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물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

이러한 생물학적 검정은 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스를 이용 농도 천연 해양 생물의 조직 유기 추출물로부터 병입 억지 대사의 존재를 평가하기위한 모델 육 물고기를 이용한다.

Introduction

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화학 생태학 화학자 및 생태 학자의 협력을 통해 개발했다. 지상파 화학 생태학의 subdiscipline 몇 시간 동안 주변되었습니다 있지만, 해양 화학 생태학의는 몇 십 년 오래지만 해양 생물 1-8의 진화 생태학과 사회 구조에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다. 스쿠버 다이빙과 NMR 분광법의 응급 기술을 활용, 유기 화학자들은 빠르게 1970 년대와 1980 년대 9 저서 무척추 동물과 조류의 소설 대사를 설명하는 출판물의 큰 숫자를 생성합니다. 이차 대사 산물 경험적 증거도없이 새로운 화합물에 생태 학적으로 중요한 특성을 관찰 작용이 책의 많은 어떤 목적을 봉사해야한다는 것을 가정. 약 동시에, 생태도 분포 이전에 이리저리 알려진 저서 동물과 식물의 풍부함을 스쿠버 다이빙의 출현을 활용하고 설명했다준설 상대적으로 비효율적 인 샘플링 방법을 해요. 이러한 연구자의 ​​가정은 고착 아무것도 부드러운 바디 화학적 육식 동물 (10)에 의해 소비를 방지하기 위해 방어해야이었다. 종 중 농도에 달리 설명 작업 사용했던 경험주의를 소개하는 노력의 일환으로, 일부 생태 독성 분석 (11)에서 화학 방어를 외삽하기 시작했다. 대부분의 독성 분석은 절반 분석 유기체를 죽이는에 대한 책임 추출물의 건조 질량 농도의 후속 결정으로, 전체 물고기 나 무척추 동물 조직의 원유 유기 추출물의 수성 현탁액에 다른 생물의 노출을하고있었습니다. 그러나 독성 분석은 잠재적 인 포식자가 자연 상태에서 먹이를 인식하는 방식을 모방하지 않으며, 후속 연구는 독성과 기호성 12 ~ 13 사이의 관계를 발견했다. 그것은 권위있는 저널에 출판이 거의 또는 전혀 ecologica을 가진 기술을 사용하는 것은 놀라운 일이다L 관련성 14-15 것을이 연구가 아직 널리 인용된다 오늘. 그것은 독성 데이터를 기반으로 연구 16-18을 게시 할 계속주의하는 것이 더욱 놀랍다. 여기에 설명 된 생물 검정 방법은 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 해양 화학 생태에 대한 생태 학적으로 중요한 접근 방법을 제공하기 위해 1980 년대 후반에 개발되었다. 방법은 생태 학적으로 의미있는 독성 데이터보다 기호성 데이터를 제공, 식품 영양 학적으로 유사한 매트릭스 천연 농도 대상 유기체로부터 조 유기 추출물을 샘플링 포식자 모델을 필요로한다.

(1) 적절한 제너럴 육식 동물이 먹이 분석에 사용되어야한다, (2) 모든 극성 유기 대사가 철저의 조직에서 추출해야합니다 해양 생물의 조직의 antipredatory 활동을 평가하는 일반적인 방법은 네 가지 중요한 기준을 포함 생물체를 대상으로, (3) 대사 ㄴ해야같은 체적 농도 영양 적절한 실험 음식에 혼합 전자는 그들이 추출하고, (4) 실험 설계 및 통계 방법은 의미있는 메트릭이 상대 distastefulness을 표시하기 위해 제공해야하는 유기체에서 발견.

아래에 설명 된 절차는 카리브해 해양 무척추 동물에 antipredatory 화학 방어를 평가하기 위해 설계되었습니다. 이 종은 카리브해 산호초에 공통이며, 저서 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려져 있기 때문에 우리는 모델 육식 물고기 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum을 사용합니다. 표적 조직은 유기체로부터 먼저 추출 식품 혼합물과 결합하고, 마지막 T. 그룹에 제공되며 bifasciatum은 추출물 처리 된 음식을 거부 여부를 관찰합니다. 이 방법을 사용하여 분석 데이터는 해양 생물 12,20-21, L의 수비 화학에 중요한 통찰력을 제공하고 있습니다IFE의 역사 절충 22-24, 지역 사회 생태 25-26.

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Protocol

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참고 :이 프로토콜의 3 단계는 척추 동물의 과목을 포함한다. 절차는 동물이 가능한 가장 인도적인 치료를받을 수 있도록 설계되었으며, 노스 캐롤라이나 윌 밍턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다.

1) 조직 추출

  1. 이 이차 대사 산물의 체적 농도를 변경하므로 수화가 아닌 압착, 건조 아웃 또는 지나치게 젖은의 자연 상태에있는 조직을 사용합니다. 리거나 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 삽입 할 수있는 부분 또는 슬라이스로 조직 들어온다. 참고 : 신선한 조직은 경우에 따라 사용될 수 있지만,자를 때 압착 적용​​되지 않는 고정 된 조직을 잘게 자르거나하는 것이 낫다.
  2. (1) 30 ㎖에 조직편을 추가 40 ㎖의 최종 부피까지 졸업 원심 분리 튜브에서 한 혼합물을 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올 (MeOH 중하는)에 도달한다. 의 전송을 포함하는 모든 단계를 수행해야합니다적절한 환기와 흄 후드에서 용매.
  3. 튜브를 씌우고 그것을 여러 번 반전 한 후 4 시간 추출 기간 동안 반복적으로 선동. 주 :이 기간 동안 물을 MeOH와 결합하고, 생성 된 메탄올 : 물상은 DCM 상으로부터 분리한다. 조직 교대 DCM 및 메탄올에 노출되어 물을 에멀젼으로서 튜브 교반 된 바와 같다.
  4. 둥근 바닥 플라스크에 DCM 추출물을 전송 및 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (<40 ° C). 최소한의 용매를 사용하여, 20 ㎖의 섬광 바이알에 건조 된 추출물을 전송. 회전 증발기 어댑터 바이알 맞고 다시 낮은 열을 이용 회전 증발기에서 증발 건고 (<40 ° C).
    주 : (1) 너트 (2) 와셔, 및 (3) 도토리 너트 : 다음 단계는 나사산로드의 단부 상에 순차적으로 다음 항목을 나사 결합에 의해 조립 될 수있는 제 압축 장비의 사용을 요구한다. 세탁기 중 하나를 천공해야 또는그것은 50 ㎖ 원심 분리 튜브의 내부 지름보다 작도록 끼워.
  5. 조직 및 메탄올이 포함 졸업 원심 관으로 되돌아 : 물 추출물을 통해 압축 조직에서 추출 매질을 짠다. 메탄올로 이동 : 같은 둥근 바닥 플라스크에 물 추출물을 냉장 보관 (<10 ° C).
  6. 물 추출물 : 다음 새 메탄올은 메탄올이 들어있는 냉장 둥근 바닥 플라스크에 압축 전송, 지금은 탈수 조직이 2 ~ 6 시​​간 지속 시간의 두 번째 추출에 빠져들 때까지 졸업 원심 분리기 튜브에 메탄올을 추가합니다. 조직이 충분히 추출되지 않았다고 임의 우려가있는 경우, 2 시간 내지 6의 MeOH 추출을 반복한다.
  7. 낮은 열을 사용하여 회전식 증발기에서 메탄올을 건조시키고 (<40 ° C). 둥근 바닥 플라스크를 헹구어의 MeOH를 사용하여 최소한의 볼륨, 건조 비극성 추출물을 함유하는 섬광 바이알로 둥근 바닥 플라스크에서 남은 수용성 추출물을 전송.
  8. E진공 농축기에 낮은 열 (<40 ° C)를 사용하여 건조시켜 수용성 추출물을 vaporate. 섬광 유리 병은 이제 조직 10 ㎖의 총 건조 원유 유기 추출물이 포함되어 있습니다. , 산화를 방지하기 위해 N 2 가스로 유리 병의 헤드 공간을 대피 단단히 밀봉 및 저장 냉동 (-20 ° C).

