Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Een vis van borstvoeding Laboratory Bioassay de Antipredatory activiteit van secundaire metabolieten te beoordelen vanuit de weefsels van mariene organismen

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Dit bioassay maakt gebruik van een model roofvissen aan de aanwezigheid van het voeden-afschrikmiddel metabolieten van organische extracten van de weefsels van mariene organismen in de natuurlijke concentraties met behulp van een qua voedingswaarde vergelijkbaar voedsel matrix beoordelen.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chemische ecologie ontwikkeld door de samenwerking van chemici en ecologen. Terwijl de subdiscipline van terrestrische chemische ecologie is al enige tijd, dat van mariene chemische ecologie is slechts een paar decennia oud, maar heeft belangrijke inzichten opgeleverd in de evolutionaire ecologie en de gemeenschap structuur van mariene organismen 1-8. Te profiteren van de opkomende technologieën van duiken en NMR-spectroscopie, organisch chemici snel geleid tot een groot aantal publicaties beschrijven roman metabolieten van bentische ongewervelde zeedieren en algen in de jaren 1970 en 1980 9. Aannemende dat secundaire metabolieten bepaald doel, veel van deze publicaties toegeschreven ecologisch belangrijke eigenschappen om nieuwe verbindingen zonder empirisch bewijs moet dienen. Rond dezelfde tijd werden ecologen ook te profiteren van de komst van het duiken en het beschrijven van de uitkeringen en abundanties van bodemdieren en planten eerder weer bekendben relatief ineffectief bemonsteringsmethoden zoals baggeren. De aanname van deze onderzoekers was dat alles sessiele en zacht lichaam chemisch moet worden verdedigd om het verbruik door roofdieren 10 te vermijden. In een poging om de empirie te introduceren aan wat anders beschrijvende werk aan soorten op, sommige ecologen begon extrapoleren chemische afweer van toxiciteit assays 11. De meeste toxiciteit testen betrokken de blootstelling van hele vis of andere organismen op waterige suspensies van ruwe organische extracten van ongewervelde weefsels, met daaropvolgend de bepaling van het drooggewicht concentraties van extracten die verantwoordelijk zijn voor het doden van de helft van de test organismen. Echter, toxiciteitstests niet emuleren de wijze waarop potentiële roofdieren waarnemen prooien onder natuurlijke omstandigheden en latere studies hebben geen relatie tussen toxiciteit en smakelijkheid 12-13 gevonden. Het is verrassend dat publicaties in prestigieuze tijdschriften gebruikte technieken die weinig of geen ecological relevantie 14-15 en dat deze studies worden nog steeds veel geciteerd vandaag. Het is zelfs nog alarmerender om op te merken dat de studies op basis van gegevens over de toxiciteit blijven 16-18 worden gepubliceerd. De biologische analysemethode hierin beschreven werd ontwikkeld in de late jaren 1980 tot een ecologisch relevante benadering voor mariene chemische ecologen verstrekken aan antipredatory chemische afweer te beoordelen. De methode vereist een model roofdier om een ​​ruwe organische extract uit het doelorganisme proeven op een natuurlijke concentratie in een qua voedingswaarde vergelijkbaar voedsel matrix, het verstrekken van smakelijkheid gegevens die meer ecologisch zinvolle dan toxiciteitsgegevens.

De algemene benadering van de beoordeling van de antipredatory activiteit van de weefsels van mariene organismen omvat vier belangrijke criteria: (1) een passende generalist roofdier moet worden gebruikt voor het voederen assays, (2) organische metabolieten van alle polariteiten moet uitputtend worden gewonnen uit het weefsel van de doelorganisme, (3) de metabolieten moet be gemengd in een voedingsoogpunt geschikte experimentele eten op dezelfde volumetrische concentratie in het organisme waaruit ze werden geëxtraheerd, en (4) het experimenteel ontwerp en statistische benadering moet zorgen voor een betekenisvolle uitdrukking relatieve distastefulness geven.

