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Neuroscience

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

Published: January 10, 2015 doi: 10.3791/52358

Abstract

La combinación de grabaciones de patch clamp de dos (o más) las neuronas sinápticamente acoplados (grabaciones emparejadas) en forma de preparados agudos cortes de cerebro con relleno biocitina intracelular simultánea permite un análisis de correlación de sus propiedades estructurales y funcionales. Con este método es posible identificar y caracterizar las neuronas pre y postsinápticos por su morfología y patrón de respuesta electrofisiológica. Grabaciones apareadas permiten el estudio de los patrones de conectividad entre estas neuronas, así como las propiedades tanto de la transmisión sináptica química y eléctrica. Aquí, le damos una descripción paso a paso de los procedimientos necesarios para obtener grabaciones pareadas fiables junto con una óptima recuperación de la morfología de las neuronas. Vamos a describir cómo se identifican los pares de neuronas conectadas a través de las sinapsis químicas o cruces brecha en el tramo preparativos cerebro. Vamos a describir cómo se reconstruyen las neuronas para obtener su morfología 3D del Dendritic y dominio axonal y cómo los contactos sinápticos son identificados y localizados. También discutiremos las salvedades y limitaciones de la técnica de grabación emparejado, en particular los relacionados con truncamientos dendríticas y axonales durante la preparación de cortes de cerebro, porque esto afecta fuertemente las estimaciones de conectividad. Sin embargo, debido a la versatilidad del enfoque de grabación emparejado seguirá siendo una herramienta valiosa en la caracterización de diferentes aspectos de la transmisión sináptica en microcircuitos neuronales identificados en el cerebro.

Introduction

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Microcircuitos neuronales entre dos neuronas sinápticamente acoplados son los bloques de construcción de redes a gran escala en el cerebro y son las unidades fundamentales de procesamiento de la información sináptica. Un requisito previo para la caracterización de tales microcircuitos neuronales es conocer la morfología y propiedades funcionales de las neuronas asociadas ambos pre y postsinápticos, el tipo de la conexión sináptica (s) y su estructura y mecanismo funcional. Sin embargo, en muchos estudios de conexiones sinápticas al menos una de las neuronas en un microcircuito no está bien caracterizado. Esto resulta de los protocolos de estimulación relativamente inespecíficos menudo utilizados en los estudios de la conectividad sináptica. Por lo tanto, las propiedades estructurales y funcionales de la neurona presináptica o bien no están identificados en absoluto o sólo a una parte bastante pequeña medida (es decir, la expresión de proteínas marcadoras etc.). Grabaciones pareadas en combinación con tinción intracelular de marcadores such como biocitina, neurobiotin o tintes fluorescentes son más adecuados para el estudio de pequeños microcircuitos neuronales. Esta técnica permite a uno investigar muchos parámetros estructurales y funcionales de una conexión sináptica morfológicamente identificado al mismo tiempo.

Las denominadas conexiones monosynaptic 'unitarios' entre dos neuronas se han investigado en ambas regiones cerebrales corticales y subcorticales 1-10 utilizando el tramo preparativos agudas. Inicialmente, se utilizaron microelectrodos afilados en estos experimentos; más tarde, la grabación de patch clamp fue empleado para obtener grabaciones de señales sinápticas con un nivel de ruido inferior y una mejor resolución temporal.

Un avance técnico significativo fue el uso de contraste de interferencia diferencial de infrarrojos (IR-DIC) óptica 11-14, una técnica microscópica que mejoró significativamente la visibilidad y la identificación de las neuronas en el cerebro rebanada de manera que se hizo posible to obtener grabaciones de las conexiones sinápticas identificados visualmente 15-17. En general, las grabaciones pareados se realizan en el tramo preparativos agudas; sólo muy pocas publicaciones son grabaciones de informes disponibles de neuronas conectadas sinápticamente in vivo 18-20.

La ventaja más importante de grabaciones emparejados es el hecho de que una caracterización funcional puede ser combinado con un análisis morfológico, tanto en la luz y nivel microscópico de electrones (véase, por ejemplo., 7,16,21). Después del procesamiento histoquímica, la morfología dendrítica y axonal del par de neuronas conectadas sinápticamente se traza. Posteriormente, es posible cuantificar las características morfológicas, como la longitud, la densidad espacial, la orientación, el patrón de ramificación etc. Estos parámetros pueden entonces servir de base para una clasificación objetiva de una conexión sináptica específica. Además, en contraste a la mayoría de otras técnicas utilizadas para el estudio de connecti neuronalesVity, emparejado grabaciones también permiten la identificación de los contactos sinápticos para las conexiones sinápticas unitarios. Esto se puede hacer directamente utilizando una combinación de luz y microscopía electrónica 16,21-27 o el uso de imágenes de calcio 28,29 de las espinas dendríticas. Sin embargo, con este último enfoque sólo excitatorio pero no conexiones inhibitorias se pueden estudiar ya que requiere la entrada de calcio a través de los canales de los receptores postsinápticos.

Además de un análisis detallado de la transmisión sináptica en un microcircuito emparejado grabaciones neuronales definidas también permitir que el estudio de las reglas de plasticidad sináptica 30,31 o - en combinación con la aplicación agonista / antagonista - la modulación de la transmisión sináptica por los neurotransmisores tales como la acetilcolina 32 y adenosina 33.

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Protocol

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Todos los procedimientos experimentales se han llevado a cabo de conformidad con la Directiva de la UE para la Protección de los Animales, la Ley de Bienestar Animal Alemán (Tierschutzgesetz) y las Directrices de la Federación de Asociaciones de Ciencia Animal de Laboratorio Europeo.

1. Configuración de Electrofisiología

Antes de comenzar con la grabación emparejado, un electrofisiología configuración tiene que ser construido. Un breve resumen de cómo se monta una puesta a punto tal es la siguiente:

  1. Instalar una mesa anti-vibración en el que se colocarán el microscopio, los manipuladores y el resto del equipo.
    NOTA: la vibración o cualquier otro tipo de movimiento tiene que ser tan pequeño como sea posible cuando la grabación de las conexiones sinápticas porque esto requiere un cambio de pipetas (búsqueda electrodo sustituido por electrodo de registro).
  2. Coloque una jaula de Faraday alrededor de la mesa anti-vibración para reducir el ruido eléctrico. Conecte todos los equipos dentro de la ca Faradayge con la tierra eléctrica.
  3. Instale un microscopio con un eje enfoque motorizado que se basa en una mesa XY motorizada sobre la mesa anti-vibración de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Esto permite mover de forma fiable el microscopio para las neuronas que no están en el mismo campo de vista, ya que es el caso para las conexiones translaminar en el neocórtex.
  4. Instalar una cámara de vídeo en el puerto de la cámara del microscopio y conéctelo a analógico y / o pantallas digitales para observar la preparación rebanada y el movimiento de los electrodos. Utilice una cámara, que se puede cambiar entre una una imagen de primer plano de bajos y una magnificación de alta potencia para obtener una visión general y, respectivamente, de la pareja de células neuronales sinápticamente acoplado. Esto también ayuda a controlar el movimiento de los electrodos de conexión.
  5. Instalar una mesa muestra que contiene una inserción para la cámara de baño (perforado en la casa de un bloque de plexiglás) para la preparación de cortes de cerebro. Esta tabla muestra no debe estar conectado a lamicroscopio, es decir, debe ser fijado a la mesa de aire y el microscopio debe ser maniobrable debajo de ella.
  6. Monte dos (o más si es necesario) micromanipuladores de alta precisión que se pueden mover en las tres dimensiones. Instale patch-clamp preamplificador de los manipuladores y conectarlos al amplificador principal.
    NOTA: Si manipuladores adicionales necesarios se pueden instalar para, por ejemplo, más de dos pre-amplificadores, electrodos de estimulación extracelular, sistemas de liberación de fármacos, etc.
  7. Coloque la cámara de baño en la tabla de muestras. Instale una entrada de la solución y de salida y conectarlos al sistema de perfusión.
  8. Utilice una bomba peristáltica para mantener la perfusión de la cámara de registro con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF; Tabla 1) a una velocidad de flujo estable de 4 - 6 ml / min para la viabilidad óptima rebanada.
    NOTA: No exceda este caudal significativamente, ya que dará lugar a la turbulencia en el ASCF y por lo tanto el movimiento de la rebanada. Instale los soportes para la sonda de temperatura y Ag / AgCl electrodo de masa sobre la mesa de la muestra. Esto es necesario para permitir que la sonda y el electrodo a la muestra del baño en la cámara.
  9. Para una buena visibilidad de las neuronas en la preparación rebanada utilizar iluminación infrarroja en el microscopio. Esto reduce difracción de la luz y por lo tanto las imágenes borrosas. Asegúrese de que el microscopio está equipado con óptica de contraste de interferencia diferencial para lograr una "visualización 3D' similar. Esto ayudará a parchar las neuronas y permitiría atender las neuronas de profundidad en el corte (60 micras o más profundo).
  10. Durante el experimento, mantener rodajas de cerebro en una cámara experimental con un cubreobjetos de vidrio en la parte inferior. Coloque una "arpa platino 'en la parte superior de la rebanada para evitar rebanadas flote. Un arpa de platino se hace de forma de U, alambre de platino aplanado con las cadenas de hilo dental pegados en la misma.
  11. Mantenga la ACSF perfusión del rebanada a la temperatura de 32 - 35 ° C para asegurar optControl imal de oxigenación y pH. Esto se puede hacer mediante el calentamiento de la solución con un dispositivo Peltier instalado cerca de la entrada ACSF en la cámara de baño.
    NOTA: Utilice la cubierta ultrafina resbala por lo que incluso los condensadores de microscopio con una alta apertura numérica y corta distancia de trabajo se pueden centrar en la muestra. Esto es necesario para una iluminación óptima de la rebanada.
    Para una imagen y una descripción de un electrofisiología configuración optimizada para grabaciones pareadas en la preparación de cortes de cerebro véase la Figura 4 en la Ref. 34.

2. Preparación de la rebanada del cerebro

  1. Ligeramente anestesiar al animal del que el tejido cerebral se debe tomar con isoflurano (concentración final <0,1%).
    NOTA: Otros anestésicos también se pueden utilizar. El uso de la anestesia debe cumplir las recomendaciones y normas de la comisión de los animales en cuestión. Asegúrese siempre de que el animal no se irrita o bajo estrés después de añadirel anestésico.
  2. Decapitar al animal, abrir el cráneo y el cerebro eliminar lo más rápidamente posible usando el procedimiento descrito en las Refs. 34,35.
  3. Transferir el cerebro en enfriada (4 ° C) líquido cefalorraquídeo artificial aireada con una mezcla de gas carbógeno con 95% O 2 y 5% de CO 2.
  4. Aislar la región del cerebro que se debe estudiar.
    NOTA: Los parámetros para obtener conservación óptima y el truncamiento mínima de dendritas y axones de las neuronas pre y postsinápticos se debe determinar de antemano para cada conexión neuronal y la etapa de desarrollo bajo investigación. En un corte de cerebro de manera óptima diseccionado, el axón de la neurona presináptica no está obligado a ser paralela a la superficie de la rebanada. Más bien, deben apuntar a las rebanadas con un ángulo pequeño. El aplica para la dendrita apical de las neuronas piramidales postsinápticos; este debe ser revisado con el microscopio óptico. Esto es particularmente importante para no local o tconexiones sinápticas ranslaminar, es decir., en donde somata pre- y postsináptica son más de 200 m de distancia y la probabilidad de truncamientos dendríticas y axonales es probable que sea sustancialmente más alto que para las conexiones locales.
  5. Transferir el cerebro a la cámara de microtomo. Con base en los hallazgos empíricos, diferentes soluciones rebanar extracelular se utilizan en función de la edad del animal (véanse los cuadros 2 y 3, información útil también se puede encontrar en ' http://www.brainslicemethods.com/ ').
  6. Recorte el cerebro hasta la región de destino es visible.
  7. Para obtener rodajas con una visibilidad de células bueno, cortar 300-400 m de espesor rodajas de cerebro si el animal es maduro (> 3 semanas). Si el animal es inmaduro (1ª a semana postnatal para los ratones y ratas) rebanadas pueden cortar hasta un espesor de ~ 600 a 800 micras sin perjudicar sustancialmente visib celularility.
    NOTA: Esto mejorará la estabilidad de las rebanadas 'inmaduras' y reducir el número de posibles truncamientos de dendrítica de largo alcance y las colaterales axónicas.
  8. Transferir las rebanadas de la cámara de microtomo a una cámara de incubación lleno de solución rebanar aireada con una mezcla de 95% O 2 y 5% de CO 2. Mantenga los segmentos en la cámara de incubación durante al menos 30 min a 1 hr a RT o ya sea a ~ 30 ° C, dependiendo del tipo de experimento.

3. emparejados Patch-Clamp Grabación y Biocitina Relleno

Dependiendo del tipo de conexión sináptica tres enfoques diferentes se utilizan para encontrar neuronas sinápticamente acoplados. Si la probabilidad de conexión es baja (como se puede esperar para las conexiones más excitadoras), proceda de la siguiente manera:

  1. Conexiones neuronales con una conectividad de bajo
    1. Llenar las pipetas de parche con una solución interna de la composición de la listaen la Tabla 4 para todas las grabaciones en la configuración de célula completa añadir biocitina a concentraciones entre 3 -. 5 mg / ml a la solución (pipeta) interna para obtener buenos resultados de la tinción para las neuronas pre y postsinápticos. Deje biocitina difusa en la célula durante al menos 15 - 30 min (dependiendo del tamaño de la neurona).
      NOTA: No agregue biocitina a la solución utilizada en los 'busca' pipetas se mencionan a continuación.
    2. Parche una neurona postsináptica putativo en el modo de célula entera. Utilice pipetas de parche con una larga y delgada caña. Esto facilita la maniobrabilidad de la pipeta con arreglo al objetivo y reduce los artefactos de movimiento que pueden ocurrir cuando el electrodo se introduce en el corte.
    3. Entonces, un parche en una potencial neurona presináptica en una configuración celular conectado usando un 'buscar' parche pipeta de 8 a 10 MΩ resistencia y un pequeño diámetro de la punta. Con estas pipetas establecer un parche celular conectado 'suelta'. Fill la 'buscar' pipeta con una solución interna en la que K + se sustituye por Na + (Tabla 5) a fin de no despolarizar las neuronas durante la búsqueda de una célula presináptica.
      NOTA: La resistencia del sello 'suelta' no está en el rango GΩ pero por lo general alrededor de 30 a 300 MΩ.
    4. Sostenga el potencial de membrana bajo el sello 'suelta' a cerca de -30 a -60 mV en el modo de pinza de corriente. Luego, aplicar grandes impulsos de corriente (0,2-2 Na) para obtener un potencial de acción en la célula presináptica potencial. Observar este potencial de acción como un pequeño espiguilla en la respuesta de tensión.
    5. Ajuste la frecuencia de estimulación de 0,1 Hz para evitar la decadencia de una respuesta postsináptica. Use frecuencias de estimulación más bajas en caso de que el tejido cerebral es muy inmaduro o la conexión sináptica no muy fiable.
    6. En el caso de la neurona 'postsináptica' no responde a la estimulación de la neu 'presináptica' probadoron, parchar una nueva neurona en el modo de sello 'suelto'. No sustituya la 'búsqueda' electrodo parche siempre y cuando el sello con una resistencia de> 30 MΩ se establece. Pon a prueba hasta 30 neuronas presinápticas potencialmente de esta manera.
      NOTA: Para evitar daños en la neurona durante el procedimiento de búsqueda con patch clamp suelto, sólo suavemente de succión debe ser aplicado a la pipeta de búsqueda en comparación con el aplicado a la pipeta de parche de células enteras.
    7. Si la estimulación en los resultados de modo de sello 'sueltos' en un EPSP / IPSP con una latencia <5 ms en la neurona postsináptica retire la 'búsqueda' pipeta de la neurona presináptica.
    8. Vuelva a colocar la 'búsqueda' parche pipeta con un electrodo de parche lleno, solución interna periódica que contiene biocitina. Asegurar este parche pipeta de grabación tiene una resistencia de 4 - 8 MΩ; mayor será el tamaño soma menor es la resistencia del electrodo puede ser.
    9. Parche del presinápticaneurona y registro en su conjunto de células, modo de corriente-clamp. Provocar potenciales de acción por inyección de corriente en las neuronas presinápticas y registrar la respuesta postsináptica. Guarde los datos en un ordenador para su posterior análisis fuera de línea.
  2. Conexiones neuronales con una alta conectividad
    NOTA: Para microcircuitos neuronales con una alta relación de conectividad (> 30%) utiliza un procedimiento diferente para encontrar conexiones sinápticas. Este procedimiento se describe a continuación y se utiliza a menudo para la conexión sináptica inhibitoria que tienen en promedio una proporción mayor que la conectividad conexiones excitatorias 36. No debe ser utilizado cuando la relación de conectividad cae por debajo de este valor.
    1. Parche una neurona presináptica directamente en el modo de célula entera. Entonces, un parche en una potencial neurona postsináptica, también en el modo de célula completa. Tanto las células deben estar bajo el control de pinza de corriente. Suscitar un potencial de acción en la célula presináptica. Supervisar la neurona postsináptica prospectivo para un postsypotencial Naptic.
    2. En el caso de la neurona no muestra una respuesta a la estimulación presináptica, un parche en una neurona nueva en el modo de células enteras utilizando un electrodo de parche lleno de solución interna regular. Si se encuentra una conexión, no cambie el parche pipeta pero continuar con la grabación. A continuación, proceder como en el paso 3.1.9.
  3. Conexiones neuronales a través de gap-uniones
    NOTA: Para buscar las conexiones eléctricas (brecha cruce) utilice el siguiente procedimiento, que es una versión modificada de la utilizada para conexiones de baja probabilidad.
    1. Parche una neurona postsináptica en la configuración de pinzamiento zonal de célula completa.
    2. Posteriormente, parchear una neurona presináptica putativo en la configuración de sellado suelto (baja resistencia de sellado de 30 a 300 MΩ) usando un 'buscar' parche pipeta de 7 - 10 de resistencia MΩ. Esta pipeta debe ser llenado con la solución interna modificada alta Na + para la estimulación de sellado suelto.
    3. Inject 100-300 ms largos impulsos de corriente hiperpolarizantes vía el sello 'suelta'; el potencial de comandos pipeta debe ajustarse a aproximadamente -60 a -70 mV. Observar una conexión brecha de la salida si esta estimulación se traduce en una pequeña respuesta hiperpolarizante en la neurona "post-sináptica '.
    4. Repachear la neurona 'presináptica' en el modo de célula entera y proceder como se describe anteriormente.
      NOTA: Para garantizar una buena tinción de los procesos axonales y dendríticos, utilice el protocolo dado a continuación. Este protocolo se describe en breve aquí, sin embargo, un protocolo detallado para el procesamiento de histoquímica utilizado en nuestro laboratorio se da en la Ref. 37.

4. histoquímica Procesamiento

  1. Transferir el corte de cerebro con el par de neuronas sinápticamente acoplados en un vial que contiene 4% de paraformaldehído disuelto en tampón fosfato 0,1 M y fijar la rebanada durante 24 horas. Por microscopía electrónica, fijar la rebanada utilizando 2,5% glutaraldehído y 1% de paraformaldehído.
  2. Al día siguiente, transferir las rebanadas en tampón de fosfato normal que contiene ningún fijador. Lavar las rebanadas con tampón fosfato para 6 - 8 veces durante 10 - 15 minutos a cada uno para eliminar el exceso de fijador.
  3. Incubar las rebanadas de 20 min en un 3% de H 2 O 2 solución en tampón de fosfato 0,1 M para minimizar la reacción de la peroxidasa endógena. Observar la formación de burbujas fuerte. Continuar el ataque hasta que no se produzcan más burbujas. Luego, enjuague las rodajas en tampón de fosfato 0,1 M de 6 - 8 veces (durante 10 minutos cada uno) para eliminar cualquier resto de H 2 O 2.
  4. Reacciones inmuno y cromogénicos
    La visualización de las neuronas biocitina lleno se basa en una reacción de peroxidasa de rábano-estreptavidina biotinilado catalizada con diaminobencidina; esto produce un precipitado oscuro que produce una mancha crujiente con una alta resolución espacial. Los siguientes procedimientos se usan para la reacción de cromógeno: <ol>
  5. Preparar la solución de ABC según el protocolo del fabricante. Añadir a 14,55 ml de tampón fosfato suplementado con 150 l 10% de Triton X100 (Tabla 6; sólo para microscopía de luz) y mantener la solución durante aproximadamente 30 min en la oscuridad. Incubar las rebanadas en esta solución O / N antes de su uso.
  6. Incubar las rebanadas en solución ABC en un agitador durante 1 hora a RT y en la oscuridad. Posteriormente, mantenga rebanadas O / N a 4 ° C en una nevera. A la mañana siguiente, incubar rebanadas a TA durante una hora adicional.
  7. Después de esto, enjuague rodajas de al menos cuatro veces durante 10 min cada uno en tampón de fosfato. A continuación, se incuba en un agitador durante aproximadamente 30 minutos en la oscuridad en 2 ml de una solución de 3,3 'diaminobencidina-níquel-intensificado (Tabla 7). Tenga mucho cuidado al manipular Diaminobencidina y utilizar sólo bajo la campana de humos; es extremadamente cancerígenos incluso a concentraciones muy bajas.
  8. Añadir 6,5 l 3% de H 2 O 2 a la que contiene Diaminobencidina-solución. Supervisar la reacción cromogénico bajo un microscopio de luz hasta que las neuronas teñidas de color marrón negro son claramente visibles. Entonces, detener la reacción inmediatamente lavando rebanadas varias veces en tampón de fosfato.
  9. Mount rebanadas con neuronas teñidas sobre adhesivo, Histobond silano recubierto o diapositivas de objetos estándar gelatinizados.
  10. Mantenga los portaobjetos en una cámara húmeda con al menos un 80% de humedad O / N. Al día siguiente, dejar que las rodajas de aire seco durante otros 10 min. Antes de la incorporación, transferencia de diapositivas en soluciones con concentraciones crecientes de etanol (20 - 100%) con el fin de deshidratar ellos.
    NOTA: El proceso de deshidratación debe ser lento de lo contrario las distorsiones en los procesos dendríticas y axonales es probable que ocurran 37. Si se elige un procedimiento de incorporación alternativa, por ejemplo, uno con el Moviol basado en glicerol, no se requiere una deshidratación; sin embargo esto es probable que resulte en una compresión homogénea de la rebanada y por lo tanto un morpholo neuronal distorsionadagía.
  11. Por último, se incuban durante 10 minutos en xilol, incrustar las rodajas en un medio de inclusión hidrofóbico para microscopía de luz y coloque un ultra-delgadas cubreobjetos en la parte superior. Deje secar los portaobjetos durante 20 min a RT.

5. Neuronal Reconstrucción y Synaptic Contacto Localización

  1. Examinar los portaobjetos con las neuronas biocitina marcado bajo un microscopio de luz equipado con un objetivo 60X / 100X de inmersión en aceite y un condensador con una alta apertura numérica de resolución espacial óptima. Asegúrese de que boutons axonal y espinas dendríticas son claramente visibles.
  2. Trazar neuronas o pares de neuronas sinápticamente acoplados utilizando una neurona comercial sistema de seguimiento (ver Tabla de Materiales Específicos / Equipo) para obtener reconstrucciones 3D neuronales. Llevar a cabo el seguimiento manualmente bajo inspección visual constante para detectar incluso pequeños axonal o colaterales dendríticas. Para grabaciones pareadas de neuronas sinápticamente junto trazado manual sigue siendo el método deelección porque la atribución de, por ejemplo, un perfil axonal ya sea a la neurona pre o post-sináptica requiere experiencia sustancial reconstrucción.
  3. Si es necesario, hacer el recuento de boutons axonales y / o espinas dendríticas. Debido espinas o incluso subtipos de la columna vertebral y boutons axonales pueden presentar una distribución y la densidad específica con respecto a, por ejemplo, la capa cortical o área, esto podría ayudar a caracterizar tipos de células neuronales.
  4. Para los pares de neuronas sinápticamente acoplados, comprobar el axón y dendritas postsinápticos presináptica de yuxtaposiciones con el máximo aumento disponible. Observar una Bouton axonal y una espina dendrítica postsináptica o el eje está en el mismo plano focal puede ser considerado como un contacto sináptico putativo. Marque este contacto en la reconstrucción.
  5. Corrija las reconstrucciones neuronales para la contracción en las tres dimensiones espaciales en la sección correspondiente del programa de seguimiento.
    NOTA: Durante la fijación, el procesamiento histoquímicay la deshidratación deformación mecánica sustancial y la contracción se producen; esto afectará a las mediciones de longitud axonales y dendríticas y distorsionar gravemente su disposición espacial. Los factores de corrección de contracción para el medio de inclusión son ~ 1.1 para direcciones x e y e ~ 2.1 para la dirección z 37.
  6. Para un análisis morfológico cuantitativo utilizar un programa de análisis de datos para la neurofisiología (véase la Tabla de Materiales Específicos / Equipo).

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Representative Results

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Grabaciones vinculados son el método de elección para una caracterización en profundidad de las conexiones sinápticas uni o bidireccionales morfológicamente identificados, así como las uniones comunicantes conexiones (eléctricas) (Figura 1). Un ejemplo de una grabación emparejado en la capa 4 de la corteza somatosensorial barril se muestra en la Figura 1A. Tanto excitador unidireccional y conexiones sinápticas inhibitorias pueden ser caracterizadas (Figura 1B, C). Además grabaciones apareados permiten grabar de conexiones sinápticas bidireccionales, es decir, de las conexiones en las que ambos neuronas en un par son pre- y postsináptica el uno al otro. Esto se ilustra en la Figura 1D, que muestra las grabaciones de una interneuron inhibitorio y una neurona excitatoria. La obtención de un potencial de acción en la neurona excitatoria (trazas rojos) resultados en un EPSP en el interneuron inhibitorio postsináptico (trazas negras). Sin embargo, cuando un potencial de acción es evoked en el interneuron, un IPSP se puede grabar en la neurona excitatoria. Figura 1E muestra que también es posible grabar de neuronas acopladas a través de brecha de la salida oa través de una brecha de la salida y una sinapsis química. Conexiones de conexiones recíprocas y brecha sólo se pueden identificar por pares de registros electrofisiológicos hasta ahora, pero no por cualquier otra técnica.

La combinación de llenado biocitina de las neuronas acoplado a través de la pipeta de parche y los registros electrofisiológicos permite una correlación de propiedades morfológicas de las neuronas a las propiedades sinápticas. Después de neuronas de procesamiento histoquímicas son visibles como estructuras oscuras en el rebanada fijado (Figura 2A). Posteriormente, el par de células neuronal registrada puede ser reconstruida morfológicamente y los tipos de células neuronales puede ser identificado. Además, es posible identificar el número y ubicación de los contactos sinápticos putativo (paneles de la derecha la figura 2A y Figure 2B recuadro). La pareja neurona se muestra en la Figura 2B se conecta recíprocamente y contactos sinápticos de ahí se han establecido en las neuronas. En nuestras manos, luz, identificadas microscópicamente contactos sinápticos putativos fueron confirmados como verdaderos contactos sinápticos con el microscopio electrónico con un 80 - 90% grado de exactitud 16,21,26.

La Figura 3 muestra un ejemplo de una grabación emparejado de una neurona presináptica en la capa piramidal neocortical 6 de la corteza barril y una neurona excitatoria en la capa espinosa 4. Este microcircuito neuronal translaminar tiene una baja probabilidad de conexión, pero puede ser identificado utilizando el procedimiento de búsqueda descrito en pasos 3.1.1 - 3.1.9 para las conexiones neuronales con una conectividad baja. Con la técnica de grabación emparejado es posible identificar las conexiones sinápticas con una conectividad muy baja como es el caso de algunas conexiones de largo alcance translaminar (este ejemplo) o conexiones entre neurons ubicados en diferentes "columnas" corticales (conexiones sinápticas entre las columnas).

Figura 1
Figura 1. grabaciones apareadas a partir de pares de células sinápticamente acoplados. (A) Izquierda, imagen IR-DIC de un corte de cerebro. Derecha, un interneuron (arriba) y una neurona excitatoria (abajo). (B) Un potencial de acción presináptica (arriba) en una neurona excitatoria provoca un potencial postsináptico excitatorio monosináptico (EPSP) en otra neurona excitatoria (abajo). (C) Un potencial de acción (parte superior) en un interneuron inhibitoria presináptica evoca un potencial postsináptico inhibitorio monosináptico (IPSP) en una neurona excitatoria (abajo). (D) Un potencial de acción (parte superior izquierda) en una neurona presináptica excitatorio evoca una EPSP (abajo a la izquierda) en un interneuron inhibidora. A su vez, un potencial de acciónen el interneuron inhibitoria (arriba a la derecha) provoca un IPSP en la neurona excitatoria (abajo a la derecha). (E) Una serie de pasos hiper e despolarizantes de tensión provocados por inyecciones actuales en una neurona (arriba a la izquierda) se refleja en una brecha de la salida segunda neurona acoplado (abajo a la izquierda). Además, un potencial de acción presináptica (arriba a la derecha) en la primera neurona evoca una pequeña despolarización temprana (espiguilla, inserción) seguido por una profunda hiperpolarización tarde (IPSP) en el potencial de membrana de la segunda neurona (parte inferior derecha). Las barras de escala en (B) se aplican también a (C). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Identificación de los contactos sinápticos y reconstr morfológicaucción de pares de células biocitina lleno. (A) Izquierda, microfotografía de baja potencia de un par de células recíprocamente junto comprende un estrelladas espinosa y un interneuron rápido clavar en la capa 4 que se llena con biocitina durante la grabación. Luz contactos sinápticos microscópicamente identificados putativo excitatorias entre la neurona presináptica y la espinosa interneuron postsináptica están marcados con puntos verdes. Contactos sinápticos inhibitorios recíprocas putativos se indican con puntos azules. Imágenes correctas, de alta potencia de los contactos sinápticos. Círculos abiertos verdes, contactos excitadores; círculos abiertos azules, contactos inhibidora. Fronteras de capa se determinaron por la estructura cytoarchitectonic de la rebanada de cerebro teñido bajo el microscopio de baja potencia. (B) Neurolucida reconstrucción del mismo par de células se muestra en (A) y la Figura 1C. , Axón interneuron Azul; rojo, soma y dendritas interneuron; verde, axón de las neuronas espinosas; blanco, soma de la neurona espinosa y dendritas. El recuadromuestra los compartimentos somatodendríticos de las neuronas pre y postsinápticos junto con los contactos sinápticos putativos. Contornos de cañón fueron identificados en los de baja potencia microfotografías de campo claro a base de la rebanada cerebral agudo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Una conexión sináptica representativa con relación muy baja conectividad. (A) Un potencial de acción presináptica (parte superior) en una capa de células piramidales 6 evoca un potencial postsináptico excitatorio monosynaptic (parte inferior) en una neurona piramidal estrella capa 4. Note la latencia largo (> 3,0 mseg) de esta conexión trans-laminar en comparación con la de las conexiones intra-laminar locales (≈1.0 mseg). (B) respons postsinápticose de la capa de 4 estrellas piramidal neurona a dos potenciales de acción a 10 Hz suscitado en una capa de 6 células piramidales. Tenga en cuenta la facilitación de corto plazo de esta conexión en comparación con la depresión a corto plazo de las conexiones locales (datos no mostrados). (C) de profundidad extendida de formación de imágenes foco de la misma conexión como en (A, B). Inserción, el somato / Dominio dendrítica de una neurona piramidal estrella capa 4. Cabe destacar la presencia de una dendrita apical prominente marcado por una flecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

mM g / L
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 0,186
Glucosa 25 4.5
NaHCO 3 2.1
NaH 2 PO 4 1.25 0,173
CaCl 2 2 0,294
MgCl 2 1 0,095
Osmolaridad ~ 310 mOsmol / L
Gaseado con un 95% de O2 y 5% de CO 2

Tabla 1. fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF) para la perfusión durante la grabación.

mM g / L
NaCl 125 7.305
KCl 2.5 0,186
Glucosa 25 4.5
NaHCO 3 25 2.1
NaH 2 PO 4 1.25 0,173
CaCl 2 1 0,147
MgCl 2 5 0,476
Myo-inositol 3 0.54
Na-piruvato 2 0.22
El ácido ascórbico (vitamina C) 0.4 0.07
Osmolaridad ~ 310 mOsmol / L
Gaseado con un 95% de O2 y 5% de CO 2

Tabla 2. solución extracelular de rodajas de cerebro agudos de animales inmaduros.

mM g / L
La sacarosa 206 70.51
KCl 2.5 0,186
Glucosa 25 4.5
NaHCO 3 25 2.1
NaH 2 PO 4 1.25 0,173
CaCl 2 1 0,147
MgCl 2 3 0,286
Myo-inositol 3 0.54
Na-piruvato 2 0.22
El ácido ascórbico (vitamina C) 0.4 0.07
Osmolaridad ~ 310 mOsmol / L
Gaseado con un 95% de O2 y 5% de CO 2

Tabla 3. solución extracelular de rodajas de cerebro agudos de animales maduros (sucrose solución salina).

mM g / L 50 g / ml
K-gluconato 135 31.622 1.5811
KCl 4 0,298 0.0149
HEPES 10 2,384 0.1192
La fosfocreatina 10 2,552 0.1276
ATP-Mg 2+ 4 2,028 0.1014
GTP-Na 0.3 0,156 0.0078
Ajustar el pH a 7,3 con KOH
Osmolaridad ~ 300 mOsmol / L
Añadir 3 - 5 mg / ml biocitina

Tabla 4. Solución de bajo cloruro de pipeta.

mM g / L 50 g / ml
Na-gluconato 105 22.92 1,146
NaCl 30 1.76 0,088
HEPES 10 2,384 0.1192
La fosfocreatina 10 2,552 0.1276
ATP-Mg 2+ 4 2,028 0.1014
GTP-Na 0.3 0,156 0.0078
Ajustar el pH a 7,3 con NaOH
Osmolaridad ~ 300 mOsmol / L

Tabla 5. Alta Nasolución de la pipeta para buscar neuronas sinápticamente acoplados.

proporción ml
reactivo A 1 0.15
reactivo B 1 0.15
10% de Triton X100 1 0.15
Tampón fosfato 0,1 M 97 14.55
Se mantuvo durante 30 minutos en la oscuridad antes de su uso

Tabla 6. solución de ABC para la reacción histoquímica.

peso volumen
3-3' -Diaminobencidina 10 mg -
Tampón fosfato 0,1 M - 20 ml
1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 - De 5 - 10 l
1% 2 CoCl - 5 l
1% (NH 4) 2 Ni (SO 4) 2 y 1% CoCl 2 se añadió gota a gota mientras se agitaba la solución.

Tabla 7. Solución para diaminobencidina (DAB) de reacción.

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Grabaciones apareadas de excitatorio sinápticamente acoplado y / o las neuronas inhibidoras son un enfoque muy versátil para el estudio de microcircuitos neuronales. No sólo este enfoque permite a uno estimar la conectividad sináptica entre tipos de neuronas sino que también permite la determinación de las características funcionales de la conexión y la morfología de las neuronas pre y postsinápticos. Además, agonista y / o antagonista pueden ser fácilmente aplicadas a las neuronas en las preparaciones rebanada. Esto permite estudiar los efectos de los neuromoduladores en las propiedades de la transmisión sináptica 32 o una caracterización en profundidad de una conexión sináptica unitario definido utilizando, por ejemplo, el análisis cuántico de 16,17,38,39 liberación sináptica. Hallazgo de productos químicos y / o eléctrica (brecha de la salida) conexiones sinápticas es el paso más crítico de este protocolo. Por tanto, hemos enumerado diferentes enfoques para encontrar conexiones sinápticas, dependiendo de la relación y su conectividadTipo (química / eléctrica).

Una desventaja importante de las preparaciones rebanada es el truncamiento a menudo sustancial de largo alcance proyecciones axonales de manera que sólo pequeñas partes de la longitud axonal total del axón se recuperan. Para algunos tipos de células piramidales, el grado de truncamiento podría hasta 90% o incluso más cuando se toma proyecciones a otras áreas corticales o regiones subcorticales en cuenta. Esto hace que la preparación rebanada inadecuado para el estudio de las conexiones sinápticas entre neuronas los cuerpos celulares de las cuales son más de> 300 m de distancia. Sin embargo, en el tramo preparativos agudas, las proyecciones axonales locales, en particular los de las interneuronas locales son generalmente recuperaron con un grado relativamente bajo de dendrítica y el truncamiento axonal (~ 10% o menos) por el lapso de campo horizontal y vertical limitado de sus cenadores axonales . Por lo tanto, las conexiones que estos tipos de neuronas pueden caracterizarse con un alto grado de precisión y reliability y dió estimaciones de conectividad en gran medida correctas. Con la excepción de estas conexiones sinápticas locales, los valores absolutos para las relaciones de conectividad entre dos tipos de neuronas obtenidos en el tramo preparativos son altamente problemático, en particular para las neuronas con grandes distancias inter-somáticas como en translaminar o, de largo alcance no local intralaminares conexiones sinápticas . Este problema se agrava cuando las condiciones rebanar no se han optimizado para una conexión sináptica dado a una edad definida. Para conectividad estimado novedosas metodologías más realistas, tales como electrones de alta densidad reconstrucciones microscópicas y 40-axo dendríticas superposición estructural 41 se han desarrollado. Sin embargo, incluso estas técnicas tienen que tener en cuenta la gran diversidad de interneuronas inhibidoras y también neuronas excitadoras.

Un problema adicional con las estimaciones de conectividad es que los contactos sinápticos distales, por ejemplo, los de mechón apical de las neuronas piramidales, puedeescapar a la detección. Cuando se mide en el soma de la amplitud de la respuesta sináptica es muy pequeño y es probable que desaparezca en el ruido (Qi et al., 2014, en la presentación). Sin embargo, este tipo de problema no se limita al enfoque de grabación emparejado pero también se producirá con otras técnicas utilizadas para estudiar la conectividad sináptica.

En reciente activación inducida por la luz años de microcircuitos neuronales (es decir, por la foto-liberación de glutamato enjaulado o por la activación de canalrodopsina) se ha utilizado para investigar la conectividad neuronal, incluso en una escala más grande 42-52. Sin embargo, con estos métodos ópticos no es posible identificar las propiedades estructurales del tipo neurona presináptica. Además, el número y ubicación de los contactos sinápticos establecidos por una conexión neuronal no pueden ser identificados, al menos no hasta la fecha. Grabaciones apareadas, por otro lado, permiten la caracterización de ambos neur pre y postsinápticasobre los tipos en un microcircuito sináptica. Esto es particularmente importante ya que muchos estudios han demostrado que tanto las interneuronas GABAérgicas y neuronas excitatorias son muy diversas con respecto a su morfología y fisiología sináptica 53-56. Por lo tanto, la identificación de las neuronas pre y postsinápticos es un requisito previo para la descripción de una conexión sináptica 57. Por último, las grabaciones pareadas permiten la grabación de diferentes configuraciones de la conexión sináptica (conexiones recíprocas, que coexisten uniones gap y sinapsis químicas). Por lo tanto, la técnica de grabación emparejado seguirá siendo un enfoque importante para el estudio de microcircuitos neuronales.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplifier HEKA EPC 10 USB Triple with 2 - 3 preamplifiers
Microscope Olympus BX51WI with 2 camera ports, a 4X objective, and a 40X water-immersion objective
Camera TILL Photonics VX55 infrared CCD camera
Workstation Luigs & Neumann Infrapatch 240 with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator Luigs & Neumann SM-5 x-y-z manipulators for 2 - 3 preamplifiers
Faraday cage Luigs & Neumann
Anti-vibration table Newport Spectra-Physics
Patchmaster HEKA
Microtome Microm International HM650V
Micropipette puller HEKA Sutter P-97
Neurolucida system Microbrightfield with Neurolucida and Neuroexplorer softwares

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Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones
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Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).More

Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358, doi:10.3791/52358 (2015).

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