2) 음식 준비

  1. 동결 건조 오징어 맨틀 분말을 준비합니다.
    주 : 오징어 맨틀 다른 저생 무척추 동물에 필적하고, 2.2의 하위 단계에 성분으로 사용될 영양의 공급원을 제공한다.
    1. 따뜻한 탈 (DI) 물 오징어 맨틀의 해동 냉동 반지, 다음 고속 믹서기에서 그들을 퓌 레.
    2. 얕은 쿠키 시트 및 동결 (-20 ° C)에 퓌레 오징어 맨틀의 얇은 층을 붓고, 그 다음 작은 조각으로 동결 건조 할을 냉동 오징어 퓌레의 시트를 휴식.
    3. FR의 운영 절차에 따라 냉동 오징어 맨틀 퓌레를 동결 건조eeze 건조기.
    4. 분말을 형성 고속 블렌더 오징어 맨틀 퓌레의 동결 건조 된 조각을 분쇄.
    5. 흄 후드에서 회전 밀가루를 체로 치는으로 분말 오징어 맨틀을 부어 미세 분말로 조직의 큰 덩어리를 분리하는 선별.
    6. 밀봉 용기에 미세 분말 오징어 맨틀을 전송합니다. 산화를 방지하고 냉동 저장하는 N 2 가스로 용기 헤드 공간을 대피 (-20 ° C).
  2. 식품 혼합물을 준비합니다.
    참고 : 필요한 경우 연속 된 여러 분석을 실행할 때, 그것은 ~ 음식을 혼합 100 ㎖를 준비하는 것이 실용적이다, 그러나이 조리법은 작은 볼륨을 확장 할 수 있습니다.
    1. 150 ㎖ 비이커에 3g 알긴산 DI 물 100㎖로 5g을 동결 건조 오징어 맨틀 분말 혼합물을 결합. 분말이 완전히 수화하고, 혼합물이 균질해질 때까지 몇 분 동안 격렬히 교반하여 microspatula.
      원하는 경우, 식용 색소는 본 보안 목표 명세서에 추가 할 수 있습니다 참고EP : 오히려 첨가하여 추출 처리 혼합물의 색상을 일치하려고하기보다는 (추출물 처리 혼합물 추출물의 천연 색소 마​​스킹) 모두 처리 및 제어의 혼합물을 생성 식품 혼합물에 염료를 추가하는 것이 더 쉽다 제어 염료 혼합물. 녹색을 띤 갈색 또는 식품 색상 조 추출물에서 어떠한 안료를 마스크하는 것이 바람직하다.
    2. 졸업 주사기로 음식을 혼합 10 mL를 정확하게 넣습니다. 이 과정에서 기포의 혼입을 방지하기 위해주의한다.
    3. 냉동 건조 원유 유기 추출물 20 ㎖ 섬광 유리 병을 제거합니다. 드롭을 추가 또는 메탄올의 두 사람은 다음 microspatula와 균일 한 혼합물에 추출물을 저어.
    4. 20 ㎖ 섬광 유리 병에 음식 행렬의로드 10 ML의 주사기를 꺼내 추출물 처리 된 음식 혼합물을 균질화 microspatula 저어.
      R 다음, 그것은 작은 단위 (예에서 주사기를 배출하는 데 도움이 될 수 2 ml의 배출 및 균질화 :. 참고모든 10 ml의 때까지 EPEAT)의 균질화되고있다.
  3. 분석 알약을 준비합니다.
    1. 주사기로 추출 혼합물 (~ 1 ㎖)의 매우 작은 체적을로드하고, 0.25 M의 CaCl2를 용액에 주사기 팁 잠수함. 긴 형상 스파게티 스트랜드를 형성하도록 주사기의 내용물을 꺼내기.
    2. 몇 분 후, 다음, 면도날 유리 커팅 보드에 4mm 긴 펠릿으로 들어온다, 경화 가닥을 제거 해수를 세정한다.
    3. 반복 제어 알약을 만들기 위해 조직 추출물을 포함하지 않고 2.3.1와 2.3.2 단계를 반복합니다. 용매의 동등한 볼륨 제어 알약을 치료해야 용매 추가 할 제어 (단계 2.2.3에서 처리 혼합물에 메탄올을 첨가 참조). 음성 대조군, 즉 분석 물고기가 먹이 단념 할 수 확인이 MG ml의 농도에서 denatonium 벤조 에이트를 추가 -1 원시 음식 혼합물 (27)로하는 것이 바람직합니다.

3) 기호성생물 검정

  1. 자연산 노란색 상 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum와 공급 분석을 수행, 실험실 수조의 불투명 양면 구획의 세 그룹으로 유지했다.
  2. 고무 전구 유리 피펫을 사용하여 해수의 비이커에서 식품 알약을 제공합니다. 참고 :이 방법으로 음식을받을 물고기를 양성하는 몇 일이 걸릴 수 있습니다. 음식의 전달을 앞에 조절 자극 (수족관 유리 피펫의 예를 몇 가지 탭은) 음식 펠릿의 추가를 기대하는 물고기를 훈련하는 것이 도움이 될 수있다.
  3. 알약을 채점. 쉽게 물고기에 의해 소비되는 경우 펠릿 허용 고려하십시오. 자신의 구강에 걸릴 하나 이상의 물고기에 의해 세 번 최소 후에 먹게하지 않을 경우 펠릿이 거부 고려, 펠릿 접근하고 하나의 시도 후 무시 된 경우에는.
  4. 점수 샘플. 참고 : 분석 절차는 그림 1에서 플로우 차트로 묘사된다 식사를 거부 물고기의 그룹.프로토콜의 모든 단계에서 제어 펠렛을 추가로 간주되지 않습니다. 분석의 단일 실행의 두 가지 잠재적 인 결과가 있습니다 샘플 허용 또는 거부 중 하나.
    1. 물고기의 그룹이 협력 여부를 확인하기 위해서 제어 펠렛과 함께 시작합니다. 처리 된 펠렛을 제공합니다. 물고기가 처리 된 펠렛을 수락하면 수락으로, 샘플 점수. 물고기가 처리 된 펠렛을 거부 할 경우, 물고기가 먹이를 중단 여부를 결정하기 위해 후속 제어 펠렛을 제공합니다. 물고기가 후속 제어 펠렛을 적용하는 경우 거부로, 샘플 점수.
  5. 복제. 각 추출물에 대한 물고기의 열 독립적 인 그룹과 분석 절차를 반복합니다.

4) 평가 의의

  1. 피셔의 정확한 시험 (26)의 수정 된 버전으로 처리 펠릿 VS 제어 소비의 차이의 중요성을 평가한다. 컨트롤에 대한 한계 합계 및 치료 펠릿 고정되도록 테스트를 수정그들에게 모두 무작위 샘플을 치료. 참고 :이 페이지 제공 = 0.057 7 펠렛을 먹을 때; 7 이상의 펠릿을 먹을 경우 따라서, 어떤 추출물을 6 개 이하의 펠릿을 먹을 경우 억지력으로 간주하고 맛이있다.
  2. 추출물의 집단 간의 상대적 기호성을 비교하기 위해, 각 그룹 내에서 먹을 펠릿의 평균 수를 계산합니다. 펠릿의 평균 수는 + 먹을 경우 너무 복제 추출물의 그룹이 억지력으로 간주됩니다 6 펠릿 임계 값을 유지 표준 오차 (SE) ≤6. 주 : 대표적인 결과, 그룹 할당은 종이므로 복제 추출물을 구별 개체로부터 와서 상대 기호성 종간 비교 될 수있다.

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Representative Results

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여기에 우리가 일반적으로 카리브해 스폰지의 여섯 종 (그림 2)이 생물 검정의 결과를보고합니다. 이러한 데이터는 처음 Pawlik 등. (12)에 의해 1995 년에 출판 및 공동 발생하는 분류군 중 화학 방어 전략의 차이를 조사하기 위해이 방식의 힘을 보여되었다. 결과는 표준 오차 (SE) 각 종 + 먹은 음식 펠릿의 평균 숫자로보고되었다. 거의 펠릿 Agelas의 clathrodes, Amphimedon compressaAplysina의 cauliformis에서 원유 유기 추출물과 분석에서 먹게되지 않았다. 반면, Callyspongia vaginalis에, Geodia의 gibberosaMycale laevis의 추출물로 만든 펠릿을 쉽게 분석 (12)에서 소비되었다. 6 개 이하 펠릿은 처음 세 종 먹게되었다, 그래서 그들은 크게 고려 제지했다. 대조적으로, 제 2의 3 종 대조군 차이가 없었다하고 있었다입에 고려했다.

그림 1
그림 1 :. 분석 절차의 도식은 모든 단계에서, 제어 펠렛의 거부는 분석 물고기의 세트가 비협조적 또는 만족을 했소하고 더 사용할 수 없음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 처리 된 펠렛 다음 물고기 제어 펠렛의 각 세트를 제공함으로써 시작된다. 수락 다음에, 처리 된 펠릿을 승인되면 샘플 획득된다. 처리 된 펠릿을 거부하지만, 후속 제어 펠렛 승인되면 거부 된 상태로, 샘플 획득된다.