De hieronder beschreven procedure is speciaal ontworpen om antipredatory chemische afweer in Caribisch ongewervelde zeedieren te beoordelen. We maken gebruik van de bluehead lipvis, Thalassoma bifasciatum, als model roofvissen, omdat deze soort komt veel voor op Caribische koraalriffen en staat bekend om een breed assortiment van benthische ongewervelden 19 proeven. Weefsel van het doelorganisme wordt eerst geëxtraheerd, vervolgens met een mengsel van voedsel, en uiteindelijk aangeboden aan groepen T. bifasciatum om te zien of ze verwerpen de-extract behandelde voedingsmiddelen. Assay gegevens met behulp van deze methode hebben belangrijke inzichten opgeleverd in het defensief chemie van mariene organismen 12,20-21, life geschiedenis trade-offs 22-24, en de gemeenschap ecologie 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OPMERKING: Stap 3 van dit protocol gaat gewervelde dier onderwerpen. De procedure is zo ontworpen dat de dieren krijgen de meest humane behandeling mogelijk en is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van North Carolina Wilmington goedgekeurd.

1) Tissue Extraction

  1. Gebruik weefsel dat is in zijn natuurlijke staat van hydratatie en niet geperst, uitgedroogde of overdreven nat als dit de volumetrische concentratie van secundaire metabolieten zal veranderen. Snijden of hakken weefsel stukken of plakken die in een 50 ml centrifugebuis kan worden gestoken. Opmerking: Vers weefsel kan in bepaalde gevallen, maar het is vaak beter te snijden of hakken bevroren weefsel, dat niet onderworpen is aan knijpen bij het snijden.
  2. Voeg stukken weefsel 30 ml van een 1: 1 mengsel van dichloormethaan (DCM) en methanol (MeOH) in een gegradueerde centrifugebuis tot een eindvolume van 40 ml wordt bereikt. Zorg ervoor dat u alle stappen van de overdracht van de uit te voerenoplosmiddel in een zuurkast met voldoende ventilatie.
  3. Sluit het buisje en keer het meerdere keren, vervolgens herhaaldelijk schudden tijdens een 4 uur extractie periode. Opmerking: Tijdens deze periode, water combineert met de MeOH en de daaruit voortvloeiende MeOH: water fase scheidt van de DCM-fase. Het weefsel wordt afwisselend blootgesteld aan DCM en MeOH: water als een emulsie als de buizen worden geschud.
  4. Breng de DCM extract een rondbodemkolf en verdamper drooggedampt in een roterende verdamper met lage temperatuur (<40 ° C). Met minimale oplosmiddel Breng het gedroogde extract met een 20 ml scintillatieflesje. Breng de flacon met een roterende verdamper adapter weer verdamper drooggedampt in een roterende verdamper met lage temperatuur (<40 ° C).
    Opmerking: De volgende stap vereist het gebruik van een zelfgemaakte compressie instrument dat kan worden samengesteld door schroeven de volgende opeenvolgend op het einde van een draadstang: (1) moer (2) ring, en (3) eikelnoot. De wasmachine moet ofwel worden geperforeerd ofzo is aangebracht dat het minder dan de inwendige diameter van een 50 ml centrifugebuis.
  5. Terugkerend naar de afgestudeerde centrifugebuis dat weefsel en de MeOH bevat: water extract, knijp de winning medium uit het weefsel door middel van compressie. Breng het MeOH: water extract dezelfde rondbodemkolf en opslaan gekoeld (<10 ° C).
  6. Voeg MeOH aan het getrapt centrifugebuis tot de nu gedroogde weefsel ondergedompeld voor een tweede extractie van 2 tot 6 uur duur, breng de nieuwe MeOH onttrekken aan de gekoelde rondbodemkolf bevattende MeOH: water extract. Als er enige bezorgdheid dat het weefsel niet volledig is uitgepakt, herhaal dan de 2 tot 6 uur MeOH extractie.
  7. Droog het MeOH op een roterende verdamper met lage temperatuur (<40 ° C). Breng de resterende waterige extract uit de rondbodemkolf de scintillatieflesje met de gedroogde polaire extract, met een minimaal volume MeOH om de rondbodemkolf te spoelen.
  8. Evaporate het waterige eluaat met lage temperatuur (<40 ° C) op een vacuümconcentrator. De scintillatieflesje bevat nu de totale droge ruwe organische extract van 10 ml van het weefsel. Evacueren het hoofd ruimte van de flacon met N2 gas om oxidatie te voorkomen, sluit strak, en op te slaan ingevroren (-20 ° C).

2) Voorbereiding van het Voedsel

  1. Bereid gevriesdroogde inktvis mantel poeder.
    Opmerking: Squid mantel een bron van voeding die vergelijkbaar is met die van andere benthische ongewervelden, en worden gebruikt als een ingrediënt in de substappen van 2,2.
    1. Ontdooi bevroren ringen van inktvis mantel in warm gedeïoniseerd (DI) water, dan pureer ze in een high-speed blender.
    2. Giet een dun laagje gepureerde inktvis mantel op een ondiepe bakplaat en bevriezen (-20 ° C), dan breekt de plaat bevroren pijlinktvis puree in kleine stukjes worden gevriesdroogd.
    3. Lyofiliseren de bevroren pijlinktvis mantel puree na de operationele procedures van de frEEZE-droger.
    4. Verpulveren de gevriesdroogde stukjes inktvis mantel puree in een high-speed blender tot een poeder.
    5. In een zuurkast, giet het in poedervorm inktvis mantel in een roterende bloem zeef en zeef om grote brokken van het weefsel te scheiden van het fijne poeder.
    6. Breng de fijne poedervorm inktvis mantel aan een afsluitbare container. Evacueren de container kopruimte met N2 gas om oxidatie tegen te gaan en ingevroren (-20 ° C).
  2. Bereiden het eten mengsel.
    Opmerking: wanneer meerdere opeenvolgende assays, is het praktisch bereiden ~ 100 ml voedsel mengsel, maar dit recept kan worden geschaald naar kleinere volumes indien nodig.
    1. Combineer een mengsel van 3 g alginezuur en 5 g gevriesdroogde inktvis mantel poeder met 100 ml DI water in een bekerglas van 150 ml. Roer krachtig met een microspatula enkele minuten totdat het poeder volledig gehydrateerd en het mengsel homogeen is.
      Opmerking: Indien gewenst, kleurstof kan worden toegevoegd op deze step: het is gemakkelijker om kleurstof toevoegen voedselmengsel die zowel behandelde als controlemengsels genereert (maskeren van de natuurlijke pigment van het extract in het extract behandelde mengsel) dan proberen om de kleur van het extract behandelde mengsel passen door het toevoegen kleurstof met de controle mengsel. Een groen of bruin kleurstof is vaak wenselijk om eventuele pigmenten maskeren in het ruwe extract.
    2. Laad precies 10 ml van voedsel mengsel in een afgestudeerd spuit. Zorg ervoor dat de opname van luchtbellen tijdens dit proces te voorkomen.
    3. Verwijder de 20 ml scintillatieflesje met droge ruwe organische extract uit de vriezer. Voeg een druppel of twee van MeOH, roer er dan het extract tot een homogeen mengsel met een microspatula.
    4. Verwijder de geplaatste 10 ml spuit van voedsel matrix in de 20 ml scintillatieflesje en roer met een microspatula de-extract behandelde voedsel mengsel te homogeniseren.
      Opmerking: Het kan helpen om de spuit in kleinere stappen (dat wil zeggen uit te werpen, uit te werpen 2 ml en homogeniseren, dan r.EPEAT totdat alle 10 ml zijn gehomogeniseerd).
  3. Bereid de test pellets.
    1. Laad een zeer klein volume van het extract mengsel (~ 1 ml) in een spuit, en dompel de spuit in een oplossing van 0,25 M CaCl2. Verwijder de inhoud van de injectiespuit een lange spaghetti-achtige streng vormen.
    2. Na een paar minuten, verwijder de verharde streng, hak het in 4 mm lang pellets op een glazen snijplank met een scheermesje, spoel dan in zeewater.
    3. Herhaal de stappen 2.3.1 en 2.3.2, zonder inbegrip van tissue-extract om de controle pellets te maken. Zorg ervoor dat u controle pellets te behandelen met een gelijkwaardige hoeveelheid oplosmiddel (zie toevoeging van MeOH om behandelde mengsel in stap 2.2.3) om te controleren voor oplosmiddeladditievormen. Als een negatieve controle wordt gewenst te bevestigen dat assay vis kunnen worden afgeschrikt voeden, voeg denatoniumbenzoaat bij een concentratie van 2 mg ml-1 tot het raw food mengsel 27.

3) SmakelijkheidBioassays

  1. Voeren voeden assays met wild gevangen geel-fase bluehead lipvis, Thalassoma bifasciatum, gehouden in groepen van drie in ondoorzichtige eenzijdige compartimenten van het laboratorium aquaria.
  2. Leveren voedsel pellets uit een beker van zeewater met behulp van een glazen pipet met een rubberen bol. Opmerking: Het kan een paar dagen duren om vis te trainen om voedsel te krijgen op deze manier. Een conditioning stimulus (bijvoorbeeld een paar tikken van de pipet op het aquarium glas) dat de levering van voedsel voorafgaat kan nuttig zijn om de vis te trainen om de toevoeging van voedsel pellets verwachten.
  3. Scoren pellets. Beschouw een pellet aanvaard indien gemakkelijk verteerd door de vis. Beschouw een pellet verworpen als niet na minimaal drie pogingen van één of meer vissen te nemen in hun mondholte gegeten of als de pellet wordt benaderd en genegeerd na zo'n poging.
  4. Scoren monsters. Opmerking: De testprocedure wordt afgebeeld als een stroomdiagram in figuur 1 Groepen vis die willen eten.controle pellets bij elke stap in het protocol worden verder buiten beschouwing gelaten. Er zijn twee mogelijke uitkomsten van een enkele run van de test: het monster wordt ofwel geaccepteerd of afgewezen.
    1. Beginnen met een controle pellet te bevestigen dat de groep vissen is coöperatief. Bieden een behandelde pellet. Als de vis te aanvaarden de behandelde pellet, de score van de steekproef als geaccepteerd. Als de vissen verwerpen de behandelde pellet, bieden een volgende controle pellet om te bepalen of de vissen voeren, hebben opgehouden. Als de vissen accepteren de daaropvolgende controle pellet, de score van de steekproef als verworpen.
  5. Replicatie. Herhaal de test procedure met tien onafhankelijke groepen van vis voor elk uittreksel.

4) Het evalueren van Betekenis

  1. Evalueer de significantie van verschillen in het controle versus behandelde korrels met een aangepaste versie van Fisher's exact test 26. Wijzigen van de test, zodat de marginale totalen voor controle en behandeld pellets zijn vast, Ze te behandelen zowel als steekproeven. Opmerking: Dit geeft p = 0,057 bij 7 pellets worden gegeten; vandaar, wordt elke extract beschouwd afschrikmiddel als 6 of minder pellets worden gegeten, en smakelijk als 7 of meer pellets worden gegeten.
  2. Het vergelijken van de relatieve smakelijkheid tussen groepen extracten berekenen gemiddelde aantal pellets gegeten binnen elke groep. Houd de drempel om 6 pellets dus een groep van repliceren extracten worden beschouwd als afschrikmiddel, als het gemiddelde aantal pellets gegeten + standaardfout (SE) ≤6. Opmerking: In de representatieve resultaten, de groepsopdracht is species, dus repliceren uittreksels komen uit verschillende individuen en de relatieve smakelijkheid kan worden vergeleken tussen de soorten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier rapporteren we de resultaten van de bioassay zes soorten van gemeenschappelijk Caribbean sponsen (figuur 2). Deze gegevens werden in eerste instantie gepubliceerd in 1995 door Pawlik et al. 12 en tonen de kracht van deze benadering van verschillen in chemische verdediging strategieën tussen co-voorkomende taxa overzien. De resultaten werden gerapporteerd als een gemiddeld aantal van voedsel pellets gegeten + standaardfout (SE) voor elke soort. Bijna geen pellets werden gegeten in testen met ruwe organische extracten uit Agelas clathrodes, Amphimedon compressa en Aplysina cauliformis. Daarentegen werden pellets gemaakt met fragmenten uit Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa en Mycale laevis gemakkelijk verteerd in de test 12. Minder dan zes pellets werden gegeten de eerste drie species, zodat ze significant afschrikkend beschouwd. In tegenstelling, de tweede drie soorten waren niet significant verschillend van de controles, en warenbeschouwd verteerbaar.

Figuur 1
Figuur 1:. Schema van de testprocedure in alle stadia, de afwijzing van een controle pellet geeft aan dat deze set van test vissen zijn onwillige of verzadigd en kan niet verder worden gebruikt. Het protocol begint met het aanbieden van elke set van vis een controle pellet gevolgd door een behandelde pellet. Vervolgens wordt, indien de behandelde pellet wordt aanvaard het monster gescoord als geaccepteerd. Als de behandelde pellet wordt afgewezen, maar de daaropvolgende controle pellet wordt aanvaard, wordt het monster gescoord als verworpen.

Figuur 2
Figuur 2: Consumptie door Thalassoma bifasciatum van voedsel pellets (gemiddelde + SE) bevattende ruwe organische extracten van sponzen op natuurlijke concentraties, voor het eerst gemeld in 1995 door Pawlik 12 Fish geconsumeerd 10 control pellets in alle gevallen. Na elke soortnaam, wordt het aantal identieke monsters gespecificeerd (elk repliceren van de afzonderlijke extractie van een geografisch onderscheiden steekproef van spons weefsel). Voor assay werden extracten beschouwd afschrikkende als het aantal korrels opgegeten kleiner dan of gelijk aan 6 was (p = 0,057, bewerkt Fisher's exact test), zoals aangegeven door de stippellijn op de grafiek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De hier beschreven procedure voorziet in een relatief eenvoudige, ecologisch relevante laboratorium protocol voor de beoordeling van antipredatory chemische afweer in mariene organismen. Hier bespreken we de belangrijkste criteria die worden voldaan door deze set van methoden:

(1) Passende roofdier. Deze voeden test maakt het bluehead lipvis, Thalassoma bifasciatum, een van de meest voorkomende vissen op de koraalriffen in het hele Caribische gebied. De bluehead is een generalist carnivoor bekend om een breed assortiment van benthische ongewervelden 19 proeven. Generalistische predatoren zijn de beste keuze voor deze eerste testen omdat de meerderheid van roofvissen op riffen zijn generalisten, en het zou worden verwacht dat antipredatory verdedigingen in grote lijnen zou worden gericht tegen hen, in tegenstelling tot gespecialiseerde roofdieren die mechanismen kunnen zijn geëvolueerd om de verdediging te omzeilen. Laboratorium onderzoeken van chemische afweer gebruik van een enkele potentiële predator zijn vantien gevolgd door meer tijdrovende en ingewikkelde veldexperimenten die afhankelijk zijn van de reacties van een volledige aanvulling van potentiële roofdieren onder veldomstandigheden 28-33.

(2) Extractie procedure. De eerste weefsel-extractiestap, die gebruik maakt van een oplosmiddel mengsel van gelijke delen dichloormethaan (DCM) en methanol (MeOH), snel doordringt weefsel oplossende membranen en dehydrateren celmateriaal. Het weefsel wordt ontwaterd na deze stap, zodat de volgende stappen extract resterende metabolieten van alle polariteiten in MeOH. Het herhalen van de winning in MeOH totdat het weefsel volledig is uitgepakt een uitputtende extractie procedure vormt. Kleine variaties op dit onttrekkingsschema aanvaardbaar, zoals substitutie van een extractie oplosmiddel voor een andere van dezelfde polariteit, maar weefselextractie kunnen onvolledig zijn als een ongeschikte oplosmiddel gebruikt. Mogelijke valkuilen van oneigenlijk weefselextractie procedures worden in detail besproken elders <sup> 8.

(3) Bereiding van experimenteel voedsel. De kunstmatige voedingsmatrix moet het weefsel van het doelorganisme zowel de voedingskwaliteit en concentratie van secundaire metabolieten simuleren. Het is waarschijnlijk dat dezelfde sensorische processen die roofdieren gebruiken feeding afschrikkende metabolieten verwerpen ook betrokken zijn bij de perceptie van de voedingswaarde van levensmiddelen. Voedingsmiddelen met een lage voedingswaarde kan bij veel lagere niveaus van chemische verdediging worden afgewezen, en omgekeerd, kunnen secundaire metabolieten enige afschrikmiddel tegen hoger-dan-natuurlijke concentraties zijn als deze metabolieten worden gepresenteerd in een kunstmatig voedsel dat is voedzamer dan het weefsel van waaruit werd verkregen. Poeder, gevriesdroogd inktvis mantel een nutritioneel nuttig alternatief omdat het gemakkelijk beschikbaar, gemakkelijk te meten, en voedingskenmerken reeds werden vastgelegd 34.

De tweede overweging bij de voorbereiding van de experimenteel voedsel betreft de bepaling van de concentratie van het extract, dat moet worden gedaan op basis van volume, niet massa. Roofdieren eten natte weefsel, en de weefsels van mariene organismen variëren sterk in het watergehalte. Vanuit het perspectief van een roofdier, zou een beet van een kwal of zeeanemoon aanzienlijk meer water per eenheid droge massa bevatten dan dezelfde sized beet van een inktvis of zeeslak. Voor sterk gehydrateerde weefsels zou de concentratie van metaboliet per eenheid drooggewicht veel hoger dan per volume eenheid, maar volume (beten) is de maatregel die ecologisch relevant. Bovendien kunnen weefsels van mariene organismen hebben verschillende dichtheden vanwege minerale skelet elementen. Bepaling van de metaboliet concentratie volume lost beide problemen en is de meest relevante maat vanuit het standpunt van het verbruik van weefsel door een potentiële predator. Dit onderwerp, met voorbeelden uit de literatuur, wordt een toelichting gegeven 8.

.. content "> (4) Experimenteel ontwerp en statistische benadering Passende experimenteel ontwerp en statistische analyses van gegevens zijn net zo belangrijk voor gedragsverandering assays als voor elk ander wetenschappelijk onderzoek die inhoudt dat het bepalen van de significantie van verschillen in de experimentele uitkomsten De hier beschreven analyse is simpel: verschillen worden bepaald met een gewijzigde contingency tafel. De methode vereist dat alle controle voedseldienstenaanbod worden geconsumeerd, omdat de onderzoeker niet zou worden met behulp van experimentele roofdieren die niet voeden werden op controle voedingsmiddelen 8. Hoewel het gebruik van Fisher's exact test is gewijzigd ten opzichte van de initiële Gebruik door Pawlik et al. 12, de drempelwaarde van 6 behandeld pellets gegeten blijft ongewijzigd. In de loop der jaren hebben andere statistische tests gesuggereerd als substituten, maar na overleg met de medewerker James E. Blum (UNCW Dept. Wiskunde en Statistiek weggegooid ). Bijvoorbeeld McNemar's test is voorgesteld,maar is ongepast, zowel omdat het ontbreekt aan een aangepaste reeks van gegevens, en omdat een rij van de kruistabel wordt vastgesteld op 10 controle pellets gegeten.

Ondanks onze ervaring dat deze test methode biedt opvallend duidelijke resultaten, toch berust op een gedragsmatige respons. Als vissen uitgehongerd gedurende een tijdsperiode vóór de test, kunnen zij meer behandelde korrels dan ze zou doen als vissen werden goed gevoed, vooral als een defensieve metaboliet aanwezig in het behandelde voedsel pellets op een bijna drempelconcentratie activiteit eten. Daarom moeten resultaten voederen assays niet genoeg worden geïnterpreteerd. Bijvoorbeeld, een verschil tussen twee weefselmonsters van 1/10 versus 9/10 pellets gegeten geeft het eerste monster afschrikmiddel en de tweede niet, maar een verschil van 3/10 versus 5/10 pellets gegeten kan het gevolg gedragsvariatie tussen assays, en het eerste monster is niet per se meer afschrikwekkende dan de tweede.

Een belangrijke Application van deze bioassay is het gebruik ervan in biologisch gestuurde fractionering, waarbij opeenvolgende verdelingen van de ruwe extract worden getest op vis aan de chemische verbindingen die verantwoordelijk is voor het voederen-afschrikmiddel activiteit 29,32-33,35-38 isoleren. Zodra de aanwezigheid van een chemische verdediging is vastgesteld, wordt de ruwe organische extract chromatografisch gefractioneerd in kleinere subgroepen van verbindingen die deel uitmaken van het mengsel, en deze subgroepen worden gevoed om te vissen in dezelfde voeding test. Nogmaals, moet dit worden gedaan op een volumetrische basis, met behulp van "ml equivalenten" van weefsel extract in plaats van massa-equivalenten. Aangezien de scheiding opbrengst, delen het best onderzocht zoals een seriële verdunning opzichte van de natuurlijke volumetrische concentratie: 4 x, 2 x en 1 x. Deze overspanning concentraties houdt rekening met de waarschijnlijke afname van afschrikkende activiteit die afkomstig is van het splitsen van de actieve metabolieten over twee of meer chromatografische fracties of verlies van actieve metabolieten through ontleding, reactie, of gehechtheid aan de media chromatografische. Nadat de actieve metabolieten zijn geïsoleerd door biologisch gestuurde fractionering, kan de onderzoeker te identificeren met behulp van standaard spectroscopische technieken en ook hetzelfde voor inactieve fracties die secundaire metabolieten kunnen laten doen. Het is even belangrijk om te weten welke secundaire metabolieten in ecologisch relevante experimenten actief zijn als om te weten welke metabolieten niet zijn 8.

Elementen van deze procedure kan ook worden gebruikt om nieuwe experimentele technieken ontwerpen. Zo werd deze bioassay aangepast voor ongewervelde predatoren (bv krabben 39 en zeesterren 40), voor andere geografische regio's 41, en ​​zelfs naar andere onderzoeksvragen te pakken (bijvoorbeeld structurele verdedigingen 31,34,42 en Aposematische kleuring 27). De vier criteria moeten dienen als leidraad voor toekomstige aanpassingen van deze methode. Samengevat, deze bioassay procedure provides een meer ecologisch relevante methode voor de beoordeling van de antipredatory chemische afweer uit weefsels van mariene organismen. Studies met behulp van deze procedure hebben geavanceerde ons begrip van de factoren die de verspreiding en de grootte van ongewervelde zeedieren op Caribische koraalriffen (bijv meest recent, Loh en Pawlik 26) en kunnen informeren over de onderzoeken in diverse gebieden van onderzoek, met inbegrip van farmacologie, biotechnologie, en controle evolutionaire ecologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
Een vis van borstvoeding Laboratory Bioassay de Antipredatory activiteit van secundaire metabolieten te beoordelen vanuit de weefsels van mariene organismen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter