболее важными являются масса мАт-ППО конструкции впрыскиваемого а длина интервала между инъекцией конструкции мАт-ППО и инъекции радиоактивного лиганда. Если количество мАт-ППО конъюгата слишком высокой или временной интервал между инъекциями слишком короткий, количество свободного MAB-TCO в крови повышается, и вероятность щелчка реакций, происходящих в крови, а не в увеличении опухоли. Например, в системе 64 Cu / huA33 обсуждается здесь, как введение 300 мкг huA33 (вместо 100 мкг) или использованием 12 ч интервала времени (вместо 24 ч) привели к заметному увеличению тон количество радиоактивности, видимой в сердце мыши (рис 7А и 7В, соответственно). В обоих этих случаях реакция нажмите еще четко происходит в опухоли, как показано на сумму опухолевого поглощения на ранних временных точек; Однако формирование меченного антитела в крови также очевидно. Хотя это заманчиво, чтобы закрыть, потому что радиоактивно антитела образуются в крови будет по-прежнему в конечном итоге найти свой путь к опухоли, это несколько поражения цели с помощью pretargeting методологии, как они радиоактивно антитела будут циркулировать медленно, прежде чем он достигнет опухоли и тем самым повысить мощности дозы для нецелевых органов. С другой стороны, если используется слишком мало антител, количество поглощения в опухоли, естественно, страдает. Чрезмерно длительное время интервала может также уменьшить уровень поглощения опухоли в результате медленного интернализации антитела, transcyclooctene изомеризации, или антитела / антиген вихрей. Диагноз гоESE проблемы является более сложным и не может быть достигнуто лишь посредством изучения данных ПЭТ. Очевидно, что тонкий баланс должен быть сохранен. Поэтому, рекомендуется, что любые следователи пытаются применять эту стратегию для нового антитела / системы антигена используют большое количество МАБ-TCO конструкции (≥ 200 мкг) и коротким временем интервал (≤ 24 ч) в качестве отправных точек и оптимизации оттуда.

Рисунок 1
Рисунок 1. обратной электронно-спрос Дильса-Альдера [4 + 2] циклоприсоединения нажмите перевязки между тетразин и transcyclooctene.

Фиг.2
Рисунок 2. Иллюстрация из четырех этапов pretargeting методологии. Эта цифра основана на исследованиях, первоначально опубликованной в JNM. Zeglis, Б. М. и др. Барельефы стратегии создания A pretargeted ПЭТред на bioorthgonal клик химии Дильса-Альдера. Журнал ядерной медицины. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 Обществом ядерной медицины и молекулярной визуализации, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Схема для модификации huA33 с ТШО-NHS.

Рисунок 4
Рисунок 4. Схема для синтеза и 64 Cu радиомечения из TZ-BN-НОТА. Эта цифра основана на исследованиях, первоначально опубликованной в JNM. Zeglis, Б. М. и др. Pretargeted стратегия ПЭТ на основе bioorthgonal Дильса-Альдера нажмите химию. Журнал ядерной медицины. 54, 1389-1396 (2013). И# 169; 2013 Обществом ядерной медицины и молекулярной визуализации, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. радио-ВЭЖХ следов очищенной 64 Cu-TZ-BN-НОТА.

Рисунок 6
Рисунок 6. ПЭТ изображения 64 Cu-TZ-BN-НОТА / A33-TCO pretargeting стратегии. Мышей, несущих подкожные SW1222 ксенотрансплантаты (100-150 мм 3) вводят huA33-совокупную стоимость владения (100 мкг) через инъекции в хвостовую вену. После 24 часов, одни и те же мышам вводили 64 Cu-TZ-BN-Примечание (10.2-12.0 МБк [275-325 мКи]) через инъекции в хвостовую вену, а затем в образ 2, 6, 12 и 18 ч после введения радиофармацевтический. Трansverse (вверху) и корональные (внизу) плоские образы которых пересекают центр опухолей. Высокие уровни поглощения в кишечнике на ранних временных точках (т.е., 2 и 6 ч) в значительной степени ясно 12 ч, оставляя опухоль (белая стрелка) четко очерченное от всех не-ткани-мишени на 12 и 18 ч после инъекции. Эта цифра основана на исследованиях, первоначально опубликованной в JNM. Zeglis, Б. М. и др. Pretargeted стратегия ПЭТ на основе bioorthgonal Дильса-Альдера нажмите химию. Журнал ядерной медицины. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 Обществом ядерной медицины и молекулярной визуализации, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7
Рисунок 7. ПЭТ изображения неоптимальных экспериментов pretargeting. () Мыши BEAкольцо подкожные SW1222 ксенотрансплантатов (100-150 мм 3, стрелка) вводили huA33-TCO (100 мкг) с помощью инъекции в хвостовую вену. После 12 ч, одни и те же мышам вводили 64 Cu-TZ-Bn-Примечание (10.2-12.0 МБк [275-325 мкКи]) инъекции в хвостовую вену. (B) мышей, несущих подкожные SW1222 ксенотрансплантаты (100-150 мм 3, стрелка) вводили А33-совокупную стоимость владения (300 мкг) через инъекции в хвостовую вену. После 24 ч, одни и те же мышам вводили 64 Cu-TZ-Bn-Примечание (10.2-12.0 МБк [275-325 мкКи]) инъекции в хвостовую вену. В обоих случаях мышей были обследованы 12 ч после инъекции 64 Cu-TZ-BN-НОТА. В обеих панелях поперечных (вверху) и корональной (внизу) плоские образы которых пересекают центр опухолей. В то время как pretargeting стратегия четко разграничивает опухоли в обоих случаях результаты в обоих этих изображений некондиционных по сравнению с теми, показано на рисунке 6. В обоих 7А и 7В, существуетЗначительное количество поглощения фон активности в центре. В условиях 7А, это, скорее всего, результат huA33-TCO построить не дали достаточно времени, чтобы локализовать в опухоли. В условиях фиг.7В, это, вероятно, следствием введение слишком много huA33-совокупную стоимость владения и обладания излишними иммуноконъюгат по-прежнему циркулирует в крови даже через 24 часа после инъекции. Эта цифра основана на исследованиях, первоначально опубликованной в JNM. Zeglis, Б. М. и др. Pretargeted стратегия ПЭТ на основе bioorthgonal Дильса-Альдера нажмите химию. Журнал ядерной медицины. 54, 1389-1396 (2013). 2013 Обществом ядерной медицины и молекулярной визуализации, Inc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Основным преимуществом этого pretargeted стратегии ПЭТ является то, что он способен разграничения опухоли с целевой к фону контрастности изображения на только часть фонового излучения дозы производится непосредственно меченых антител. Например, в колоректального рака системы формирования изображения, описанного здесь, данные острых опытах биораспределению были использованы для выполнения вычислений для дозиметрии стратегии pretargeting 64 Cu-основе, а также непосредственно меченного 64 Cu-NOTA-huA33 и 89 Zr-ДФО-huA33. Эти расчеты ясно проиллюстрировать дозиметрических преимущества pretargeting системы, особенно по сравнению с более клинически значимых 89 Zr-меченым антителом. Эффективная доза pretargeting стратегии 0,0124 мЗв / МБк, в то время как 89 Zr-ДФО huA33 составляет более 30 раз выше: 0,4162 мЗв / МБк. Дозиметрический преимущество pretargeting менее выражены по сравнению с 64 Cu-меченыхntibody (0,0359 мЗв / МБк), хотя благоприятный эффект все еще существует.

Одним из наиболее значимых преимуществ этого IEDDA pretargeting методологии является ее модульность: транс -cyclooctene может быть добавлен к любому антитела, которые не интернализации и широкий спектр грузов могут быть присоединены к тетразин. Действительно, наша главная мотивация для написания этого протокола, с тем чтобы другие исследовательские группы используют этот метод с различными системами антитела / антиген / радиоизотопных. Вдоль тех линий, мы считаем, что имеет решающее значение для решения ряда вопросов, которые исследователи должны учитывать при адаптации этой методологии для других систем.

Во-первых, выделение антитела является чрезвычайно важным. Проще говоря, антитела должны быть не усваивая или усвоены в очень медленном темпе. В то время как идеальным кинетические параметры еще предстоит определить, антитела и реактивной транс -cyclooctene он несет должен оставаться навне клетки, для интернализации и секвестрации антитела до инъекции радиоактивного лиганда бы значительно уменьшить количество в естественных нажимают реакций. В системе, описанной здесь, цели антител huA33 и связывается с А33 антигена, трансмембранного гликопротеина, выраженного в> 95% всех колоректального рака. Важно отметить, что, как было показано, что даже после связывания своей цели, huA33 комплекса антитело / антиген остается на поверхности клетки в течение нескольких дней. 31-33 В то время как необходимость в не-интернализации антитела, по общему признанию ограничение стратегии, Широкое разнообразие не-интернализации антител известны, возможно, наиболее особенно TAG72-таргетинга СС49 антитела, которые Rossin и др. исследовали на их превосходной pretargeting работы. 30,34,35

Во-вторых, это pretargeting стратегия - как и любой другой - требует значительных оптимизации. В дополнение к личности аntibody и тетразин радиолиганда, два важных переменных должны быть рассмотрены: количество антитела вводят и временной интервал между инъекциями антителом и меченым лигандом. Мы обратились обе эти переменные в разделе выше репрезентативные результаты, но кратко повторим, если используется либо слишком много антител или слишком короткий промежуток времени, значительные суммы МАБ-TCO, сопряженных останется в крови во время инъекции радиолиганда. Это, в свою очередь, приведет к в естественных нажмите лигирование происходит в крови, а не в опухоли, образуя циркулирующий радиоактивно меченного антитела, которые будут медленно накапливаться в опухоли с течением времени. И наоборот, если используется либо слишком мало антитело или слишком долго временной интервал, конечный Количество радиоактивности в опухоль будет неоптимальным. По нашему мнению, выполнение строгого изображений или предпочтительно, острых опытах биологического распределения с непосредственно с надписью Ице антителLF до каких-либо pretargeting экспериментов самый надежный способ узнать о количестве антитела, необходимые и идеальной интервала времени после первой инъекции антител конструкции. Для различных вводимых масс меченого МАБ, эти опыты позволяют конкретные данные как на клиренса radioimmunoconjugate из крови и ее накопления в опухоли, что позволяет для отбора наиболее перспективных условий для pretargeting экспериментов.

Наконец, фармакокинетики тетразин на основе радиоактивного необходимо учитывать при выборе подходящего радиоактивного изотопа. В системе, описанной здесь, радиоактивно Tz-n-NOTA фрагмент выводится из организма через кишечник с биологического полураспада примерно 3-4 ч, что делает 64 Cu позитрон-излучающих радиоизотопов с наиболее дополнительного физического половинного жизнь. К сожалению, биологический период полураспада по тетразин фрагмента слишком велик для того, чтобы быть совместимым с гоE Больше стремительно разлагаться радиоактивный 68 Ga (T 1/2 = 68 мин). В этом случае, любой радиоактивность в опухоли будет затухать через несколько полураспада до избыток радиолиганда закончил очистки от тела. В результате, изображения должны быть приобретены на ранних моментов времени, когда опухоль к фону коэффициенты активности остается низким 36 В идеале, будущие поколения тетразина радиолиганда будет разработан -., Возможно, с помощью ПЭГ, гликирования, или другими способами - выводить из организма быстрее. Это позволит радиоактивной более быстро убывающих радиоактивными изотопами, как 68 Ga и 18 F, который, в свою очередь, дальнейшего повышения дозиметрические преимущества pretargeted стратегии создания. В конечном счете, как исследователи адаптировать эту технологию для использования с другими радиоизотопов для визуализации (например, 124 I, 111 В, 18 F, 89 Zr, 68 Ga, и т.п.) или терапии (например, 177 Lu, 225 Ac, 125 I и т.д.), новые тетразина основе лиганды должны быть разработаны, чтобы включить различные энтеросорбенты или радиоактивной протезно групп. Тщательное расследование фармакокинетики этих новых конструкций будет иметь важное значение для обеспечения выгодных матчи между оформления свойств лигандов и физического полураспада радионуклидов.

В конце концов, мы очень надеемся, что другие исследователи увидеть перспективность этого pretargeting технологии и использовать его с новыми системами антитела / антиген. В то время как в предыдущих пунктах, показывают, что этот процесс адаптации не всегда может быть просто, это наше убеждение, что эта методология может оказать значительное воздействие на ядерную изображений, предназначенную радионуклидной терапии, и за его пределами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Tags

Биоинженерия выпуск 96 позитронно-эмиссионная томография выберите химии Pretargeting тетразин,
Укрощение Bioorthogonal Обратная электронной Demand Дильса-Альдера циклоприсоединения для Pretargeted ПЭТ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. … More

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter