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Environment

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Dieser Bioassay verwendet ein Modell Raubfische, die Anwesenheit von Futter Abschreckung Metaboliten aus organischen Extrakte der Gewebe von Meeresorganismen auf natürlichen Konzentrationen mit einem ernährungsphysiologisch vergleichbaren Lebensmittelmatrix zu bewerten.

Introduction

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Chemische Ökologie durch die Zusammenarbeit von Chemikern und Ökologen entwickelt. Während der Teildisziplin der terrestrischen chemischen Ökologie gibt es schon seit einiger Zeit, dass der Meeres chemische Ökologie ist nur ein paar Jahrzehnte alt, hat aber wichtige Einblicke in die Evolutionsökologie und Gemeinschaftsstruktur von Meeresorganismen 8.1 zur Verfügung gestellt. Sie profitieren von den neuen Technologien von Tauchen und NMR-Spektroskopie, Organiker schnell erzeugt eine große Anzahl von Veröffentlichungen, die neuartige Stoffwechselprodukte von benthischen wirbellosen Meerestieren und Algen in den 1970er und 1980er Jahren 9. Unter der Annahme, dass sekundäre Pflanzenstoffe muss einen Zweck haben viele dieser Publikationen ist ohne empirische Beweise zugeschrieben ökologisch wichtigen Eigenschaften, neue Verbindungen zu dienen. Etwa zur gleichen Zeit wurden Ökologen auch die Vorteile der Einführung von Tauchen und Beschreibung der Verteilungen und Häufigkeiten von Bodentieren und Pflanzen früher her bekanntbin relativ unwirksam Probenahmeverfahren wie Baggerarbeiten. Die Annahme dieser Forscher war, dass nichts festsitzenden und weichen Körper muss chemisch verteidigt werden Verbrauch von Raubtieren 10 zu vermeiden. In dem Bemühen, den Empirismus zu dem, was sonst beschreibende Arbeiten an Arten Häufigkeiten einzuführen, begannen einige Ökologen Extrapolation chemische Abwehr von Toxizitätstests 11. Die meisten Toxizitätstests ging es um die Exposition der ganze Fische oder andere Organismen, um wässrige Suspensionen von rohen organischen Extrakte der wirbellosen Gewebe, mit anschließender Bestimmung der Trockenmasse Konzentrationen von Extrakten für die Tötung der Hälfte der Testorganismen verantwortlich. Allerdings sind Toxizitätstests nicht emulieren die Art, in der potenzielle Räuber wahr Beute unter natürlichen Bedingungen, und nachfolgende Studien haben keinen Zusammenhang zwischen Toxizität und Schmackhaftigkeit 12-13 gefunden. Es überrascht, dass Publikationen in renommierten Fachzeitschriften verwendet Techniken, die wenig oder gar keine ecological Relevanz 14-15 und dass diese Studien sind immer noch weit zitiert heute. Es ist noch alarmierender zu beachten, dass Studien, die auf Toxizitätsdaten weiterhin veröffentlicht 16-18 werden. Die hier beschriebene Bioassay-Methode wurde in den späten 1980er Jahren entwickelt, um eine ökologisch relevanten Ansatz für die Meeres chemischen Ökologen sorgen zu antipredatory chemische Abwehr zu bewerten. Das Verfahren erfordert ein Modell Raubtier, um eine rohe organische Extrakt aus den Zielorganismus zu einem natürlichen Konzentration in einer ernährungs vergleichbaren Lebensmittelmatrix probieren und bietet Schmackhaftigkeit Daten, die ökologisch sinnvoller als Toxizitätsdaten.

Der allgemeine Ansatz zur Bewertung der antipredatory Aktivität der Gewebe von Meeresorganismen enthält vier wichtige Kriterien: (1) eine angemessene Generalist Räuber müssen in Fütterungstests verwendet werden, (2) Bio-Stoffwechselprodukte aller Polaritäten müssen erschöpfend aus dem Gewebe der extrahiert werden Zielorganismus, (3) die Metaboliten muss be an der gleichen Volumenkonzentration in einer ernährungs geeigneten experimentellen Nahrung vermischt als in dem Organismus, aus dem sie entnommen wurden, und (4) das experimentelle Design und statistische Ansatz müssen einen sinn Metrik relativ distastefulness hindeuten.

Die unten aufgeführten Verfahren ist speziell auf antipredatory chemische Abwehr in der Karibik wirbellose Meerestiere zu bewerten. Wir beschäftigen die bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, als Modell Raubfische, weil diese Art häufig auf karibischen Korallenriffe und ist dafür bekannt, ein breites Sortiment von Makrozoobenthos 19 kosten. Gewebe aus dem Zielorganismus wird zuerst extrahiert, dann kombiniert mit einer Futtermischung, und schließlich, um Gruppen von T. angeboten bifasciatum zu beobachten, ob sie den Extrakt behandelten Lebensmitteln abzulehnen. Assay-Daten mit dieser Methode haben wichtige Einblicke in die Defensive Chemie mariner Organismen 12,20-21, l bereitgestelltife Geschichte Kompromisse 22-24 und Gemeinschaftsökologie 25-26.

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Protocol

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HINWEIS: Schritt 3 dieses Protokolls betrifft Wirbeltier Themen. Das Verfahren ist so konzipiert, dass die Tiere erhalten die humane Behandlung möglich und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) an der University of North Carolina Wilmington zugelassen.

1) Gewebeentnahme

  1. Verwenden Gewebe, das in seinem natürlichen Zustand der Flüssigkeitszufuhr und nicht gequetscht, ausgetrocknete oder übermäßig nass ist, da dies die Volumenkonzentration von Sekundärmetaboliten zu ändern. Geschnitten oder hacken Gewebe in Stücke oder Scheiben, die in ein 50 ml Zentrifugenrohr eingeschoben werden kann. Hinweis: Frisches Gewebe kann in einigen Fällen verwendet werden, aber es ist oft besser, schneiden oder hacken gefrorenem Gewebe, das nicht Gegenstand zu quetschen, wenn sie geschnitten.
  2. Hinzufügen Gewebestücke zu 30 ml einer 1: 1 Mischung von Dichlormethan (DCM) und Methanol (MeOH) in einem graduierten Zentrifugenröhrchen bis zu einem Endvolumen von 40 ml erreicht wird. Achten Sie darauf, alle Schritte, die die Übertragung von durchführenLösungsmittel in einem Abzug bei ausreichender Belüftung verwenden.
  3. Das Röhrchen verschließen und schwenken es mehrmals, dann während einer 4 Stunden Extraktionsdauer mehrmals schütteln. Hinweis: In dieser Zeit verbindet Wasser mit MeOH und der resultierende MeOH: Wasserphase trennt sich von der DCM-Phase. Das Gewebe wird wechselweise mit DCM und MeOH: Wasser als Emulsion wie die Röhren geschüttelt.
  4. Übertragen der DCM-Extrakt in einen Rundkolben überführt und verdampft zur Trockne auf einem Rotationsverdampfer unter Verwendung niedriger Wärme (<40 ° C). Mit minimalen Lösungsmittel, überweisen Sie den Trockenextrakt auf eine 20 ml Szintillationsfläschchen. Setzen Sie die Flasche mit einem Rotationsverdampfer Adapter und erneut zur Trockene verdampft auf einem Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (<40 ° C).
    Hinweis: Der nächste Schritt ist die Verwendung eines selbst gemachten Druckinstrument, das durch Einschrauben die folgenden Punkte der Reihe nach auf das Ende einer Gewindestange montiert werden können: (1) Mutter (2) Waschmaschine, und (3) Hutmutter. Die Scheibe muss entweder perforiert oderversehen, so dass er kleiner als der Innendurchmesser eines 50 ml Zentrifugenröhrchens ist.
  5. Zurückkehrend zu dem graduierten Zentrifugenröhrchen, das Gewebe und das MeOH enthält: Wasserextrakt, quetschen das Extraktionsmittel aus dem Gewebe durch Kompression. Übertragen Sie die MeOH: Wasser-Extrakt auf den gleichen Rundkolben und speichern gekühlt (<10 ° C).
  6. In MeOH in den Messzentrifugenröhrchen, bis die nun entwässert Gewebe wird für eine zweite Extraktion von 2 bis 6 Stunden Dauer untergetaucht, dann übertragen die neue MeOH zu extrahieren, um den gekühlten Rundkolben mit dem MeOH: Wasser-Extrakt. Wenn es irgendeine Besorgnis, dass das Gewebe nicht vollständig entnommen worden ist, wiederholen die 2 bis 6 h MeOH Extraktion.
  7. Trocknen Sie den MeOH am Rotationsverdampfer mit geringer Hitze (<40 ° C). Die restliche wässrige Extrakt aus dem Rundkolben zur Szintillationsfläschchen, das das getrocknete unpolaren Extrakt, mit einem minimalen Volumen MeOH, den Rundbodenkolben zu spülen.
  8. Evaporate des wässrigen Extrakts zur Trockne unter Verwendung niedriger Wärme (<40 ° C) auf einem Vakuum-Konzentrator. Die Szintillationsfläschchen enthält nun die Gesamttrocken rohe organische Extrakt aus 10 ml Gewebe. Evakuieren Sie den Kopfraum der Flasche mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern, dicht schließen und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C).

2) Nahrungszubereitung

  1. Bereiten gefriergetrockneten Tintenfisch Mantel-Pulver.
    Hinweis: Squid Mantel stellt eine Nahrungsquelle, die vergleichbar mit der von anderen Makrozoobenthos ist und wird als Bestandteil in den Teilschritten von 2,2 verwendet werden.
    1. Gefrorene Tintenfischringe Mantel in warmem deionisiertem (DI) Wasser, dann pürieren in einem High-Speed-Mixer.
    2. Gießen Sie eine dünne Schicht aus pürierten Tintenfisch Mantel auf ein flaches Backblech und Einfrieren (-20 ° C), dann bricht das Blatt von gefrorenen Kalmaren Püree in kleine Stücke zu gefriergetrocknet werden.
    3. Lyophilisieren die gefrorene Kalmare Mantel Püree im Anschluss an die Betriebsabläufe des freeze Trockner.
    4. Pulverisierten das lyophilisierte Stücke squid Mantel Püree in einem Hochgeschwindigkeitsmischer, um ein Pulver zu bilden.
    5. In einer Abzugshaube, gießen Sie das pulverisierte Tintenfisch Mantel in eine Dreh Mehlsieb und zu sichten, um große Teile des Gewebes aus dem feinen Pulver zu trennen.
    6. Übertragen Sie die fein pulverisierte Tintenfisch Mantel an einen verschließbaren Behälter. Evakuieren Sie den Behälterkopfraum mit N2-Gas, um Oxidation zu verhindern und Lagerung tiefgefroren (-20 ° C).
  2. Bereiten Sie die Futtermischung.
    Hinweis: Bei der Ausführung von mehreren aufeinander folgenden Assays praktisch ~ vorbereiten 100 ml Futtermischung ist es jedoch dieses Rezept kann auf kleinere Volumina skaliert werden, wenn nötig.
    1. Kombinieren einer Mischung von 3 g Alginsäure und 5 g gefriergetrocknete squid Mantel-Pulver mit 100 ml entionisiertem Wasser in einem 150 ml Becherglas. Rühre kräftig mit einem Mikrospatel für ein paar Minuten, bis das Pulver vollständig hydratisiert ist, und die Mischung homogen ist.
      Hinweis: Wenn gewünscht, Lebensmittelfarbe kann zu diesem st hinzugefügt werdenep: es ist einfacher, Farbstoff auf das Nahrungsmittelmischung, die sowohl behandelten und Kontrollmischungen erzeugen wird (Maskierung des natürlichen Pigments der Extrakt in dem Extrakt behandelten Mischung) hinzuzufügen, anstatt zu versuchen, die Farbe des Extraktes behandelten Mischung durch Zugabe überein Farbstoff auf das Kontrollgemisch. Eine grünliche oder bräunliche Lebensmittelfarbe ist oft wünschenswert, keine Pigmente im Rohextrakt zu maskieren.
    2. Laden genau 10 ml Futtermischung in einen graduierten Spritze. Achten Sie darauf, um den Einschluss von Luftblasen während dieses Prozesses zu vermeiden.
    3. Nehmen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit trockenen rohen organischen Extrakt aus der Tiefkühltruhe. Fügen Sie ein oder zwei Tropfen MeOH, dann rühren den Extrakt zu einer homogenen Mischung mit einem Mikrospatel.
    4. Entnehmen Sie die eingesetzte 10-ml-Spritze von Lebensmittelmatrix in die 20 ml Szintillationsfläschchen und rühren mit einem Mikrospatel, um den Extrakt behandelten Futtermischung zu homogenisieren.
      Hinweis: Es kann helfen, die Spritze in kleineren Schritten (dh auswerfen auswerfen 2 ml und homogenisieren, dann r.EPEAT, bis alle 10 ml wurden homogenisiert wurde).
  3. Bereiten Sie die Assay-Pellets.
    1. Lädt ein sehr kleines Volumen der Extraktmischung (~ 1 ml) in eine Spritze aufgezogen und tauchen die Spitze der Spritze in eine Lösung von 0,25 M CaCl 2. Werfen Sie den Inhalt der Spritze, um eine lange, spaghettiartigen Strang zu bilden.
    2. Nach ein paar Minuten wird der gehärtete Strang, hacken sie in 4 mm lange Pellets auf ein Glas Schneidebrett mit einer Rasierklinge, dann spülen Sie im Meerwasser.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1 und 2.3.2 ohne einschließlich Gewebeextrakt, die Kontrolle Pellets zu machen. Achten Sie darauf, die Kontrolle-Pellets mit einem äquivalenten Volumen des Lösungsmittels zu behandeln (siehe Zusatz von MeOH zu behandelnde Mischung in Schritt 2.2.3) bis zur Lösungsmittelzugabe steuern. Wenn eine negative Kontrolle gewünscht, um zu bestätigen, dass Test Fisch aus Fütterung abgeschreckt werden, fügen Denatoniumbenzoat in einer Konzentration von 2 mg ml -1 in die Rohkost Mischung 27.

3) Die SchmackhaftigkeitBioassays

  1. Führen Fütterungstests mit wild gefangenen Gelbphase bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, gehalten in Dreiergruppen in undurchsichtigen seitige Fächer von Labor Aquarien.
  2. Liefern Futterpellets aus einem Becherglas von Meerwasser mit einer Glaspipette mit einem Gummiball. Hinweis: Es kann ein paar Tage dauern, um Fische zu trainieren, um Essen auf diese Weise erhalten. Ein Anlage Stimulus (zB ein paar Hähne der Pipette auf die Aquarienscheibe), die die Lieferung von Lebensmitteln voran kann hilfreich sein, um die Fische zu trainieren, um die Zugabe von Futterpellets erwarten.
  3. Scoring-Pellets. Betrachten wir ein Pellet akzeptiert, wenn ohne weiteres durch den Fisch verzehrt. Betrachten wir ein Pellet verworfen wird, wenn nicht nach einer mindestens drei Versuchen durch ein oder mehrere Fische, um sie in ihrer Mundhöhle nehmen gegessen oder wenn das Pellet wird angefahren und nach einer solchen Versuch ignoriert.
  4. Scoring Proben. Hinweis: Das Testverfahren ist als Flußdiagramm in Figur 1 dargestellten Gruppen von Fischen, die Futteraufnahme verweigern.Steuer Pellets bei jedem Schritt im Protokoll werden nicht weiter berücksichtigt. Es gibt zwei mögliche Ergebnisse von einem einzigen Durchlauf des Tests: Die Probe wird entweder angenommen oder abgelehnt.
    1. Beginnen Sie mit einer Steuer Pellet, um zu bestätigen, dass die Gruppe der Fische ist kooperativ. Bieten Sie einen behandelten Pellets. Wenn die Fische nehmen die behandelten Pellets, punkten die Probe als angenommen. Wenn die Fische weisen die behandelten Pellets bieten eine anschließende Kontrolle Pellet zu bestimmen, ob die Fische Fütterung eingestellt. Wenn die Fische nehmen die anschließende Kontrolle Pellet, punkten die Probe als abgelehnt.
  5. Replication. Wiederholen Sie den Testverfahren mit zehn unabhängige Gruppen von Fisch für jeden Extrakt.

4) Bewertung der Bedeutung

  1. Bewerten Sie die Signifikanz der Unterschiede in den Konsum von Steuer vs behandelten Pellets mit einer modifizierten Version des Fisher-Test 26. Ändern Sie den Test, so dass die Randsummen für Kontroll- und behandelten Pellets Fest, Behandeln sie beide als Stichproben. Hinweis: Diese bietet p = 0,057 bei 7 Pellets gegessen; daher wird jeder Extrakt als Abschreckung, wenn 6 oder weniger Pellets werden gegessen und schmackhaft, wenn 7 oder mehr Pellets werden gegessen.
  2. Um die relative Schmackhaftigkeit zwischen Gruppen von Extrakten zu vergleichen sind die mittlere Anzahl von Pellets in jeder Gruppe gegessen. Halten Sie eine Schwelle von 6 Pellets so eine Gruppe von Wiederholungs Extrakte werden als abschreckend, wenn die mittlere Anzahl von Pellets gegessen + Standardfehler (SE) ≤6. Hinweis: In den repräsentativen Ergebnissen, ist die Gruppenzuordnung Arten, so replizieren Auszüge stammen aus verschiedenen Individuen und die relative Schmackhaftigkeit bei den einzelnen Spezies verglichen werden.

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Representative Results

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Hier berichten wir über Ergebnisse der biologischen Tests für sechs Arten von gemeinsamen karibischen Schwämmen (Abbildung 2). Diese Daten wurden ursprünglich im Jahr 1995 von Pawlik et al. 12 veröffentlicht und zeigen, die Macht dieser Ansatz für die Unterschiede in der chemischen Abwehrstrategien unter Co-auftretende Taxa Umfrage. Die Ergebnisse wurden als mittlere Anzahl von Futterpellets Standardfehler (SE) für die einzelnen Arten gegessen + wiesen. Fast keine Pellets wurden in Tests mit rohen organischen Extrakte aus Agelas clathrodes, Amphimedon compressa und Aplysina cauliformis gegessen. Im Gegensatz dazu wurden die Pellets mit Extrakten aus Callyspongia vaginalis Geodia gibberosa und Mycale laevis hergestellt leicht in dem Assay 12 verbraucht. Weniger als sechs Pellets wurden für die ersten drei Spezies verzehrt, so dass sie wesentlich betrachtet wurden Abschreckung. Im Gegensatz dazu waren die zweiten drei Arten, die nicht signifikant von den Kontrollen und warenals schmackhaft.

Figur 1
Abb. 1: Schematische Darstellung des Testverfahrens auf allen Stufen, die Ablehnung einer Kontrolle Pellet zeigt an, dass dieser Satz von Testfische sind unkooperativ oder gesättigt und kann nicht weiter verwendet werden. Das Protokoll beginnt, indem sie jeden Satz von Fisch ein Steuer Pellets, gefolgt von einer behandelten Pellets. Als nächstes wird, wenn die behandelte Pellet akzeptiert die Probe hat als angenommen. Wenn das behandelte Pellet wird verworfen, das weitere Steuer Pellet wird angenommen, wird die Probe erzielt als abgelehnt.

Abbildung 2
Bild 2: Der Verbrauch von Thalassoma bifasciatum von Futterpellets (Mittelwert + SE) mit rohen organischen Extrakte von Schwämmen in natürlichen Konzentrationen, erstmals 1995 von Pawlik berichtet 12 Fisch verzehrt alle 10 Kontrollpellets in allen Fällen. Nach jeder Artname, wird die Anzahl der Wiederholungsproben angegeben (jede Wiederholung von der separaten Extraktion eines geografisch getrennten Probe der Schwammgewebe). Für jeden einzelnen Test wurden Extrakte als Abschreckung, wenn die Anzahl von Pellets gegessen weniger als oder gleich 6 war (p = 0,057, modifiziert Fisher-Test), wie durch die gestrichelte Linie im Diagramm angegeben.

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Discussion

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Das hier beschriebene Verfahren stellt ein relativ einfaches, ökologisch relevanten Laborprotokoll für die Bewertung antipredatory chemische Abwehr in Meeresorganismen. Hier beschreiben wir die wichtigsten Kriterien, die von diesem Satz von Methoden erfüllt werden:

(1) Geeignete Raubtier. Das Fütterungstest verwendet den bluehead Lippfische, Thalassoma bifasciatum, einer der am häufigsten vorkommenden Fische auf Korallenriffe in der Karibik. Die bluehead ist ein Generalist Fleischfresser bekannt, ein breites Sortiment von Makrozoobenthos 19 kosten. Generalist Raubtiere sind die beste Wahl für diesen ersten Tests, weil die Mehrheit der Raubfische auf Riffe sind Generalisten, und es wäre zu erwarten, dass antipredatory Verteidigung würde weitgehend gegen sie gerichtet werden, im Gegensatz zu Fachraubtiere, die Mechanismen entwickelt, kann auf Verteidigung zu umgehen haben werden. Labor-Untersuchungen von chemischen Abwehrkräfte mit einem einzigen potenziellen Räuber sindzehn, gefolgt von zeitaufwendiger und komplizierter Feldversuchen, die auf den Antworten von einem vollen Satz von potentiellen Feinden unter Feldbedingungen 28 bis 33 verlassen.

(2) Extraktion Verfahren. Die erste Tissue-Extraktionsschritt, der ein Lösungsmittelgemisch aus gleichen Teilen Dichlormethan (DCM) und Methanol (MeOH) verwendet, rasch durchdringt Gewebe Solubilisierung von Membranen und Dehydratisieren Zellmaterial. Das Gewebe wird entwässert nach diesem Schritt, so dass die nachfolgenden Schritte Extraktion verbleibende Metaboliten aller Polaritäten in MeOH. Wiederholen der Extraktion in MeOH bis das Gewebe vollständig extrahiert bildet einen abschließenden Extraktionsverfahren. Geringfügige Variationen dieses Extraktionsschema akzeptabel sind, wie beispielsweise Substitution von einem Extraktionslösungsmittel für eine andere der gleichen Polarität, aber Gewebeextraktion kann unvollständig sein, wenn eine ungeeignete Lösungsmittel verwendet. Potenzielle Fallstricke unsachgemäßer Gewebeextraktionsverfahren werden ausführlich an anderer Stelle besprochen <sup> 8.

(3) Herstellung von experimentellen Nahrung. Muss die künstliche Nahrungsmatrix des Gewebes des Zielorganismus sowohl in der ernährungsphysiologischen Qualität und Konzentration des Sekundärmetaboliten zu simulieren. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichen sensorischen Prozesse, die Raubtiere zu verwenden, um Fütterung-Abschreckung Metaboliten abzulehnen sind auch in der Wahrnehmung der ernährungsphysiologische Qualität von Lebensmitteln beteiligt. Lebensmittel mit niedrigem Nährstoffqualität kann bei wesentlich geringeren Mengen von chemischen Verteidigung abgelehnt werden, und umgekehrt kann Sekundärmetabolite nur Abschreckung bei höheren als natürlichen Konzentrationen, wenn diese Metaboliten in einer künstlichen Nahrung, die nahrhafter als der Gewebe präsentiert, aus dem er abgeleitet wurde. Pulverisierte, gefriergetrocknet Tintenfisch Mantel ist eine sinnvolle Nahrungsersatz, da es leicht verfügbar, leicht zu messen, und ihre ernährungsphysiologischen Merkmale, stehen bereits fest 34.

Die zweite Überlegung bei der Vorbereitung der experimentelle Nahrung betrifft die Bestimmung der Konzentration des Extraktes, die auf der Grundlage des Umfangs nicht Masse erfolgen muss. Predators essen Feuchtgewebe und das Gewebe von Meeresorganismen sind sehr unterschiedlich in Wassergehalt. Aus der Perspektive der ein Raubtier, wäre ein Biss von einer Qualle oder Seeanemone wesentlich mehr Wasser pro Einheit Trockenmasse als die gleich großen Biss eines Tintenfisch oder Meeresschnecke enthalten. Für hochhydratisierten Gewebe würde die Konzentration des Metaboliten pro Einheit Trockenmasse viel höher sein als je Volumeneinheit, aber Volumen (Bisse) ist das Maß, die ökologisch relevant ist. Darüber hinaus kann Gewebe von Meeresorganismen sehr unterschiedliche Dichten aufgrund der Mineralskelettelemente. Bestimmung von Metaboliten Volumenkonzentration löst beide Probleme und die relevanteste Maß unter dem Gesichtspunkt des Verbrauchs von Gewebe durch eine Potentialraubtier. In diesem Thema mit Beispielen aus der Literatur, wird an anderer Stelle ausführlich 8 diskutiert.

.. content "> (4) Experimentelle Gestaltung und statistischer Ansatz Geeignete experimentelle Design und statistische Analysen der Daten sind ebenso wichtig für die Verhaltenstests, wie für jede andere wissenschaftliche Forschung, die die Bestimmung der Signifikanz der Unterschiede in der experimentellen Ergebnisse beinhaltet die hier beschriebenen Analyse ist einfach: Differenzen werden mit einer modifizierten Kontingenztabelle bestimmt. Das Verfahren erfordert, dass alle Steuerspeiseopfer verbraucht, da der Untersucher nicht mit experimentellen Raubtiere, die nicht auf Steuer Lebensmittel 8 Fütterung wurden werden kann. Obwohl die Verwendung von Fisher-Test wurde von seinem ursprünglichen verändert wurde Verwendung von Pawlik et al. 12, bleibt der Schwellenwert von 6 behandelten Pellets gegessen unverändert. Im Laufe der Jahre haben andere statistische Tests als Ersatz vorgeschlagen worden, aber nach Rücksprache mit Mitarbeiter James E. Blum (UNCW Fachbereich Mathematik und Statistik verworfen ). Zum Beispiel McNemars Test wurde vorgeschlagen,aber ungeeignet ist, sowohl weil es fehlt ein passendes Set von Daten, und weil eine Zeile der Kontingenztabelle wird bei 10 Kontrollpellets fixiert gegessen.

Trotz unserer Erfahrung, dass diese Testverfahren bietet bemerkenswert klare Ergebnisse stützt sie sich dennoch auf eine Verhaltensreaktion. Wenn Fische für eine Zeitdauer vor dem Test hungern, können sie mehreren behandelten Pellets, als wenn ein Fisch wurden gut zugeführt werden, insbesondere wenn eine defensive Metabolit in den behandelten Futterpellets vorhanden bei einer schwellennahe Aktivitätskonzentration essen. Aus diesen Gründen sollten die Ergebnisse des Fütterungstests nicht überbewertet werden. Beispielsweise kann ein Unterschied zwischen zwei Gewebeproben von 1/10 vs 9/10 Pellets gegessen zeigt die erste Probe ist Abschreckung und das zweite ist nicht, aber ein Unterschied von 3/10 vs 5/10 Pellets gegessen kann aufgrund Verhaltensänderung sein zwischen Assays, und die erste Probe ist nicht notwendigerweise abschreckenderen als die zweite.

Ein Schlüssel applicatIonen dieser Bioassay ist seine Verwendung in fraktionierenden Bioassay, wobei aufeinander Partitionen der Rohextrakt auf Fische getestet, um die chemischen Verbindungen für die Zufuhr-Abschreckungs Aktivität 29,32-33,35-38 verantwortlich isolieren. Sobald die Anwesenheit eines chemischen Abwehrfestgestellt wurde, wird das rohe organische Extrakt chromatographisch in kleinere Untergruppen von Verbindungen, aus denen das Gemisch fraktioniert, und diese Teilmengen zugeführt, um in der gleichen Fütterungstest fischen. Auch dies sollte auf einer volumetrischen Basis durchgeführt werden, mit "ml Äquivalente" Gewebeextrakt anstatt Massenäquivalente. 4 ×, 2 ×, und 1 x: Da die Trennung verläuft, werden Fraktionen am besten als eine Verdünnungsreihe in Bezug auf die natürliche Volumenkonzentration untersucht. Diese Spannweite von Konzentrationen berücksichtigt die voraussichtlichen Verringerung abschreckende Wirkung, die von Spaltung der aktiven Metaboliten über zwei oder mehr chromatographischen Fraktionen oder aus dem Verlust von aktiven Metaboliten throu kommtgh Zersetzung Reaktion oder Bindung an chromatographischen Medien. Sobald die aktiven Metaboliten durch einen fraktionierenden Bioassay isoliert worden ist, kann der Forscher sie mit Standard-spektroskopischen Methoden zu erkennen und auch das gleiche für inaktive Fraktionen, Sekundärmetabolite haben können, zu tun. Ebenso wichtig ist es zu wissen, welche sekundären Metaboliten sind aktiv in ökologisch relevanten Experimenten als zu wissen, welche Stoffwechselprodukte nicht 8.

Elemente dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um neue experimentelle Techniken entwerfen. Zum Beispiel wurde das Bioassay für wirbellosen Räuber angepasst (zB Krabben und Seesterne 39 40), für andere geografische Regionen 41 und sogar auf andere Forschungsfragen anzugehen (zB Strukturabwehr 31,34,42 und Aposematismus 27). Die vier Kriterien sollten als Richtlinie für zukünftige Anpassungen dieser Methode dienen. Zusammengefaßt zeigte diese Bioassay Verfahren provides eine ökologisch relevante Verfahren für die Bewertung der antipredatory chemische Abwehr von Geweben von Meeresorganismen. Studien mit diesem Verfahren haben unser Verständnis der Faktoren, die die Verbreitung und Häufigkeit der marinen Wirbellosen auf karibischen Korallenriffe (zB zuletzt Loh und Pawlik 26) und zu informieren Untersuchungen in verschiedenen Bereichen der Forschung, einschließlich der Pharmakologie, Biotechnologie und Kontrolle voran Evolutionsökologie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen
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Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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