Abstract
Analytische ultracentrifugatie (AUC) kan worden gebruikt om reversibele interactie tussen macromoleculen over een breed scala van interactie sterke en onder fysiologische omstandigheden te bestuderen. Dit maakt AUC een methode van keuze om kwantitatief te beoordelen stoichiometric en thermodynamica van homo- en hetero-vereniging die van voorbijgaande aard en omkeerbaar in biochemische processen zijn. In de modaliteit van sedimentatie evenwicht (SE), een evenwicht tussen diffusie en sedimentatie levert een profiel als functie van de radiale afstand die afhankelijk is van een specifiek associatiemodel. Hierin wordt een gedetailleerd SE protocol beschreven om het formaat en monomeer-monomeer associatie energie van een klein membraaneiwit oligomeer met een analytische ultracentrifuge bepalen. AUC-ES-label vrij, enkel op basis van fysische principes, en kan worden gebruikt zowel wateroplosbare en membraaneiwitten. Een voorbeeld wordt getoond van de laatste kleine hydrofoob (SH) eiwit in het menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV), Een 65 aminozuur polypeptide met een α-helix transmembraan (TM) domein dat pentameer ionenkanalen vormen. NMR-gebaseerde structurele gegevens blijkt dat SH eiwit twee protoneerbare His residuen in het transmembraan domein dat georiënteerd tegenover het lumen van het kanaal. SE experimenten werden ontworpen om te bepalen hoe pH beïnvloedt associatieconstante en de oligomere grootte van SH eiwit. Terwijl de pentamere vorm werd bewaard in alle gevallen werd de associatieconstante gereduceerd bij lage pH. Deze gegevens zijn in overeenstemming met een vergelijkbare pH-afhankelijkheid waargenomen voor SH kanaal activiteit, consistent met een lumenale oriëntatie van de twee Zijn residuen in SH-eiwit. Dit laatste kan bij lage pH elektrostatische afstoting en verminderde stabiliteit oligomeer ervaren. Kortom, deze werkwijze geldt wanneer kwantitatieve gegevens over subtiele eiwit-eiwit associatie veranderingen in fysiologische omstandigheden moeten worden gemeten.
Introduction
Analytische ultracentrifugatie 1-5 is een van de belangrijkste methoden interacties van macromoleculen onderzoeken onder fysiologische omstandigheden toegankelijk is voor zowel zwakke en sterke interacties. De methode is-label vrij en maakt gebruik van licht absorptie of interferentie, en zelfs fluorescentie optische systemen kunnen worden gebruikt om toegang te krijgen concentratietrajecten over verschillende ordes van grootte 6.
Deze methode is bijzonder nuttig omdat de meeste biochemische processen afhankelijk omkeerbaar interacties. De stoichiometrie en sterkte van deze interacties kwantitatief gekarakteriseerd worden om biologische processen te begrijpen, en een aantal methoden bestaan hiervoor 7, 8. Echter, voorbijgaande interacties moeilijk te bestuderen 9.
De keuze van een werkwijze macromoleculaire interacties te karakteriseren afhankelijk van de statische of dynamische karakter. In het eerste geval, Sedim entatie snelheid (SV) gebruikt, waarbij de mate van radiale transport wordt gemeten en complexen worden gefractioneerd op basis van verschillen in groeiende massa en vorm.
In tegenstelling, dynamische verenigingen die omkeerbaar zijn op de tijdschaal van het experiment niet fysiek kunnen worden gescheiden. In dit geval, zelf- of hetero-interacties leiden tot niet-covalente interacties in een evenwicht dat afhankelijk is van de totale eiwitconcentratie. Deze dynamische interacties kunnen worden onderzocht door zowel sedimentatie evenwicht (SE) en sedimentatie snelheid (SV) 10. De eerste methode is eenvoudiger uit te voeren en wordt hier beschreven. In SE, wordt centrifugeren uitgevoerd bij een voldoende lage snelheid zodat een evenwicht wordt bereikt tussen diffusie en sedimentatie. Op dit punt het evenwicht profiel van een optisch signaal (UV-VIS) als functie van de radiale afstand, kan worden geanalyseerd met vooraf ingestelde thermodynamische modellen voor verenigingen 11.
ve_content "> In het onderhavige document, sedimentatie evenwicht studie gegeven van de zelf-associatie van een virale membraaneiwit dat vormt ionenkanalen. Vanwege de hydrofobiciteit, wordt het experiment uitgevoerd in aanwezigheid van detergens, en in dit geval de dichtheid van oplosmiddel worden aangepast aan die van het detergens. De beschreven protocol zou identiek bij een water oplosbaar eiwit, behalve dat geen oplosmiddelen dichtheid overeenkomende zou zijn.Het eiwit gebruikt wordt gecodeerd in het menselijk respiratoir syncytieel virus (HRSV), een omhuld pneumovirus in de Paramyxoviridae familie die onderste luchtwegen aandoeningen bij zuigelingen, ouderen en immuungecompromitteerde bevolkingen wereldwijd 12 veroorzaakt. Maximaal 64 miljoen gemelde gevallen van HRSV infectie en 160.000 sterfgevallen per jaar.
De HRSV genoom transcribeert 11 eiwitten, waaronder de drie membraan eiwitten F, G en klein hydrofoob (SH). SH-eiwit is betrokkenin de pathogenese van RSV-infectie. RSV zonder het SH-gen (RSVΔSH) levensvatbaar, veroorzaakte vorming van syncytia en groeide als het wildtype (WT) virus 13-16. Echter, RSVΔSH virus gerepliceerd 10-voudig minder efficiënt dan de WT in de bovenste luchtwegen 15, 16. Ook werd RSVΔSH virus verzwakt in vivo muis en chimpansee modellen 13, 17.
De SH-eiwit is een 64 (RSV subgroep A) of 65 (RSV subgroep B) aminozuren lang type II integraal membraaneiwit dat voornamelijk accumuleert in de membranen van het Golgi 18. SH eiwit heeft een voorspeld a-spiraalvormige transmembraan (TM) domein 19 die is sterk geconserveerd 20,21. De C- en N-terminale domeinen extramembrane cytoplasmatisch respectievelijk lumenally / extracellulair en georiënteerd.
Beide synthetische TM domein (residuen 18-43) En de volledige lengte SH-eiwit is aangetoond dat homopentamers in verschillende detergentia te vormen. De homopentameric vorm is verantwoordelijk voor kanaal activiteit in vlakke lipidendubbellagen 22,23. De correcte oriëntatie van de TM monomeren in de lipide bilaag werd eerst bepaald middels plaatsspecifieke infrarood dichroïsme 23, waaruit bleek His-22 in een lumen, dicht bij inter-spiraalvormige oriëntatie. Dezelfde TM domein oriëntatie werd bevestigd door NMR studies dat de pentamere reconstrueerde-helix bundel van het eiwit van volledige lengte in dodecylphosphocholine (DPC) micellen 22. In deze "micel-model, werd een a- schroeflijnvormige TM domein N-terminaal geflankeerd door een a-helix en C-terminaal van een uitgebreide B-haarspeld. De twee protoneerbare residuen van SH eiwit, His-22 en His-51 worden in de TM domein (lumenally georiënteerd), en aan het uiteinde van de extramembrane C-terminale β haarspeld (ver van de zender porie), respectievelijk. In een bicellar Envirooverschrijdende aanpak echter de TM α-helix strekt zich uit tot His-51, en beide zijn resten zijn toegankelijk voor het lumen van het kanaal 24. De kanaalstructuur neemt een trechtervormig architectuur 22, waarbij het smallere gebied (Ser-29, Cys-45) 22 is bekleed met hydrofobe zijketens (Ile-32, Ile-36, Ile-40 en Leu-44), en definieert Ile-36 het smalste punt in het kanaal lumen. His-22 bevindt zich op de grootste opening van de trechter, terwijl His-51 aan het uiteinde van de kleinste opening.
In dit document, is analytische centrifugatie in een sedimentatie evenwicht modus gebruikt om te bepalen of zijn protonering beïnvloedt de stabiliteit van de SH eiwit pentameer. In dit geval werd SH eiwit opgelost in C14-betaine detergent, die eerder gewend SH eiwit vormt oligomeren pentameer 22 tonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol is gebaseerd op de volgende bronnen, die worden doorverwezen voor meer details en bijzondere overwegingen 3, 25-28.
1. Dichtheid matching afwasmiddel micellen met 2 H 2 O
Opmerking: De dichtheid van de bufferoplossing moet worden aangepast aan de dichtheid van het detergens micellen. Vaak dichtheid aanpassende middelen omvatten 2 H 2 O, H 2 18 O 2 H 2 18 O, glycerol en sucrose 29. H 2 18 O dezelfde dichtheid 2 H2O en kan een betere keuze zijn als deuterering uitwisselbare protonen in het eiwit niet gewenst. In deze procedure, de dichtheid van 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) detergens in 50 mM Tris pH 7,3, 100 mM NaCl wordt vergeleken met 2 H 2 O. Als een eerste schatting van de volgende concentraties van2 H2O gebruikt: 10, 30, en 50% v / v.
1.1. Monstervoorbereiding
- Bereid de volgende voorraad oplossingen en filter steriliseren door een 0,2 urn spuitfilter: 50 ml 500 mM Tris pH 7,3 en 1 M NaCl (10X bufferoplossing); 1 ml 250 mM C14SB (50X schoonmaakmiddel).
- Bereid 200 pl monsteroplossing door mengen 20 ui 10X bufferoplossing, 4 ui 50X schoonmaakmiddel 20 ui 2 H2O (99,9%) en 156 gl gedeïoniseerd H2O Bereid ook 200 pl referentieoplossing door menging van 20 ui 10X bufferoplossing, 20 ui 2 H2O (99,9%) en 160 gl gedeïoniseerd H2O
- Herhaal stap 1.1.2 voor de andere 2 H 2 O concentraties, namelijk 30% en 50%, het aanpassen van de 2 H2O en H2 O bedragen behoren.
1.2. Assemblage van 6-kanaals AUC cellen en sample laden in de cellen.
Opmerking: Er zijn twee soorten AUC cel afhankelijk van het monster laadmethode. Cellen zonder externe vulling is om voorafgaand aan het afdichten van de cel worden geladen, terwijl externe vullen cellen kan worden geladen nadat de cellen worden verzegeld. Montage van een externe-fill AUC cel is eerder 3 beschreven. In dit protocol wordt de montage van een 6-kanaals AUC cel zonder externe vulling beschreven. Het belangrijkste verschil is dat het schroef ringen aan beide zijden, die apart moeten worden aangescherpt, en het hoeft niet behuizing stekkers nodig (afb. 1). Het verschil in assemblage stappen worden hieronder aangegeven.
Figuur 1. Exploded view van een 6-kanaals AUC cel zonder externe vulling. Dit cijfer is gewijzigd van Beckman Coulter An-50 Ti en An-60 Ti de analytischecal Rotor, Cellen, en Counterbalance handleiding.
- Bereid twee venstercombinaties per AUC cel met saffieren raam in plaats van kwarts venster (Fig. 2). Plaats het raam pakking in het venster houder. Buig het venster liner en plaats deze in het venster houder zodanig dat de kloof tegenovergestelde is gevormd om het venster houder spiebaan. Plaats de saffier venster binnen het venster liner, het uitlijnen van het merk met het raam houder spiebaan.
Opmerking:. Het venster kwarts is samendrukbaar en dus meer lichtbreking produceren met hoge snelheid 28, 30 daarom voor interferentiemetingen boven 30.000 rpm, zoals in deze dichtheid matching experiment worden sapphire windows gebruikt. Een saffier venster zwaarder dan kwartsvenster en heeft een "X" geëtst op zijn kant.
Figuur 2. Exploded view of het raam monteren. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Beckman Coulter An-50 Ti en An-60 Ti Analytische Rotor, Cellen, en Counterbalance gebruikershandleiding
- Plaats de cel behuizing met het onderdeelnummer ondersteboven. Met de spiebanen in lijn met de behuizing sleutel, schuiven in de cel behuizing eerst een 6-sector middenstuk met afgeschuinde kant naar beneden, gevolgd door een raam assemblage met het venster naar beneden (afb. 1, links).
- Smeer de schroef ring schroefdraad en schroef ring ring met spinkote. Plaats een schroef ring ring bovenop het raam montage. Installeer de schroef ring in het venster behuizing met het woord "OUT" geconfronteerd buiten. Draai de schroef ring met behulp van de cel uitlijnen tool.
- Met behulp van de momentsleutel, draai de schroef ring om slechts 60 inch-pounds.
- Plaats de cel met het onderdeelnummer rechtop en gepositioneerd op 12-middag. LOAD 120 ul verwijzing in de linker rijen en 110 ul monster in de juiste rijen. Zorg ervoor dat elk monster en referentie juist gekoppeld.
Let op: exacte monstervolume niet kritiek, maar de verwijzing moet iets meer volume dan het monster (5-10 pl) hebben zodat het monster meniscus verschillend zal zijn. - Schuif in de cel behuizing een raam assemblage met het venster naar beneden (afb. 1, rechts). Zorg ervoor dat u de cel zeer te verstoren en het morsen van de inhoud.
- Herhaal stap 1.2. 3 en 1.2. 4, een aanscherping van de tweede schroef ring tot 120 inch-pond. Keer de cel en draai de eerste schroef ring tot 120 inch-pond.
- Laad de cellen in de rotor, installeert u de rotor in de centrifuge en installeer de monochromator volgens de instructies van de fabrikant 28.
Opmerking: Details van deze step kan ook worden gevonden in deze referentie 3.
1.3. Het opzetten van interferentie meting
- Start de gebruikersinterface software voor de AUC instrument uitvoeren laseropstelling en radiale kalibratie voor elke cel bij 3000 rpm, volgens de instructies van de fabrikant, dat kort worden samengevat in de volgende stap.
- 1.3.1.1 Na voldoende vacuüm is bereikt (<100 micron), voert u de centrifuge bij 3000 rpm. Voorbeeld van het interferentiepatroon in de gebruikersinterface software en de laser parameters aangepast om de beste contrast te verkrijgen.
- Maak een nieuwe set-up bestand (Bestand | Nieuw bestand) met vermelding van "Equilibrium" en "Storing" meting. Het opzetten van een sedimentatie evenwicht methode ("Methode" knop) om te draaien met 45.000 toeren per minuut of de hoogste snelheid voorzien voor eiwit monsters, als dit hoger is, met run temperatuur op 20 ° C en het verzamelen van 1 scan om de 15 minuten. Monitor evenwicht voortgang door het openen van de gegevensbestanden in HeteroAnalysis en functie "Match" selecteren na ten minste 12 uren (ongeveer overnacht, fig. 3).
Opmerking: een soortgelijke functie is ook beschikbaar in SEDFIT (Opties | Laden Opties | Test Aanpak Equilibrium).
Figuur 3. Resultaat uit HeteroAnalysis Match functie. De Match-functie kan worden gebruikt om te controleren evenwicht vooruitgang door het vergelijken RMSD tussen opeenvolgende scans en de laatste scan. Dit voorbeeld toont bereiken van evenwicht na 8 uur zoals aangegeven door RMSD waarden asymptotisch X-as.
1.4. Data-analyse
- Voor elke set van monsters, plot de helling van de radiale verdeling profiel tegen de 2 H 2 O concentratie.
Opmerking: De verdeling zal een zeer ondiepe exponentiële dat ap zijnderingen lineariteit. X-as intercept correspondeert met de overeenkomstige 2 H2O concentratie. - Voor meer nauwkeurige resultaten, voeren het experiment in een aantal herhalingen. Als alternatief, herhaal het experiment met een smaller bereik van 2 H 2 O concentratie.
2. Sedimentatie evenwicht van SH in C14SB micellen
2.1. Run parameters
- Bereken buffer dichtheid en viscositeit, eiwit gedeeltelijk specifiek volume en centrifugeersnelheid met SEDNTERP. Om buffer dichtheid en viscositeit, selecteer Compute berekenen in het hoofdstuk "Buffer gegevens Select" en dus voer de buffer componenten, met inbegrip van de D 2 O concentratie.
- 2.1.1.1 Om eiwit gedeeltelijke specifiek volume, selecteer Compute berekenen in het hoofdstuk "V-bar" en voer het eiwit aminozuursequentie. Geef het hoogste verwachte oligomere grootte in "Maak een oligomeer van deze monomeer: N ="veld, in dit geval N = 5. Bereken de snelheid door het invoeren van waarden in het gebied RPM het hoofdvenster tot σ ≈ 1; dit is een vuistregel om een goede exponentiële vorm van de radiale verdeling profiel 25 te verzekeren.
Opmerking: De berekende waarden voor dit experiment was als volgt: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 cP = 0,7569 ml / g, ω = 1 16000 rpm. - Bereken daaropvolgende snelheden te volgen om voldoende verschil tussen de verdeling profiel zorgen bij één snelheid en de komende 25.
Opmerking: Dit kan ook gedaan worden vanuit de functie "Schat evenwicht rotorsnelheden functie" in SEDFIT, die rekening houdt met de kolom oplossing (vulling volume).
2.2. Monster voorbereidingen
- Bereid 1 ml standaardoplossing met 5 mM C14SB en 32,3% 2 H2O zoals bepaald uit dichtheid matching experiment (hoofdstuk 1), door het mengen van 100 ui 10X buffer oplossing;n (stap 1.1.1), 20 pl 50X reinigingsoplossing (stap 1.1.1), 323 ui 2 H2O (99,9%) en 527 gl gedeïoniseerd H2O
- Los gelyofiliseerd, HPLC-gezuiverde SH peptiden (expressie en zuivering eerder 31 beschreven) in geschikt oplosmiddel zoals methanol of 50% v / v waterig acetonitril. Meet A280 van de opgeloste peptiden in een microliter schaal UV / Vis spectrofotometer en portie voor drie monsters naar A 280 te geven, 12mm = 0,3, 0,5 en 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0,417 en 0,67) per wanneer verdund tot 130 pi. Lyofiliseren de monsters 's nachts en resuspendeer in 130 ul referentie-oplossing (stap 2.2.1) om de sample oplossingen.
Opmerking: SH-eiwit kan worden gedetecteerd van UV / Vis-absorptie bij 280 nm want deze bevat Trp en Tyr residuen. Eiwitten zonder aromatische resten kunnen worden gedetecteerd door taggen met een geschikte chromofoor, met een Trp-bevattende mutant, of door mengennvu metingen in plaats van absorptie. - Volg de stappen in hoofdstuk 1.2 aan een 6-kanaals AUC cel met kwarts ramen monteren. Laad de hoogste concentratie monster (A280, 12mm = 0.8) in het kanaal dichtst bij het centrum rotor en de laagste concentratie van het monster (A280, 12mm = 0,3) verst van de rotor centrum.
2.3. Opzetten extinctiemetingen
- Maak een nieuwe set-up bestand (Bestand | Nieuw bestand) met vermelding van "Equilibrium" en "Absorptie" meting. Geef op 280 nm als de golflengte detector.
- Voeren radiale kalibratie bij 3000 rpm door te controleren "Radial kalibratie vóór eerste scan" in Scan Opties, het verzamelen van gegevens met vermelding van een lage resolutie, bijvoorbeeld met Radial stap size = 0,01 cm, repliceert = 3 (lage resolutie, snel), en het uitvoeren van een Enkele Scan . Nadat de scan is voltooid, schakelt u de optie.
- Het opzetten van een sedimentatie evenwicht methode ("Method toets ") te draaien op de eerste snelheid berekende stap 2.1.3, bij 20 ° C, en laat 1 scan elke 30 minuten. In elke cellen '"Detail", geeft het verzamelen van gegevens met een lage resolutie als in stap 2.3.2. Monitor evenwicht voortgang door het openen van de gegevensbestanden in HeteroAnalysis en selecteren van de functie "Match" na ten minste 18 uren (ongeveer overnacht, fig. 4).
Let op: het bereiken van evenwicht kan aanzienlijk langer duren voor de eerste snelheid, terwijl de daaropvolgende snelheden minder tijd in beslag neemt.
Figuur 4. Resultaten van HeteroAnalysis Match functie. De eerste en tweede snelheden (boven links en rechts) lijken evenwicht te hebben bereikt, maar het is beter om een paar uur te wachten om zeker te zijn. In vergelijking zijn de derde en vierde snelheden (onderaan links en rechts) duidelijk evenwicht bereiktin een kortere tijd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Zodra er een evenwicht is, verzamel een enkele scan met een hoge resolutie, bijvoorbeeld met Radial stap size = 0,001 cm, repliceert = 10 (hoge resolutie, langzaam).
- Nadat de scan is voltooid, herhaalt u stap 2.3.3 en 2.3.4 voor de volgende snelheid.
- Optioneel, als de tijd die nodig is om een evenwicht bereiken voor elk toerental bekend is (berekend of uit ervaring), het opzetten van de sedimentatie evenwicht methode scan om alle snelheden berekend in stap 2.1.3 en omvatten tot 1 scan te verzamelen na de evenwichtstijdstip voor elk snelheid. In dit geval geeft u hoge resolutie gegevensverzameling in elk cellen '"Detail".
2.4. Data-analyse in SEDFIT en SEDPHAT
Opmerking: Voor meer informatie en overwegingen in data-analyse wordt verwezen to de volgende website: www.analyticalultracentrifugation.com.
- Open hoge resolutie scans in SEDFIT (Data | load sedimentatie evenwicht gegevens) en splitsing van de gegevens in 3 kanalen (deze komen overeen met verschillende concentraties voor elk monster; Opties | laden Opties | Spaar 6-kanaals Raw Data in 3 subsets).
- Re-open data bestanden die behoren tot hetzelfde monster en dezelfde concentratie, maar met verschillende snelheden in SEDFIT. Pas de meniscus (verticale rode lijn), celbodem (verticale blauwe lijn) en montage grenzen (verticale groene lijnen), en de gegevens voor gebruik exporteren in SEDPHAT (Data | Gegevens exporteren naar SEDPHAT). Voer de berekende parameters in stap 2.1.1, evenals rotor en soort middelpunt zoals gevraagd. Herhaal deze stap voor elk monster en concentratie.
- Open alle gegevens van hetzelfde monster (alle concentraties en snelheden) in SEDPHAT en in experiment Parameters vullen; Een voorbeeld wordt getoond in Fig. 5.
Opmerking: wanneer D 2 O wordt toegevoegd in de buffer, Deut king uitwisselbare protonen aanzienlijk kunnen veranderen het molecuulgewicht van het proteïne, vooral in water oplosbare eiwitten. Membraaneiwitten, vooral kleine, zoals SH-eiwit, zijn minder getroffen, omdat membraan ingesloten gebieden worden beschermd tegen uitwisseling. Om dit te corrigeren, het invoeren van de "buffer D mol fractie".
Let op: Bij deze stap is het aanbevolen om de bewerkte dataset afzonderlijk besparen door menu Data selecteren | Kopieer alle gegevens en opslaan als New Config. - Selecteer een model en in de globale parameters voor dat model te vullen.
Opmerking: Als voorbeeld, de "Monomeer-n-Mer zelfassociatie" model en de parameters worden getoond in Fig. 6.
Figuur 5. Een voorbeeld van hoe in experimentele parameters in te vullen.
bestanden / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg "/>
Afbeelding 6. Een voorbeeld van hoe in algemene parameters in te vullen voor het Monomeer-n-Mer Self-Vereniging model.
- Voer een Global Fit door het selecteren van menu-Fit | Global Fit en wacht tot de pasvorm convergeert. Noteer (of neem een screenshot van de) montage resultaten, met name de wereldwijde gereduceerde chi-kwadraat en log K een waarden. Extract andere gegevens, zoals fit gegevens en montage residuen van menu Kopiëren en Toon | Toon thermodynamische gegevens.
- Keer terug naar Global Parameters en check M (1) naar het monomeer moleculair gewicht fit en herhaal stap 2.4.5. Noteer de gemonteerde molecuulgewicht en wereldwijde verminderd chi-kwadraat.
- Herhaal stap 2.4.3 naar 2.4.6 voor elk model te testen en vergelijken de pasvorm kwaliteit van elk model door de verminderde wereldwijde chikwadraatwaarde evenals montage residuen vergelijken.
Opmerking: Kleine en willekeurige montage restwaarden geeft over het algemeen een goede pasvorm, en het model dat het beste past zouhebben de kleinste wereldwijde gereduceerde chi-kwadraat. De ingebouwde monomeer molecuulgewicht en de chi-kwadraat waarde niet wezenlijk van die van de vaste (theoretisch) molecuulgewicht. - Bereken het betrouwbaarheidsinterval voor de verkregen log Ka door waarde door eerst Statistieken | Kritische chi-kwadraat voor fouten oppervlak projecties en het invoeren van de gewenste betrouwbaarheidsinterval. Ga vervolgens naar de Statistiek | Genereer 1-dimensionale fout projectiedoek en deselecteren log Ka in dialoogvenster Algemene Parameters om de chi-kwadraat waarden voor log Ka verkrijgen.
Opmerking: de lezer wordt geadviseerd om de volgende bronnen (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) voor meer informatie raadplegen over de methode 32 evenals illustratie van deze methode 33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De radiale verdeling profiel van C14SB detergens micellen in 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 vormt een zeer ondiepe exponentiële dat een lineair model (figuur 7A) worden aangebracht. De helling van deze verdeling is omgekeerd gecorreleerd met D2O concentratie (figuur 7B). Het punt waar de helling nul is, dat wil zeggen, de bijbehorende D2O concentratie bleek 32,3% te zijn.
Zie figuur 7 hieronder.
Hetzelfde experiment werd herhaald voor verschillende buffers: 50 mM natriumfosfaat, 100 mM NaCl pH 5,5 en 50 mM fosfaat-citraat, 100 mM NaCl pH 3 te verkrijgen overeenkomende D2O concentraties van 30.3% en 41.0%, respectievelijk.
Monsters van SH wildtype (wt) in detergens werden blootgesteld aan pH 3, 5.5 en 7.3 (totaal 6 monsters), gevolgd door centrifugatie bij 15.000, 19.000, 23.000, 28.000, 34.000 en 42.000 rpm. Data verkregen bij lagere snelheden niet betrouwbaar kan worden aangebracht, mogelijk omdat evenwicht niet was bereikt, dus gegevens uit de vier hogere snelheden gebruikt. Bij pH 7,3, SH WT bleek pentameren (figuur 8 en tabel 1) schijnbaar log Ka = 21.35 (tabel 2) te vormen. De associatieconstante veranderde niet bij pH 5,5, maar significant verlaagd bij pH 3. Dit is consistent met eerdere verslagen 24, een daling van conductantie bij lagere pH gemeld met een pK van 4,5.
Zie figuur 8 hieronder.
Zie onderstaande tabel 1.
Figuur 7. Dichtheid matching van C14SB met D 2 O. (A) Radial distribution profiel gevormd door C14SB detergens micellen in 50 mM Tris, 100 mM NaCl pH 7,3 met 25, 30 en 35% D 2 O. De gegevens werden afzonderlijk gemonteerd op een lineair model (zwart). (B) De hellingen werden uitgezet tegen D2O concentratie (zwarte vierkanten) en gemonteerd op een lineair model (rode lijn). De bijpassende D2O concentratie vermeld (rode pijl).
Figuur 8. Inrichting SH in C14SB tot monomeer-pentameer model. Radiale distributieprofiel van SH in C14SB bij pH 7 (open cirkels) bleek het beste bij de monomeer-pentameer zelfassociate model (zwarte vaste lijn). Fitting resterende wordt hieronder weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Model (n-mer) | Chi-kwadraat (vaste MW) | Chi-kwadraat (gemonteerd MW) | Ingericht MW |
| 3 | 15,444 | 1,0492 | 13477 Da |
| 4 | 3,8094 | 1,0469 | 9889 Da |
| 5 | 1,0499 | 1,0497 | 7822 Da |
| 6 | 2,5994 | 1.547 | 6504 Da |
| 7 | 6,1667 | 1,2112 | 5743 Da |
Tabel 1. Vergelijking van wereldwijde verlaagde chi-kwadraat-waarden van verschillende monomeer-n-mer modellen.
| pH | Ondergrens (163;) | Log Ka | Bovengrens (1σ) |
| 3 | 17,432 | 17,576 | 17,737 |
| 5.5 | 20,064 | 20,419 | 20,839 |
| 7.3 | 20,687 | 21,052 | 21,492 |
Tabel 2. Vergelijking van de schijnbare log Ka-waarden bij verschillende pH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document biedt een experimenteel protocol voor de monstervoorbereiding en analyse van oligomerisatie van een kleine membraaneiwit in detergent behulp evenwicht sedimentatie. De beschreven protocol is evenzeer -en simpler- voor oplosbare eiwitten, zoals de dichtheid matching stap niet vereist. Inderdaad, wordt het systeem gevormd door een mengsel van afwasmiddel en eiwit. Sedimentatie studies moet het detergens onzichtbaar voor het gravitatieveld zodat het niet bijdraagt aan het deeltje flotatie. Zo is de dichtheid van het reinigingsmiddel moet zorgvuldig worden aangepast door toevoeging van D2O de buffer, met de beperking dat als het detergens te dicht is, bv. SDS, zelfs 100% D2O kan evenaren. De dichtheid matching stap is niet vereist bij het werken met een in water oplosbaar eiwit, omdat het monster geen wasmiddel heeft.
In onze toepassing, een klein viraal eiwit dat ion chann vormtels is gebruikt. Net als alle viroporins, SH-eiwit heeft een α-helix transmembraan domein, en daarom moet worden bestudeerd in een reinigingsmiddel dat niet zijn inheemse oligomere grootte zal verstoren.
Vóór deze studies dus geschikt detergentia moeten worden gescreend. Bijvoorbeeld, in eerdere studies SE SH eiwit gevormd pentameer oligomeren in DPC, C8E5 en C14-betaïne en pentameren werden ook waargenomen tijdens elektroforese in het mild reinigingsmiddel PFO 22. Al deze producten geschikt zijn voor SE, omdat hun dichtheid worden geëvenaard door toevoeging van D 2 O. De monsters moeten worden getest door sedimentatie snelheid (SV), die het minimum aantal onderhavige 34 species verschaft.
Ook zullen geschikte reinigingsmiddelen meerdere soorten SV en meerdere banden in PFO elektroforese indicatief meerdere niet-specifiek bond. Nuttige informatie uit SE wordt verkregen wanneer het overheersende aantal soorten pre verstuurd in het systeem niet boven twee; bij SH eiwit, werd de data gemonteerd op een evenwicht tussen monomeren en pentameren.
Het is belangrijk op te merken dat de voor het SE gegevens aanpassen model, ook zo eenvoudig mogelijk, bijv., Dient een enkele soort van onbekende molecuulgewicht eerst beproefd worden, gevolgd door reversibele evenwichten tussen monomeer en oligomeren van toenemende omvang. Meer complexe modellen hebben een hogere dubbelzinnigheid geassocieerd. Ook kunnen kleine populaties van andere kleinere of grotere oligomeren niet gedetecteerd, en het model precies aangeven wat de overheersende species aanwezig. Bij viroporins Dit blijkt vooral omdat de grootte verandert oligomere afhankelijk subtiele experimentele omstandigheden, bijvoorbeeld wasmiddel, pH, eiwitconcentratie, centrifugeersnelheid of mutaties, bijvoorbeeld in Hepatitis C Virus p7 35, griep A M2 36 of SH eiwit 24.
jove_content "> De voor WT SH eiwit resultaten tonen duidelijk aan dat de associatie constante van de pentameer wordt verminderd bij pH 3. Deze resultaten wedstrijd kanaal activiteit metingen verkregen met SH eiwit in synthetische lipidendubbellagen waar geleiding sterk bij pH 3 werd verminderd (pK ~ 4,5), terwijl deze constant tussen pH 7 en 24 5. Op basis van deze resultaten bleven, is het mogelijk dat SH kanaal activiteit enigszins geregeld door lagere pH bij aanwezigheid in natieve biologische membranen. Hoewel in het Golgi lumen de pH enige een eenheid onder dat van het cytoplasma, intravesicular pH daalt langs de endocytische route van pH 6,0-6,5 in vroege endosomen pH 4.5-5.5 in late endosomen en lysosomen 37. In de geïnfecteerde cel, kan de pK voor geleiding wijzigingen of pentameer stabiliteit hoger dan die in vitro en hierin eerder 24 derhalve pH zou inderdaad een rol spelen bij het moduleren van kanaal activiteit gedurende de levenscyclusvan het virus. Mutatie van protoneerbare residuen zijn in het kader van de geïnfecteerde cel een interessante weg voor toekomstige experimenten 38.Tenslotte wordt de studie van SH eiwit vergemakkelijkt door de aanwezigheid van Trp in zijn sequentie, vergemakkelijkt UV absorptiemetingen. Of soluble- eiwitten - kan echter kennis van de structuur van het oligomeer invoering van Trp op ongevoelig locaties, bijvoorbeeld lipide -of oplosmiddelen gerichte delen van het eiwit in membraan mogelijk. Als alternatief kan het eiwit worden gemerkt met een zichtbaar absorberende of fluorescerend label.
Kortom, dit protocol beschrijft de toepassing van SE om oligomere grootte en de associatie constanten van een bepaalde virale kanaal, wanneer experimentele parameters worden gewijzigd vast te stellen. In dit geval werd de pH gevarieerd om het effect op de stabiliteit van zijn protonering, maar veel andere hypothese onderzoeken kunnen worden getest, zoals effecten van mutaties op de structurelebetrouwbaarheid op deze oligomeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-(N,N-dimethylmyristylammonio)propanesulfonate | Sigma | T0807 | |
| Deuterium oxide 99.8% | Cambridge Isotope | DLM-4-99.8 | |
| An-50 Ti Rotor, Analytical, 8-Place | Beckman Coulter | 363782 | |
| An-60 Ti Rotor, Analytical, 4-Place | Beckman Coulter | 361964 | |
| Cell housing | Beckman Coulter | 334784 | |
| 12 mm six-channel centerpiece, epon charcoal-filled | Beckman Coulter | 331376 | |
| Window holder | Beckman Coulter | 305037 | |
| Window gasket | Beckman Coulter | 327021 | |
| Window liner | Beckman Coulter | 362329 | |
| Sapphire window | Beckman Coulter | 307177 | |
| Quartz window | Beckman Coulter | 301730 | |
| Screw-ring washer | Beckman Coulter | 362328 | |
| Screw ring | Beckman Coulter | 301922 | |
| Spinkote | Beckman Coulter | 306812 | |
| Torque stand assembly | Beckman Coulter | 361318 | |
| Counterbalance | Beckman Coulter | 360219 | |
| Cell alignment tool | Beckman Coulter | 362340 | |
| SEDNTERP | http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page | ||
| HeteroAnalysis | http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp | ||
| SEDFIT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm |
||
| SEDPHAT | http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm |
References
- Laue, T. M., Stafford, W. F. 3rd
- Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
- Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell. , e1530 (2009).
- Rivas, G., Stafford, W., Minton, A. P. Characterization of heterologous protein-protein interactions using analytical ultracentrifugation. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 19, 194-212 (1999).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for association and assembly the study of protein. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 430-436 (2006).
- MacGregor, I. K., Anderson, A. L., Laue, T. M. Fluorescence detection for the XLI analytical ultracentrifuge. Biophys. Chem. 108, 165-185 (2004).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-Protein Interactions - Methods for Detection and Analysis. Microbiol. Rev. 59, 94-123 (1995).
- Alexandrov, A. A facile method for high-throughput co-expression of protein pairs. Mol. Cell. Proteomics. 3, 934-938 (2004).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of transient protein-protein interactions. J. Mol. Biol. 325, 991-1018 (2003).
- Ebel, C. Sedimentation velocity to characterize surfactants and solubilized membrane proteins. Methods. 54, 56-66 (2011).
- Minton, A. P. Quantitative characterization of reversible macromolecular associations via sedimentation equilibrium: an introduction. Exp. Mol. Med. 32, 1-5 (2000).
- Dowell, S. F. Respiratory syncytial virus is an important cause of community-acquired lower respiratory infection among hospitalized adults. J. Infect. Dis. 174, 456-462 (1996).
- Bukreyev, A., Whitehead, S. S., Murphy, B. R., Collins, P. L. Recombinant respiratory syncytial virus from which the entire SH gene has been deleted grows efficiently in cell culture and exhibits site-specific attenuation in the respiratory tract of the mouse. J. Virol. 71, 8973-8982 (1997).
- Fuentes, S., Tran, K. C., Luthra, P., Teng, M. N., He, B. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein. J. Virol. 81, 8361-8366 (2007).
- Jin, H. Recombinant respiratory syncytial viruses with deletions in the NS1, NS2, SH, and M2-2 genes are attenuated in vitro and in vivo. Virology. 273, 210-218 (2000).
- Karron, R. A. Respiratory syncytial virus (RSV) SH and G proteins are not essential for viral replication in vitro: clinical evaluation and molecular characterization of a cold-passaged, attenuated RSV subgroup B. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 94, 13961-13966 (1997).
- Whitehead, S. S. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J. Virol. 73, 3438-3442 (1999).
- Rixon, H. W. The small hydrophobic (SH) protein accumulates within lipid-raft structures of the Golgi complex during respiratory syncytial virus infection. J. Gen. Virol. 85, 1153-1165 (2004).
- Collins, P. L., Mottet, G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 74, 1445-1450 (1993).
- Collins, P. L., Olmsted, R. A., Johnson, P. R. The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virol. 71, 1571-1576 (1990).
- Chen, M. D., Vazquez, M., Buonocore, L., Kahn, J. S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J. Infect. Dis. 182, 1228-1233 (2000).
- Gan, S. W. The small hydrophobic protein of the human respiratory syncytial virus forms pentameric ion channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Gan, S. W., Ng, L., Xin, L., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein Sci. 17, 813-820 (2008).
- Li, Y. Inhibition of the Human Respiratory Syncytial Virus Small Hydrophobic Protein and Structural variations in a bicelle environment. J. Virol. 88 (22), 11899-914 (2014).
- Burgess, N. K., Stanley, A. M., Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weights and association equilibrium constants using sedimentation equilibrium and sedimentation velocity. Meth. Cell. Biol. 84, 181-211 (2008).
- Cole, J. L., Lary, J. W., Moody, T. P., Laue, T. M. Analytical Ultracentrifugation: Sedimentation Velocity and Sedimentation Equilibrium. Meth. Cell. Biol. 84, 143-179 (2008).
- Fleming, K. G. Determination of membrane protein molecular weight using sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Curr. Protoc. Prot. Sci. 53, 17.12.11-17.12.13 (2008).
- An-50 Ti and An-60 Ti Analytical Rotor, Cells, and Counterbalance. , Beckman Coulter, Inc. Available from: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/techdocs?docname=LXLA-TB-003 (2005).
- Mayer, G. Studying membrane proteins in detergent solution by analytical ultracentrifugation: Different methods for density matching. Prog. Colloid Polym. Sci. 113, 176-181 (1999).
- Laue, T. Ch. 20.3. Current Protocols in Protein Science. 20, John Wiley & Sons, Inc. 20.23.21-20.23.13 (2001).
- Gan, S. W. The Small Hydrophobic Protein Of The Human Respiratory Syncytial Virus Forms Pentameric Ion Channels. J. Biol. Chem. 287, 24671-24689 (2012).
- Bevington, P. R., Robinson, D. K. Data reduction and error analysis for the physical sciences. 336, McGraw-Hill. New York. (1969).
- Schuck, P., Radu, C. G., Ward, E. S. Sedimentation equilibrium analysis of recombinant mouse FcRn with murine IgG1. Molecular Immunology. 36, 1117-1125 (1999).
- Gan, S. W., Vararattanavech, A., Nordin, N., Eshaghi, S., Torres, J. A cost-effective method for simultaneous homo-oligomeric size determination and monodispersity conditions for membrane proteins. Anal. Biochem. 416, 100-106 (2011).
- Montserret, R. NMR structure and ion channel activity of the p7 protein from hepatitis C virus). J. Biol. Chem. 285, 31446-31461 (2010).
- Stouffer, A. L., DeGrado, W. F., Lear, J. D. Analytical Ultracentrifugation Studies of the Influenza M2 Homotetramerization Equilibrium in Detergent Solutions. Progr Colloid Polym Sci. 131, 108-115 (2006).
- Sorkin, A., von Zastrow, M. Signal transduction and endocytosis: Close encounters of many kinds. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 600-614 (2002).
- Gan, S. W., Ng, L., Lin, X., Gong, X., Torres, J. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain. Protein science : a publication of the Protein Society. 17, 813-820 (2008).
