Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing

Published: February 3, 2015 doi: 10.3791/52335
Automatic Translation
*1, 1, *1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center
* These authors contributed equally

Introduction

Son otuz yılda, pozitron emisyon tomografisi (PET) kanser tanı ve tedavisinde vazgeçilmez bir klinik bir araç haline gelmiştir. Antikorlar uzun kanser biyomarkerların onların zarif yakınlık ve özgüllük nedeniyle tümörlere pozitron yayan radyoizotop teslimi için umut verici vektörleri olarak kabul edilmiştir. Antikorların 1,2 Ancak, nispeten yavaş in vivo farmakokinetiği çoklu-gün radyoizotop kullanılmasını zorunlu kılmaktadır fiziksel yarı-ömürleri. Kısmi vücut BT aksine - - Bu kombinasyon hastalarda hedef olmayan organlar, radioimmunoconjugates intravenöz ve bu nedenle enjekte edilir çünkü özel klinik önemi olan önemli bir komplikasyon yüksek radyasyon dozları verebilir sonucu emilen dozlarda vücudun her yerinde, sorguya dokuların bakılmaksızın.

Bu sorunu aşmak için, önemli çaba develo ithaf edilmiştirAynı anda kendi içsel farmakokinetik sınırlamaları süpürgelik ederken böylece antikorların avantajlı özelliklerini yararlanarak, radyoizotop ve hedefleme parçasını ayrıştırarak PET görüntüleme stratejilerinin pment. Bu stratejiler, - genellikle pretargeting ya da birkaç aşamalı hedefleme olarak adlandırılan - tipik haliyle dört adımı kullanır: (1) bir antijen ve bir radyo-iki bağlayabilen bir antikorun uygulanması; (2) hedef doku ve kan onun izni antikorun birikimi; (3) bir küçük moleküllü radyoligandın yönetimi; ve (4), fazla radyoligandın hızlı bir temizlenme ile. Bazı durumlarda, 3-8 ve ardından antikorun Radyoligandın in vivo bağlanması, ek bir temizleme maddesi, herhangi bir antikorun atılımını hızlandırmak amacıyla, aşama 2 ve 3 arasında enjekte Bu tümör bağlamak için henüz ve kanda kalır. 5

Genel olarak, tw konuşmapretargeting stratejilerin o tipleri edebiyatının en yaygındır. Her iki klinik öncesi modellerde başarılı olmuş olsa da, onlar da kendi klinik uygulanabilirliği engellemiştir anahtar sınırlamaları sahip. İlk strateji, streptavidin-konjuge antikor ve biyotin ile modifiye edilmiş radyo etiketlerin arasında yüksek afinite ile dayanır; Bununla birlikte, streptavidin ile modifiye edilmiş antikorların bağışıklık çeviri ilişkin endişe verici bir sorun olduğu görülmüştür. 5,6,9,10 İkinci strateji, aksine, bir kanser, her iki bağlanma genetik olarak inşa edilmiş, bispesifik antikorları kullanır Bu ikinci yol kesinlikle yaratıcı iken biyobelirteç antijen ve küçük molekül radyoaktif işaretli hapten. 3,11-14, geniş uygulanabilirliği sistemi modülerlik karmaşıklığı, gider ve eksikliği ile sınırlıdır.

Son zamanlarda, biz geliştirdik ve (ters elektron talebi Diels-Alder dayalı I bir pretargeted PET görüntüleme metodolojisini yayınladıEDDA) trans -cyclooctene (TCO) ve tetrazin (Tz arasındaki sikloadisyon reaksiyonu;. Gösterildiği gibi Şekil 1) 11 reaksiyon kendisi yıllardır bilinen olsa da, IEDDA kimya, bir tıklama kimya bioconjugation tekniği olarak son yıllarda bir rönesans yaşadı Ralph Weissleder, Joseph Fox, ve peptidler, antikorlar ve nanopartiküller ile floresan görüntüleme dahil 12-15 IEDDA Siklokatılma ayarları geniş bir yelpazede uygulanmıştır. diğerleri arasında Peter Conti gruplarının büyüleyici çalışmaları yanı sıra nükleer görüntüleme .. 27 bioorthogonal Ve tıklama kimya türde bir dizi ise - eleştirel - radiohalogens ve radiometals hem 16-26 ligasyon, verimli, yüksek, temiz, hızlı (k 1> 30.000 M -1 sn -1), seçici ve bir - Cu-katalize azid-alkin siklokatılma, gerilme-terfi azid-alkin siklokatılma ve Staudinger lig dahilations -. o bütün organizmalar uygulamaları pretargeting çok uygundur IEDDA kimya yapar hızlı reaksiyon kinetiği ve bioorthogonality eşsiz kombinasyonu, hem de bioorthogonal olan bu doğrultuda 28,29, bu son raporuna dikkat etmek önemlidir bizim laboratuarlar pretargeting için IEDDA kimya uygulamak için ilk değildi:. IEDDA ile pretargeted görüntüleme ilk rapor Rossin çalışmaları, vd ortaya çıktı ve bir 111 yılında etiketli tetrazin kullanan bir SPECT metodolojisi özellikli 30.

Yukarıda ele alındığı gibi, pretargeting yöntemi dört oldukça basit adımları içerir (Şekil 2) sahiptir. Eldeki protokolde, 64 Cu NOTA etiketli tetrazin radyoligand ve huA33 antikorun bir TCO modifiye edilmiş konjügat kullanmaktadır kolorektal kanser, PET görüntülemesi için bir pretargeted strateji tarif edilecektir. Ancak, bu yöntemin sonuçta modülerliği kendi gr biridirtrans--cyclooctene kısım olarak eatest varlıklar olmayan içe antikora eklenebilir ve tetrazin radyoaktif muhabir çeşitli eklenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ETİK TABLOSU: anlatıldığı in vivo hayvan deneyleri Tüm onaylanmış protokole ve Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) etik kurallar altında göre yapıldı.

Tz-Bn-Nota 1. Sentezi

  1. Küçük bir tepkime kabında, 600 ul NaHCO 3 tamponu (0.1 M, pH 8.1) içinde 7 mg NH2 -Bn-nota (1.25 x 10 -2 mmol) ile çözülür. Çözeltinin pH kontrol edin. Gerekirse, CO 3 0.1 M Na-2 az miktar kullanılarak 8.1 solüsyonun pH derecesinin ayarlanması.
  2. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.5 mg Tz-NHS (1.25 x 10 -3 mmol) NH2 -Bn-NOTA solüsyonu ekleyin.
    Not: Tz-NHS, kuru ya tartıldı ve kuru DMF ya da DMSO (<50 ul) içindeki bir stok çözeltisi eklenebilir.
  3. Elde edilen reaksiyon çözeltisi, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca reaksiyona girmesine izinHafif ajitasyon ile.
  4. 30 dakika sonra, reaksiyona girmeyen NH2 -Bn-nota çıkarmak için ters-fazlı C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Tz-NHS ve Tz-Bn-NOTA en 525 nm dalga boyunda gözlemlenmiştir ise NH2 -Bn-NOTA, 254 nm bir dalga boyunda izlenebilir.
    NOT: Tutma süreleri açıkça her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için ise 0 gradyanı: 100 MeCN / H2O 100 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 0 MeCN / H2O içinde 25 dakika ve analitik bir 4.6 x 250 mm C18 kolon kullanılmıştır , Tz-Bn-nota, Tz-NHS ve NH2 tutma süreleri -Bn-NOTA sırasıyla yaklaşık 15 dakika, 16.5 dakika ve 10 dakika olacaktır. Ürün tek bir çalışma ya da bir yarı-hazırlayıcı veya hazırlayıcı C18 HPLC kolonu kullanılarak birden çok çalışır, ya da diğer reaksiyon bileşenlerine de saflaştırılabilir. 1H-NMR, analistenen analitik HPLC ve ESI-MS tamamlanmış Tz-Bn-NOTA ön-maddelerin saflığının doğrulanması için kullanılır ve yöntemlerdir. 11
  5. Sıvı azot kullanılarak toplanan HPLC yıkama sıvısı dondurun.
  6. Opak alüminyum folyo dondurulmuş toplama tüpü sarın.
  7. Bir liyofilize damar O donmuş toplama tüpü yerleştirin / N HPLC mobil faz kaldırmak için.
  8. -80 ° C'de karanlıkta saflaştırılmış ürünü (bir katı parlak pembe) saklayın.
    NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan Tz-Bn-NOTA ön-madde, bu koşullar altında en az 1 yıl stabildir.

HuA33-TCO immünokonjugatın 2. Hazırlık

  1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 1 mg / ml kuru DMF TCO-NHS'nin (2,7 mM) çözeltisi hazırlayın.
  2. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, bir 2 mg / ml fosfat tamponlu tuzlu su, 1 ml huA33 arasında (13.3 uM) çözeltisi, pH 7.4 (0.01 M PO 4 3- hazırlamak
  3. Az miktar 0.1 M Na-2 CO 3 (<5 ul) kullanılarak, 8,8-9,0 antikor solüsyonun pH derecesinin ayarlanması. PH değerini izlemek için bir mikroelektrot ile pH kağıdı veya pH metre ya kullanın ve pH, 9.0 üzerinde yükselmeye izin vermemek için dikkatli olun.
  4. Antikor çözeltisi doğru pH değerinde sonra, aktive edilmiş ester 8 molar eşdeğer tekabül TCO-NHS bir çözelti hacminin ilave edin. Örneğin, 2 mg / ml huA33 antikor çözeltisi (1.33 x 10 -8 mol huA33), 1 ml için 1 mg / ml bir TCO-NHS çözeltisi (1.07 x 10 -7 mol TCO-NHS), 7.9 ul ekleyin. Çözelti içinde hacme göre% 5 DMF aşılmamalıdır.
  5. Yavaşça mikrosantrifüj tüpü birkaç kez ters yüz edilerek çözelti karıştırılır.
  6. Opak alüminyum folyo mikrosantrifüj tüp sarın.
  7. Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona izin verin.
  8. Oda sıcaklığında 1 saat sonra, bir önceden paketlenmiş tek SIZ kullanılarak elde edilen immünokonjugat arındırmakE dışlama kullanımlık tuz alıcı sütun. Depolama sırasında sütun üzerinde mevcut olan herhangi bir koruyucu çıkarmak için satıcı tarafından tarif edildiği gibi İlk olarak, boyut dışlama sütununa yıkayın. Daha sonra, boyut dışlama sütununa reaksiyon karışımına ilave edildi, 1.5 ml% 0.9 steril tuzlu su ile sütun durulama ve daha sonra, yıkama sıvısı olarak% 0.9 steril tuzlu su içinde 2 ml kullanılarak ürün toplamak.
    NOT: Bu adım, bir 2 ml solüsyon olarak tamamlanan huA33-TCO verecektir.
  9. UV-Vis spektrofotometre üzerinde bileşke huA33-TCO konsantrasyonunu ölçün.
  10. Daha yüksek bir konsantrasyonu, arzu edildiği takdirde, 50,000 molekül ağırlığı kesmesi olan bir santrifüj filtre birimi kullanılarak huA33-TCO çözelti konsantre edilir.
    NOT: huA33 ve diğer iyi bilinen antikor (örneğin, bevasizumab, trastuzumab, setuksimab, ve J591) 'in bir dizi konsantre edilmeden çok dayanıklı iken, toplama ve çökelme diğer durumlarda konsantrasyonuna bağlı olabileceğine dikkat etmek önemlidir. Araştırmacılar bu proced çalışılıyorYeni bir antikor ile ure edebiyat veya antikor konsantre olsun veya olmasın ile ilgili söz konusu antikorun kendi bilgi güvenmeli.
  11. Karanlıkta 4 ° C'da tamamlanmıştır huA33-TCO immüno saklayın.
    NOT: Bu prosedür kabul edilebilir bir durak noktasıdır. tamamlandıktan mAb TCO konjügat, bu saklama koşulları altında en az 3 ay boyunca stabil olmalıdır.

Tz-Bn-Nota 3. 64 Cu Radyo-etiketlenmesi

NOT: protokolün Bu adım işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Veya radyoaktivite ile başka bir işi yapan - - Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.

  1. 1.7 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 0.5 mg / ml (723 uM) t-Bn-nota bir solüsyon hazırlanır.
  2. 1.7 mi microC olarakentrifuge tüp, 0.2 M NH4OAc, pH 5.5 tampon maddesi, 400 ul Tz-Bn-NOTA çözeltisi (5 ug) ve 10 ul ekle.
  3. Uygun radyokimyasal not tutma adına, ölçmek ve önce ve aşağıda protokol (3.4-3.8) olarak izleyen adımlardan sonra bir doz kalibratörü kullanılarak numune radyoaktivite miktarı kaydedin. Bu radyokimyasal verimi doğru kararlılıkla yardımcı olacaktır.
  4. Tz-Bn-NOTA çözeltisine 64 Cu 2,000 uCi (74 MBq) ekleyin.
    Not: Genellikle, [64 Cu] CuCl 2 0.1 N HCI küçük bir hacimde (<30 ul) temin edilir, ve bu nedenle sadece küçük miktarlarda (<10 | il), bu stok çözeltisi, radyo-etiketleme reaksiyonu için ihtiyaç vardır. [64 Cu] CuCI 2 stokunun büyük hacimler gerekiyorsa, Radyoetiketleme reaksiyonu genel reaksiyon hacmi artan hoşgörülü olduğunu. Bununla birlikte, radyo-etiketleme, reaksiyon çözeltisinin pH'ı sağlamak için dikkatle izlenmelidiro pH 4.0 altına düşmemesi.
  5. Çözelti, hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyona izin verin.
  6. Kuluçkadan 10 dakika sonra, ters-fazlı C18 HPLC kromatografisini kullanarak ürünü temizler. Alıkoyma süreleri Açıkçası her laboratuvar (pompalar, sütunlar, tüp, vb) HPLC ekipman kurulumu son derece bağlıdır. Bununla birlikte, bir örnek sunmak için, eğer bir gradyan 5:95 MeCN / H2O 95 (her ikisi de% 0.1 TFA ile birlikte): 5 MeCN / H2O: 15 dak boyunca kullanılan, 64 Cu TZ retansiyon süresi Serbest, kompleks 64 Cu yaklaşık 2-4 dk çözücü ön Zehir olurken Bn-NOTA civarında 9.8 dakika olmalıdır.
  7. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak, HPLC yıkama sıvısı çıkarın.
  8. % 0.9 steril tuzlu su içinde 64 Cu-Tz-Bn-NOTA ürün içinde yeniden çözülür.
    NOT: 64 Cu 12.7 saat fiziksel yarılanma ömrü göz önüne alındığında, bu prosedürde kabul edilebilir bir durak noktası değildir. 64 sentezini Cu-Tz-Bn-DEĞİL gerçekleştirinBir radyoligandın enjeksiyonundan hemen önce ve Adım 4.5 hemen 3.7 Adım takip.

Vivo Pretargeted PET Görüntüleme 4.

NOT: Protokol Bölüm 3 gibi, protokol, bu adımı işlenmesini ve radyoaktivite manipülasyonu içerir. Bu adımları gerçekleştirmeden önce araştırmacılar kendi kurumun Radyasyon Güvenliği Bölümü ile başvurmalısınız. Iyonize radyasyona maruziyeti en aza indirmek için mümkün olan tüm adımları atın.

  1. Ve bir kadın atimik çıplak fare, deri altı implantı 1 x 10 6 SW1222 kolorektal kanser hücreleri bu (9-12 gün aşılamadan sonra) 100-150 mm 3 xenograftlarının içine büyümeye izin verin. 11
  2. % 0.9 steril tuzlu su içinde 0.5 mg / ml'lik bir konsantrasyona kadar Protokolü Bölüm 2 huA33-TCO çözeltisi bir kısım seyreltin.
  3. Ksenograft taşıyan fare kuyruk venine huA33-TCO çözeltisi 200 ul (100 ug) enjekte.
  4. Fare tümör huA33-TCO birikimi için 24 saat izin verin.
  5. % 0.9 steril tuzlu su içinde, 1.5 mCi / ml 'lik bir konsantrasyona kadar 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand seyreltin.
  6. Kuyruk damarına (6.7 MBq / nmol bir özgül etkinliğe varsayarak, 64 Cu-Tz-Bn-nota 1.6 nmol;, 11.1 MBq 300 uCi) 64 Cu-Tz-Bn-NOTA radyoligand çözeltisi 200 ul enjekte nakil doku taşıyan kobay fareler.
  7. Istenen görüntüleme zaman noktasında (örneğin, 2, 6, 12 ya da 24 saat sonra enjeksiyon), bir% 2 izofluran ile anestezi fare: oksijen gazı karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
  8. Küçük hayvan PET tarayıcı yatağının üzerinde fare yerleştirin. Oksijen gazı karışımı:% 1 izofluran kullanarak tarama sırasında anestezi koruyun. Tarayıcı yatakta hayvan yerleştirerek önce, ayak-tutam yöntemi kullanılarak anestezi doğrulamak ve anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözlerine veteriner merhem uygulayın.
  9. Statik aracılığıyla fare PET veri elde350-700 keV enerji penceresi ve 6 nsaniye bir tesadüf zamanlama penceresini kullanarak 20 milyon tesadüf olaylar minimum tarayın. Görüntü yakalanmasını tamamladıktan sonra, gözetimsiz fare bırakmayın ve bilinci kazanmış kadar diğer fareler ile bir kafese koymayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deneyin ilk üç adım - Tz-Bn-Nota, huA33 için TCO konjugasyonun sentezi ve Tz-Bn-Nota Radyoaktif (Şekil 3 ve 4) inşa - son derece güvenilir. Yukarıda tanımlanan prosedüre durumunda, Tz-Bn-NOTA yapısı yüksek verim ve saflıkta sentezlendi. ~ huA33 antikoru 4.2 ± 0.6 TCO / mAb ile değiştirilmiş olan, ve Tz-Bn-NOTA,>% 85 bozulma düzeltilmiş verim, ve bir spesifik aktivite>% 99, radyokimyasal saflık saflaştırılmış radyoligand vermek üzere 64 Cu ile radyo-etiketli olduğu 6.7 MBq / nmol (Şekil 5). huA33-TCO eşleniğinin reaktiflik ve tetrazin radyoligand radyoaktif Anında ince katman kromatografisi (ITLC) kullanılarak test edilebilir. HuA33-TCO hafif fazlası ile, (6.7 MBq / nmol bir özgül etkinliğe varsayarak, 0.55 nmol, 100 uCi) bu radyo-etiketli tetrazin karıştırılarak yapılır (50 ug, 0.66 nmol) phosphate-tamponlu tuzlu su, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (pH 7.4) eklenmiştir. Daha sonra, çözeltinin yaklaşık 1 uCi bir ters-fazlı C18 TLC plakası üzerine noktalar ve kurumaya bırakılır. H2O ve plaka, bir radyoaktif TLC plakası okuyucusu kullanılarak analiz: 1 MeCN: TLC 9 çalıştırılır. Click reaksiyonu planlandığı gibi çalışırsa, lige 64 Cu-NOTA-A33 başlangıçta kalmalıdır; Eğer, diğer yandan, reaksiyon halinde, serbest 64 Cu-Tz-Bn-NOTA veya çözücü ön tarafına yakın görünür.

Yukarıda anlatılan protokolde, in vivo görüntüleme deneyleri için taşıma, A33 antijeni sentezleyen, SW1222 kolorektal kanser ksenograftları taşıyan atimik çıplak fareler kullanılmıştır. Akut biyolojik dağılım (n = 5 zaman noktası başına) ve PET görüntüleme grubu (n = 12) deneyleri pretargeting stratejisi iyi görüntü kontrastı ve yüksek tümör-zemin aktivitesi oranları (Şekil 6, kolorektal tümör büyümesini ortaya çıkarma yeteneğine sahip olduğunu ortaya koymaktadır). Tümör 64 Cu-Tz-Bn-Nota alımı erken zaman noktalarında açıktır:% 3.5 0.6 ±% ID / g ve sırasıyla 1 saat ve 4 saat sonrası enjeksiyon, 0.6% ID / g ±% 4,1. Ancak, bu erken noktalarda, kolayca fare (bağırsak yoluyla radyoaktivite temizleme miktarına göre kapatmamasını% 11,9% 4,4 kimliği / g ve dışkı 3.4% ID / g ± 8.8% 1 saat ve 4 de ± saat pi, sırasıyla). Birkaç saat boyunca, aşırı radyo-(1.4% 0.5% ± ID / g 24 saat pi de) dışkı ile temizler ve tümör görüntüsü (% 4.0 ± 0.9% ID / g en belirgin özelliği de olur 24 saat pi). Bu daha sonraki zaman noktalarında, tümör iyi görüntüde tarif ve tümör-zemin aktivitesi oranları oldukça yüksek olduğu; 12 saat pi ve 27.0 ± 7.4 24 saat pi şaşırtıcı değil, sadece 64 Cu-Tz-Bn-NOTA, non-spesifik antikorların kullanarak kontrol deneyleri, o az 26.6 ± 6.6 kas oranlarını: Örneğin, strateji tümör verirR huA33 konjüge tco kısımları olmadan tüm tümör az alımı ile sonuçlanmıştır.

Aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınacağı gibi, bu strateji, pretargeting - bütün pretargeting stratejileri gibi - yeni antikor / antijen sistemleri uygulandığında optimizasyon gerektirir değişkenlerin sahiptir. En önemli iki enjekte mAb-TCO yapının kütle ve mAb-TCO yapısının enjeksiyonu ve radyoligandın enjeksiyon arasındaki aralığın uzunluğu vardır. MAb-TCO konjugat miktarı çok yüksek veya enjeksiyonlar arasındaki zaman aralığı çok kısa ise, kanda serbest mAb-TCO miktarı kadar gider ve tıklama reaksiyonlar olasılığı kanda ziyade tümör artar meydana gelen. Örneğin, 64 Cu / huA33 sisteminde huA33 (yerine 100 ug) veya 12 saat zaman aralığı (yerine 24 saat) kullanımı ug t fark artışlar ile sonuçlanmıştır 300 verilmesinin hem Burada elefare kalbinde (sırasıyla Şekil 7A ve Şekil 7B) görünür radyoaktivite o miktarı. Erken zaman noktalarında tümör alım miktarı ile gösterildiği gibi, bu durumların her ikisinde, click reaksiyonu hala açık bir şekilde, tümörde oluşan edilir; Bununla birlikte, kanda radyo-etiketli antikorun oluşturulması da açıktır. Bu kanda oluşan radyoaktif işaretli antikor hala sonunda tümörün kendi yolunu bulacağını çünkü görevden cazip olsa da, bu biraz da tümörü ulaşır ve böylece yükseltmek önce radyoaktif işaretli antikor yavaş yavaş dolaşımda gibi, bir pretargeting yöntemi kullanılarak amacı yendi hedef olmayan organlar fiyatlarını doz. Çok az antikor kullanılmakta ise tersine, tümör alımı miktarı, doğal olarak zarar görecektir. Aşırı uzun aralık süresi de yavaş antikor, geliştirilmiş içselleştirme, transcyclooctene izomerizasyon, veya antikor / antijen dökülme sonucunda tümör alımında seviyelerini düşürebilir. th tanısıese sorunları daha zorlu ve PET verilerinin incelenmesi yoluyla sadece başarılı olamaz. Açıkçası, hassas bir denge sağlanmalıdır. Bu nedenle, yeni bir antikor / antijen sistemi bu stratejiyi uygulamak için çalışırken herhangi araştırmacılar başlangıç ​​noktaları olarak mAb-TCO yapı (≥ 200 mg) ve kısa aralıklı süreleri (≤ 24 saat) büyük miktarlarda kullanmak ve oradan optimize önerilir.

Şekil 1,
Şekil 1. ters elektron-talep Diels-Alder tetrazin ve transcyclooctene arasında [4 + 2] siklokatılma tıklayın ligasyonu.

Şekil 2,
Şekil 2. pretargeting metodoloji dört adımda bir illüstrasyon. Bu rakam aslında JNM yayımlanan araştırmaya dayanmaktadır. Zeglis BM ve diğ. Bir pretargeted PET stratejisi basNükleer Tıp ed bioorthgonal Diels-Alder tıklayın kimyası üzerinde. Dergisi. 54, 1389-1396 (2013). © 2013 Nükleer Tıp ve Moleküler Görüntüleme Derneği tarafından, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. TCO-NHS ile huA33 modifikasyonu için bir şema.

Şekil 4,
Şekil 4. sentezi ve Tz-Bn-Nota 64 Cu Radyoaktif bir şema. Bu rakam aslında JNM yayımlanan araştırmaya dayanmaktadır. Zeglis, BM ve ark. Bioorthgonal Diels-Alder dayalı bir pretargeted PET görüntüleme stratejisi kimyasını tıklayın. Dergisi Nükleer Tıp. 54, 1389-1396 arasında (2013). &# 169; 2013 Nükleer Tıp ve Moleküler Görüntüleme Derneği tarafından, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. saflaştırılmış 64 Cu-Tz-Bn-Nota Bir radyo-HPLC iz.

Şekil 6,
64 Cu-Tz-Bn-Nota Şekil 6. PET görüntüleri / A33-TCO stratejisini pretargeting. Fareler deri altı SW1222 ksenograftları kuyruk ven enjeksiyon yoluyla huA33-TCO (100 ug) uygulandı (100-150 mm 3) taşıyan. 24 saat sonra aynı farenin 64 Cu-Tz-Bn-nota kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) tatbik edildi ve daha sonra uygulanmasından sonra 2, 6, 12 ve 18 saat görüntülü radyofarmasötik. Transverse (üst) ve koronal (alt) planar görüntüler tümörlerin merkezini kestiği. Açık bir şekilde 12 ve 18 saat sonra enjeksiyon bütün hedef olmayan doku tarif tümör (beyaz ok) bırakarak 12 saat büyük ölçüde açık erken zaman noktalarında (örneğin, 2 ve 6 saat), bağırsakta alınmasından yüksek seviyeleri. Bu rakam aslında JNM yayımlanan araştırmaya dayanmaktadır. Zeglis, BM ve ark. Bioorthgonal Diels-Alder dayalı bir pretargeted PET görüntüleme stratejisi kimyasını tıklayın. Dergisi Nükleer Tıp. 54, 1389-1396 arasında (2013). © 2013 Nükleer Tıp ve Moleküler Görüntüleme Derneği tarafından, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7,
Şekil Suboptimal pretargeting deneyleri 7. PET görüntüleri. (A) Fare beahalka deri altı SW1222 ksenogrefleri (100-150 mm 3, ok) kuyruk ven enjeksiyon yoluyla huA33-TCO (100 ug) uygulandı. 12 saat sonra, aynı fareler 64 Cu-Tz-Bn-Nota (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) kuyruk ven enjeksiyonu uygulandı. (B) subkutan SW1222 ksenograftları (100-150 mm 3, ok) taşıyan fareler kuyruk ven enjeksiyon yoluyla A33-TCO (300 mikrogram) uygulandı. 24 saat sonra aynı farenin 64 Cu-Tz-Bn-nota (10,2-12,0 MBq [275-325 uCi]) kuyruk damarından enjeksiyon uygulanmıştır. Her iki durumda da, fareler 64 Cu-Tz-Bn-nota enjeksiyonundan sonra 12 saat görüntülendi. Her iki panel, enine (üst) ve koronal (alt) olarak düzlemsel resim tümörlerin merkezini kestiği. Pretargeting strateji açıkça her iki durumda da tümör belirlemektedir birlikte, bu görüntülerin her ikisinde de sonuçları Şekil 6'da gösterilen ile karşılaştırıldığında, alt-standarttır. Her iki 7A ve 7B olarak, oradakalp arka plan aktivitesi alımı önemli miktarda. Şekil 7A'daki koşullar altında, bu büyük ihtimalle tümör lokalize huA33-TCO yapısı verilen yeterli bir süre bir sonucudur. Şekil 7B koşulları altında, bu muhtemelen çok fazla huA33-TCO enjeksiyon ve enjeksiyondan sonra kan içinde daha 24 saat dolaşan hala fazla immüno sahip olan bir sonucudur. Bu rakam aslında JNM yayımlanan araştırmaya dayanmaktadır. Zeglis, BM ve ark. Bioorthgonal Diels-Alder dayalı bir pretargeted PET görüntüleme stratejisi kimyasını tıklayın. Dergisi Nükleer Tıp. 54, 1389-1396 arasında (2013). 2013 Nükleer Tıp ve Moleküler Görüntüleme Derneği tarafından, Inc. , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu pretargeted PET görüntüleme stratejisinin temel avantajı, doğrudan etiketli antikorlar tarafından üretilen arka plan radyasyon dozunun sadece bir kısmını hedef-arka görüntü kontrast ile tümörlerin ortaya çıkarma yeteneğine sahip olmasıdır. Örneğin, burada açıklanan kolorektal kanser görüntüleme sisteminde, akut biyolojik dağılım deneylerden elde edilen veriler, doğrudan etiketli 64 Cu-NOTA-huA33 ve 89 Zr-DFO-huA33 ile birlikte 64 Cu-tabanlı pretargeting stratejisi için dozimetre hesaplamaları gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Klinik açıdan daha anlamlı 89, Zr-etiketli antikor ile karşılaştırıldığında bu hesaplamalar açıkça özellikle pretargeting sisteminin dozimetrik yararlarını göstermektedir. 0,4162 mSv / MBq: 89, Zr-DFO-huA33 bu üzerinde 30 kat daha yüksek pretargeting strateji olarak etkili dozu, 0.0124 mSv / MBq olup. 64 karşılaştırırken pretargeting dozimetrik yararı daha az belirgindir Cu-etiketli birntibody (0,0359 mSv / MBq), olsa avantajlı etkisi hala var.

Yöntem pretargeting bu IEDDA en önemli unsurlarından biri, modüler olduğu: Trans -cyclooctene içe olan herhangi bir antikora eklenebilir ve yükün çok çeşitli tetrazin bağlı olabilir. Nitekim, bu protokol yazmak için bizim temel motivasyon farklı antikor / antijen / radyoizotop sistemleri ile bu yöntemi kullanmak için, diğer araştırma grupları sağlamaktır. Bu doğrultuda, biz diğer sistemler için bu metodoloji uyarlarken araştırmacılar düşünmelisiniz konularda bir dizi hitap kritik olduğuna inanıyorum.

İlk olarak, antikorun seçimi son derece önemlidir. Basitçe söylemek gerekirse, antikor-olmayan içselleştirme ya da çok yavaş bir hızda içselleştirmiş olması gerekir. İdeal kinetik parametreler henüz tespit edilecek olsa da, antikor ve reaktif trans -cyclooctene o kalmalıdır taşırönce radyoligand enjeksiyonundan antikorun içselleştirme ve tutma için, hücre dışında, önemli ölçüde, in vivo tıklayın reaksiyonların sayısını azaltacaktır. Burada tarif edilen sistem olarak, huA33 antikor hedefleri ve A33 antijen Kolorektal kanser>% 95 olarak ifade edilen bir transmembran glikoprotein bağlanır. Önemli bir şekilde, hatta hedefine bağlandıktan sonra huA33 antikor / antijen kompleksinden gün hücrenin yüzeyi üzerinde kalır gösterilmiştir. 31-33 olmayan bir içe antikorun ihtiyaç stratejisi için bir sınırlama kuşkusuz iken, bir olmayan içe antikorların çok çeşitli Rossin, vd. mükemmel pretargeting çalışmalarında incelenmiştir, belki de en önemlisi TAG72 hedefleme CC49 antikoru bilinmektedir. 30,34,35

İkincisi, bu pretargeting strateji - diğerleri gibi - önemli optimizasyon gerektirir. A kimliğinin yanındantibody ve tetrazin radyoligand, iki önemli değişkenler dikkate alınması gerekir: enjekte edilen antikor miktarı ve antikor ve radyoligandın enjeksiyonu arasında geçen süre. Yukarıda Örnek Sonuçlar bölümünde, her iki Bu değişkenler ele alınmıştır, ancak çok fazla ya da antikor ya da çok kısa bir zaman aralığı enjeksiyonu sırasında kanda kalacak mAb-TCO konjügatı önemli miktarlarda mevcut olduğu takdirde, kısa bir süre için yinelemesi radyoligandın. Bu da, in vivo olarak bir tıklama bağlanma, sadece zaman içinde yavaş yavaş tümör birikir dolaşan, radyo-etiketli bir antikor oluşturan, kan içinde yerine tümör meydana gelen neden olur. Çok az bir antikor ya da çok uzun bir zaman aralığı ya da kullanılması halinde tersine, tümör radyoaktivite son miktarı optimal olur. Bizce, doğrudan etiketlenmiş antikor sanmıyoruz, tercihen akut biyolojik dağılım deneyleri titiz görüntüleme yaparken, ya daEğer herhangi bir pretargeting deneyler öncesinde gerekli antikor miktarı ve antikor yapının ilk enjeksiyondan sonra ideal bir zaman aralığı hakkında bilgi edinmek için en güvenilir yoludur. Radyo-etiketli mAb farklı enjekte kitleler için, bu deneyler, pretargeting deneyler için en ümit verici koşulların seçimine izin veren, kandan radioimmunoconjugate temizlenmesi ve tümör birikimi hem somut veriler sağlayacaktır.

Uygun bir radyoizotop seçerken Son olarak, tetrazin bazlı radyoligandın farmakokinetik dikkate alınmalıdır. Burada tarif edilen sistem olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş olan Tz-Bn-NOTA parçası en tamamlayıcı fiziksel yarıya 64 Cu pozitron yayan radyoizotop, yapım yaklaşık 3-4 saatlik bir biyolojik yarı ömrü olan bağırsak yoluyla vücuttan atılır hayat. Bu inci ile uyumlu olması için ne yazık ki, tetrazin parçasının biyolojik yarı ömrü çok uzune daha hızlı radiometal 68 Ga (t 1/2 = 68 dk) çürüyen. Aşırı radyoligand vücuttan temizleyerek bitmeden Bu durumda, tümör herhangi bir radyoaktivite birkaç yarı-ömrü boyunca bozulacak. Sonuç olarak, görüntüler tümör-zemin aktivitesi oranları düşük kalması, erken zaman noktalarında, elde edilecek olurdu 36 İdeal, tetrazin Radyoligandlann gelecek nesillerin mühendislik olacağını -. Belki PEGylation, glikasyon, ya da diğer yollarla - salgılamak için daha hızlı bir şekilde vücuttan. Bu da daha pretargeted görüntüleme stratejisinin dozimetrik faydaları artıracak gibi 68 Ga ve 18 F olarak daha hızlı çürüyen Radyoizotoplarla ile radiolabeling için izin verecek. Sonuçta, araştırmacılar görüntüleme için diğer radyoizotop ile kullanım için bu teknolojiyi adapte olarak (örneğin, 124 I, 111 yılında, vb 18 F, 89 Zr, 68 Ga), örneğin ya da tedavi (, 177, Lu, 225, Ac, 125I, vb), yeni tetrazin bazlı ligandlar farklı şelatlar ya da radyo-etiketleme prostetik gruplar dahil etmek için geliştirilmiş olması gerekir. Bu yeni yapıların farmakokinetik kapsamlı soruşturma ligandlarının açıklık özellikleri ve radyonüklitlerin fiziksel yarı-yaşam arasındaki avantajlı eşleşmeleri sağlanması için gerekli olacaktır.

Sonunda, biz çok diğer araştırmacılar bu pretargeting teknolojinin sözünü görmek ve yeni antikor / antijen sistemleri ile istihdam umuyoruz. Yukarıdaki paragraflar, bu adaptasyon süreci her zaman basit olmayabilir olduğunu göstermektedir iken, bu metodoloji ötesinde bir nükleer görüntüleme üzerinde önemli etkisi, hedeflenen radyonüklid tedavi ve olabilir bizim inanç.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tetrazine NHS Ester Sigma-Aldrich 764701 Store at -80 °C
Trans-cyclooctene NHS Ester Sigma-Aldrich 764523 Store at -80 °C
p-NH2-Bn-NOTA Macrocyclics B-601 Store at -80 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50, 2-5 (2009).
  2. Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40, 6168-6195 (2011).
  3. Hollander, N. Bispecific antibodies for cancer therapy. Immunotherapy. 1, 211-222 (2009).
  4. Liu, G., et al. Tumor pretargeting in mice using 99mTc-labeled morpholino, a DNA analog. Journal of Nuclear Medicine. 43, 384-391 (2002).
  5. Boerman, O. C., van Schaijk, F. G., Oyen, W. J. G., Corstens, F. H. M. Pretargeted radioimmunotherapy of cancer: Progress step by step. Journal of Nuclear Medicine. 44, 400-411 (2003).
  6. Goldenberg, D. M., Sharkey, R. M., Paganelli, G., Barbet, J., Chatal, J. F. Antibody pretargeting advances cancer radioimmunodetection and radioimmunotherapy. Journal of Clinical Oncology. 24, 823-834 (2006).
  7. Sharkey, R. M., Chang, C. H., Rossi, E. A., McBride, W. J., Goldenberg, D. M. Pretargeting: taking an alternate route for localizing radionuclides. Tumor Biology. 33, 591-600 (2012).
  8. Sharkey, R. M., et al. Improving the delivery of radionuclides for imaging and therapy of cancer using pretargeting methods. Clinical Cancer Research. 11, 7109-7121 (2005).
  9. Schultz, J., et al. A tetravalent single-chain antibody-streptavidin fusion protein for pretargeted lymphoma therapy. Cancer Research. 60, 6663-6669 (2000).
  10. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. Journal of Nuclear Medicine. 44, 1284-1292 (2003).
  11. Zeglis, B. M., et al. A pretargeted PET imaging strategy based on bioorthgonal Diels-Alder click chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1389-1396 (2013).
  12. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: fast bioconjugation based on inverse electron demand Diels-Alder reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130, 13518-13519 (2008).
  13. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Hatin, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angewandte Chemie-International Edition. 48, 7013-7016 (2009).
  14. Devaraj, N. K., Weissleder, R. Biomedical applications of tetrazine cycloadditions. Accounts of Chemical Research. 44, 816-827 (2011).
  15. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: application to pretargeted live cell imaging. Bioconjugate Chemistry. 19, 2297-2299 (2008).
  16. Keliher, E. J., Reiner, T., Turetsky, A., Hilderbrand, S., Weinberg, R. A. High-yielding, two-step 18F labeling strategy for 18F-PARP1 inhibitors. ChemMedChem. 6, 424-427 (2011).
  17. Reiner, T., Earley, S., Turetsky, A., Weissleder, R. Bioorthogonal small-molecule ligands for PARP1 imaging in living cells. ChemBioChem. 11, 2375-2377 (2010).
  18. Reiner, T., Keliher, E. J., Earley, S., Marinelli, B., Weissleder, R. Synthesis and in vivo imaging of a 18F-labeled PARP1 inhibitor using a chemically orthogonal scavenger-assisted high-performance method. Angewandte Chemie International Edition. 50, 1922-1925 (2011).
  19. Taylor, M. T., Blackman, M., Dmitrenko, O., Fox, J. M. Design and synthesis of highly reactive dienophiles for the tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Journal of the American Chemical Society. 133, 9646-9649 (2011).
  20. Selvaraj, R., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of integrin alpha(v)beta(3) targeted PET tracer based on a cyclic RGD peptide. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 21 (3), 5011-5014 (2011).
  21. Liu, S., et al. Efficient 18F labeling of cysteine-containing peptides and proteins using tetrazine-trans-cyclooctene ligation. Molecular Imaging. 12, 121-128 (2013).
  22. Han, H. S., et al. Development of a bioorthogonal and highly efficient conjugation method for quantum dots using tetrazine-norbornene cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132, 7838-7839 (2010).
  23. Zeglis, B. M., et al. Modular strategy for the construction of radiometalated antibodies for positron emission tomography based on inverse electron demand Diels-Alder click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 22, 2048-2059 (2011).
  24. Zeng, D., Zeglis, B. M., Lewis, J. S., Anderson, C. J. The growing impact of bioorthogonal click chemistry on the development of radiopharmaceuticals. Journal of Nuclear Medicine. 54, 829-832 (2013).
  25. Reiner, T., Zeglis, B. M. The inverse electron demand Diels-Alder reaction in radiochemistry. Journal of Labeled Compounds and Radiopharmaceuticals. 57, 285-290 (2014).
  26. Li, Z., et al. Tetrazine-trans-cyclooctene ligation for the rapid construction of 18-F labeled probes. Chemical Communications. 46, 8043-8045 (2010).
  27. Karver, M. R., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Synthesis and evaluation of a series of 1,2,4,5-tetrazines for bioorthogonal conjugation. Bioconjugate Chemistry. 22, 2263-2270 (2011).
  28. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48, 6973-6998 (2009).
  29. Bosch, S. M., et al. Evaluation of strained alkynes for Cu-free click reaction in live mice. Nuclear Medicine and Biology. 40, 415-423 (2013).
  30. Rossin, R., et al. In vivo chemisry for pretargeted tumor imaging in live mice. Angewandte Chemie International Edition. 49, 3375-3378 (2010).
  31. Ackerman, M. E., et al. A33 antigen displays persistent surface expression. Cancer Immunology and Immunotherapy. 57, 1017-1027 (2008).
  32. Carrasquillo, J. A., et al. 124I-huA33 antibody PET of colorectal cancer. Journal of Nuclear Medicine. 52, 1173-1180 (2011).
  33. Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97, 1248-1254 (2006).
  34. Rossin, R., Lappchen, R., vanden Bosch, S. M., LaForest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder reaction for tumor pretargeting: In vivo chemistry can boost tumor radiation dose compared with directly labeled antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54, 1989-1995 (2013).
  35. Rossin, R., et al. Highly reactive trans-cyclooctene tags with improved stability for Diels-Alder chemistry in living systems. Bioconjugate Chemistry. 34, 1210-1217 (2014).
  36. Emmetiere, F., et al. 18F-labeled-bioorthogonal liposomes for in vivo targeting. Bioconjugate Chemistry. 24, 1784-1789 (2013).

Tags

Biyomühendislik Sayı 96 Pozitron Emisyon Tomografi Kimya Pretargeting tetrazin tıklayın Ters Elektron Talep Diels-Alder siklokatılma
Pretargeted PET Görüntüleme Bioorthogonal Ters Elektron Talep Diels-Alder Katılma Harnessing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. … More

Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. J. Vis. Exp. (96), e52335, doi:10.3791/52335 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter