Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Kombinationen av patch clamp inspelningar från två (eller flera) synaptically kopplade nervceller (parade inspelningar) i akut hjärn slice beredningar samtidig intracellulär biocytin fyllning möjliggör en korrelerad analys av deras strukturella och funktionella egenskaper. Med denna metod är det möjligt att identifiera och karakterisera både pre- och postsynaptiska neuroner genom sin morfologi och elektrosvarsmönster. Kopplade inspelningar tillåter studera anslutningsmönstren mellan dessa neuroner liksom egenskaperna för både kemisk och elektrisk synaptisk överföring. Här ger vi en steg-för-steg-beskrivning av de förfaranden som krävs för att få tillförlitliga parade inspelningar tillsammans med en optimal återhämtning av neuron morfologi. Vi kommer att beskriva hur par av nervceller anslutna via kemiska synapser eller kanalförbindelser identifieras i hjärnan slice förberedelser. Vi kommer att beskriva hur nervceller rekonstrueras för att få deras 3D morfologi dendritic och axonal domän och hur synaptiska kontakter identifieras och lokaliseras. Vi kommer också att diskutera de förbehåll och begränsningar parade inspelningsteknik, särskilt de som förknippas med dendritiska och axonal stympningar under utarbetandet av hjärnan skivor eftersom dessa påverkar starkt uppskattningar anslutnings. Men på grund av mångsidigheten hos den parade inspelnings strategi kommer det att förbli ett värdefullt verktyg i att karakterisera olika aspekter av synaptisk transmission vid identifierade neuronala mikrokretsar i hjärnan.
Neuronala mikrokretsar mellan två synaptically kopplade nervceller är byggstenar i storskaliga nätverk i hjärnan och är grundläggande enheter av synaptiska informationsbehandling. En förutsättning för karakterisering av sådana neuronala mikrokretsar är att veta morfologi och funktionella egenskaper hos både pre- och postsynaptiska partner neuroner, typen av den synaptiska anslutning (er) och dess struktur och funktionsmekanism. Men i många studier av synaptiska förbindelser åtminstone en av de nervceller i en mikrokrets är inte väl karakteriserade. Detta beror på de relativt ospecifika stimuleringsprotokoll som ofta används i studier av synaptiska uppkoppling. Därför är de strukturella och funktionella egenskaperna hos den presynaptiska nervcellen antingen inte identifieras alls eller endast till en ganska liten utsträckning (dvs. uttrycket av markörproteiner osv). Kopplade inspelningar i kombination med intracellulär färgning av markörer sUCH som biocytin, neurobiotin eller fluorescerande färger är bättre lämpade för att studera små neuronala mikrokretsar. Denna teknik medger en för att undersöka många strukturella och funktionella parametrar av en morfologiskt identifierade synaptisk förbindelse samtidigt.
Så kallade "enhetlig" monosynaptic anslutningar mellan två nervceller har undersökts i både kortikala och subkortikala hjärnregioner 1-10 använder akuta slice förberedelser. Inledningsvis var skarpa mikroelektroder användes i dessa försök; senare var patch clamp inspelning användes för att erhålla inspelningar av synaptiska signaler med lägre ljudnivå och en förbättrad tidsupplösning.
En betydande tekniskt framsteg var användningen av infraröd differential interferens kontrast (IR-DIC) optik 11-14, en mikroskopisk teknik som avsevärt förbättrat synligheten och identifiering av nervceller i hjärnan skiva så att det blev möjligt to få inspelningar från visuellt identifierade synapsförbindelser 15-17. I allmänhet är parade inspelningar görs i akuta skiva preparat; endast ett fåtal publikationer är tillgängliga rapporterings inspelningar från synaptically anslutna nervceller in vivo 18-20.
Den viktigaste fördelen med parade inspelningar är det faktum att en funktionell karakterisering kan kombineras med en morfologisk analys vid både ljus- och elektronmikroskopi mikroskopisk nivå (se t ex., 7,16,21). Efter histokemisk bearbetning, är det dendritiska och axonal morfologi synaptiskt anslutna neuron paret spåras. Därefter är det möjligt att kvantifiera morfologiska funktioner såsom längd, rumslig densitet, orientering, förgrening mönster etc. Dessa parametrar kan sedan ge en grund för en objektiv klassificering av en specifik synaptisk anslutning. Dessutom, till skillnad från de flesta andra tekniker som används för att studera neuronala connectivitet, parade inspelningar medger också att identifiera synaptiska kontakter för enhets synapsförbindelser. Detta kan göras direkt med hjälp av en kombination av ljus och elektronmikroskopi 16,21-27 eller använda kalcium avbildning 28,29 av Dendritutskotten. Men med den senare metoden bara retande men inte hämmande anslutningar kan studeras eftersom det kräver kalciuminflödet via postsynaptiska receptorkanaler.
Förutom en detaljerad analys av synaptisk transmission vid en definierad neuronala mikrokrets parade inspelningar också tillåta studiet av synaptisk plasticitet regler 30,31 eller – i kombination med agonist / antagonist ansökan – modulering av synaptisk transmission av signalsubstanser såsom acetylkolin 32 och adenosin 33.
Kopplade inspelningar från synaptically kopplade retande och / eller hämmande nervceller är en mycket mångsidig strategi för studier av neuronala mikrokretsar. Inte bara denna metod tillåter en att uppskatta synaptiska anslutningar mellan neuron typer men också tillåter att bestämma de funktionella egenskaperna hos anslutningen och morfologi pre- och postsynaptiska neuroner. Vidare kan agonist och / eller antagonist lätt appliceras på neuroner i slice preparat. Detta gör att man kan studera effekterna av neu…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
Patchmaster | HEKA | ||
Microtome | Microm International | HM650V | |
Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |