Elektro og Morfologisk Karakterisering av Nevronale kretser i Akutt Brain Slices hjelp Grupperte patch-clamp Recordings

Summary

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Abstract

Kombinasjonen av patch clamp opptak fra to (eller flere) postsynaptisk kombinert nevroner (sammenkoblede innspillinger) i akutte hjerne slice preparater med samtidig intracellulær biocytin fylling gir en korrelert analyse av deres strukturelle og funksjonelle egenskaper. Med denne metoden er det mulig å identifisere og karakterisere både pre- og postsynaptiske nevroner av deres morfologi og elektrofysiologisk reaksjonsmønster. Sammenkoblede innspillinger tillate studere tilkoblingsmønsteret mellom disse nevronene samt egenskapene til både kjemisk og elektrisk synaptisk overføring. Her gir vi en steg-for-steg beskrivelse av prosedyrene som kreves for å få pålitelige sammenkoblede innspillinger sammen med en optimal utvinning av nervecellen morfologi. Vi vil beskrive hvordan par av nevroner som er tilkoblet via kjemiske synapser eller gap veikryss er identifisert i hjernen slice forberedelser. Vi vil skissere hvordan nerveceller blir rekonstruert for å få deres 3D morfologi dendritic og aksonal domene og hvordan synaptiske kontakter er identifisert og lokalisert. Vi vil også diskutere de begrensningene og begrensninger av den sammenkoblede opptaksteknikk, spesielt de som er forbundet med dendrittiske og aksonale trunkeringer under utarbeidelsen av hjerneskiver fordi disse sterkt påvirke tilkoblings estimater. Men på grunn av allsidigheten til den sammenkoblede opptak tilnærming vil det fortsatt være et verdifullt verktøy for å karakterisere ulike sider ved synaptisk overføring på identifiserte nevrale kretser i hjernen.

Introduction

Nevrale kretser mellom to postsynaptisk kombinert nevroner er byggesteinene i store nettverk i hjernen og er de grunnleggende enheter av synaptisk informasjonsbehandling. En forutsetning for karakterisering av slike neuronal mikrokretser er kjent at morfologien og funksjonelle egenskaper av både pre- og postsynaptiske nevroner partner, typen av synaptisk forbindelse (r), og dens struktur og funksjonelle mekanisme. Men i mange studier av synaptiske forbindelser i det minste en av nevroner i en mikrokrets er ikke godt karakterisert. Dette skyldes den relativt uspesifikke stimuleringsregimer som ofte brukes i studier av synaptisk tilkobling. Derfor er de strukturelle og funksjonelle egenskaper av den presynaptiske neuron heller ikke identifisert i det hele tatt eller bare i ganske liten grad (dvs. ekspresjon av markørproteiner etc.). Sammenkoblede opptak i kombinasjon med intracellulær farging av markører such som biocytin, neurobiotin eller fluorescerende fargestoffer er bedre egnet for å studere små nevrale kretser. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke mange strukturelle og funksjonelle parametre for en morfologisk identifisert synaptisk forbindelse på samme tid.

Såkalte 'enhetlige' monosynaptisk forbindelser mellom to nerveceller har blitt undersøkt i begge kortikale og subkortikale hjerneregioner ^1-10 bruker akutte slice forberedelser. Initialt ble laminert mikroelektroder som brukes i disse forsøkene; senere ble patch clamp monitorerings anvendes for å oppnå opptak av synaptiske signaler med et lavere støynivå og et forbedret tidsmessig oppløsning.

Et betydelig teknisk fremskritt var bruken av infrarød differensialinterferenskontrast (IR-DIC) optikk ^{11 til 14,} en mikroskopisk metode som i betydelig grad forbedret synlighet og identifisering av nevronene i hjernen skive slik at det ble mulig to innhente opptak fra visuelt identifisert synaptiske forbindelser ^15-17. Generelt er sammenkoblede innspillinger gjort i akutte slice forberedelser; bare svært få publikasjoner er tilgjengelige rapporterings opptak fra postsynaptisk koblet nevroner in vivo ^18-20.

Den viktigste fordelen med sammenkoblede opptak er det faktum at en funksjonell karakterisering kan kombineres med en morfologisk analyse ved både lys og elektronmikroskopnivå (se f.eks., ^7,16,21). Etter histokjemisk behandling, er dendrittiske og aksonal morfologi av postsynaptisk koblet neuron par spores. Deretter er det mulig å kvantifisere morfologiske egenskaper som lengde, romlig tetthet, orientering, forgrening mønster etc. Disse parametrene kan deretter gi grunnlag for en objektiv klassifisering av en spesifikk synaptisk tilkobling. Videre, i motsetning til de fleste andre teknikker som brukes for å studere neuronal connectiteten, sammen innspillinger også tillate identifisering av synaptiske kontakter for enhetlige synaptiske forbindelser. Dette kan gjøres direkte med en kombinasjon av lys og elektronmikroskopi ^16,21-27 eller bruke kalsium bildebehandling ^28,29 av dendrittutløperne. Men med den sistnevnte tilnærmingen bare eksitatoriske men ikke hemmende tilkoblinger kan studeres som det krever kalsium tilstrømningen via de postsynaptiske reseptor kanaler.

I tillegg til en detaljert analyse av synaptisk transmisjon i en definert neuronal mikrokretssammenkoblet opptak også tillater studiet av synaptisk plastisitet regler ^30,31 eller – i kombinasjon med agonist / antagonist søknad – modulering av synaptisk transmisjon av neurotransmittere slik som acetylkolin ³² og adenosin ^33.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer har blitt utført i samsvar med EU-direktivet for beskyttelse av dyr, den tyske dyrevernloven (Tierschutzgesetz) og Retningslinjene av Federation of European Laboratory Animal Science Association. 1. Set-up for Elektro Før du begynner med paret opptak, har en elektrofysiologi satt opp til å bli bygget. En kort oversikt hvordan et slikt oppsett er satt sammen er gitt nedenfor: Installere et anti-vibrasjon bordet der mik…

Representative Results

Sammenkoblede innspillinger er metoden for valg for en grundig karakterisering av morfologisk identifiserte uni- eller toveis synaptiske forbindelser samt gap junction (elektrisk) tilkoblinger (figur 1). Et eksempel på en sammenkoblet opptak i laget 4 av somatosensory fat cortex er vist i Figur 1A. Både enveis eksitatorisk og hemmende synaptiske forbindelser kan karakteriseres (figur 1B, C). Videre sammenkoblede innspillinger tillate å ta opp fra toveis synaptiske <e…

Discussion

Sammenkoblede opptak fra postsynaptisk kombinert eksitatoriske og / eller hemmende nerveceller er en svært allsidig tilnærming til studiet av nevrale kretser. Ikke bare gjør denne tilnærmingen tillater en å anslå synaptic tilkobling mellom nevroner typer, men også tillater å bestemme de funksjonelle egenskapene til tilkoblingen og morfologi av pre- og postsynaptiske nevroner. Videre kan agonist og / eller antagonist lett påføres neuroner i skivepreparater. Dette gjør det mulig å studere effekter av nevromodu…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA	EPC 10 USB Triple	with 2-3 preamplifiers
Microscope	Olympus	BX51WI	with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective
Camera	TILL Photonics	VX55	infrared CCD camera
Workstation	Luigs & Neumann	Infrapatch 240	with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-5	x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers
Faraday cage	Luigs & Neumann
Anti-vibration table	Newport Spectra-Physics
Patchmaster	HEKA
Microtome	Microm International	HM650V
Micropipette puller	HEKA	Sutter P-97
Neurolucida system	Microbrightfield		with Neurolucida and Neuroexplorer softwares