그림 2
그림 2 : 음식 펠릿의 Thalassoma의 bifasciatum에 의해 소비 먼저 Pawlik에 의해 1995 년에보고 된 자연 농도 스폰지의 원유 유기 추출물을 포함하는 (SE + 의미) (12) 물고기는 모든 경우에 모든 10 제어 알약을 소비. 각 종 이름 후, 복제 샘플의 수 (각각 스폰지 조직의 지리적 별개의 시료의 분리 추출에서 복제) 지정됩니다. 그래프에서 점선으로 나타낸 바와 같이 개별 분석에서, 추출물을 먹은 펠릿의 수는 6보다 작거나 동일한 경우였다 (p = 0.057, 피셔의 정확한 시험을 변성) 억지력으로 간주 하였다.

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Discussion

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본원에 기술 된 절차에 antipredatory 해양 생물 화학적 방어를 평가하기위한 상대적으로 간단하고, 생태 학적으로 중요한 실험 프로토콜을 제공한다. 여기에서 우리는 방법이 세트에 만족하는 중요한 기준을 검토 :

(1) 적절한 육식 동물.이 공급 분석은 bluehead 놀래기과의 바닷물 고기, Thalassoma의 bifasciatum, 카리브해 전역의 산호초에 가장 풍부한 물고기 중 하나를 사용합니다. bluehead 저서 성 무척추 동물 (19)의 넓은 구색을 샘플링 알려진 제너럴 육식 동물이다. 포식자가 암초에 약탈하는 물고기의 대부분은 제너럴 때문에 이러한 초기 분석을위한 최선의 선택이며, 그것은 방어를 우회하는 메커니즘을 진화 할 수 있습니다 전문 포식자에 반대 antipredatory 방어가 광범위하게, 그들에 대항 할 것으로 예상된다. 하나의 잠재적 인 포식자를 사용하여 화학 방어 연구소의 설문 조사의 아르열 필드 조건 28-33에서 잠재적 인 포식자의 전체 보수의 응답에 의존하는 더 많은 시간과 복잡한 필드 실험 하였다.

(2) 추출 과정., 균등 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올 (MeOH 중)의 용매 혼합물을 사용하여 신속하게 막을 가용화 및 세포 물질을 탈수, 조직을 투과하여 제 티슈 추출 단계. 조직이 단계 후 탈수, 그래서 다음 단계는 메탄올의 모든 극성의 나머지 대사 산물의 압축을 풉니 다. 완전히 추출 조직 철저한 추출 과정을 구성 할 때까지 메탄올에서 추출을 반복. 이 추출 방식에 약간의 변동 사항은 동일 극성의 또 다른 하나의 추출 용매의 치환으로 허용하지만, 부적절한 양의 용매를 사용하는 경우, 조직 추출은 불완전 할 수있다. 부적절한 조직 추출 절차의 잠재적 인 함정은 다른 곳에서 자세히 설명되어 <SUP> 8.

(3) 실험 식품의 제조. 인공 식품 영양 행렬 품질과 이차 대사 산물의 농도 모두에서 대상 생물체의 조직을 시뮬레이션한다. 그것은 육식 동물이 먹이-억제 대사 산물을 거부 할 때 사용하는 것과 같은 감각 과정이 또한 음식의 영양 품질의 인식에 관여하는 것으로 보인다. 낮은 영양 품질과 식품 화학 방어 훨씬 낮은 수준에서 거부 될 수 있으며, 그 대사 산물이 조직보다 더 영양가 인공 식품에 표시하는 경우 반대로, 이차 대사 산물은보다 높은 자연 농도에서 억제를 될 수있는 그것은 파생되었다. 그것은 쉽게 측정 할 쉽게 이용할 수 있으므로, 분말, 냉동 건조 오징어 맨틀 유용한 영양 대체이며, 그 영양 적 특성이 이미 34 결정되었다.

준비의 두 번째 고려 사항 실험 음식 부피 아니라 질량을 기초로 수행되어야 추출물의 농도의 결정에 관한 것이다. 육식 동물은 젖은 조직을 먹고, 해양 생물의 조직은 수분 함량이 매우 다양. 육식 동물의 관점에서, 해파리 또는 바다 말미잘 물린 오징어 또는 바다 슬러그 같은 크기 물린보다 단위 건조 질량 당 실질적으로 더 많은 물을 포함 할 것이다. 고도로 수화 조직의 경우, 건조 질량 부 당 대사 물질의 농도는 단위 체적 당보다 높은 것이지만, 양 (바이트)는 생태 학적으로 중요한 척도이다. 또한, 해양 생물의 조직 때문에 미네랄 골격 요소의 매우 다른 밀도를 가질 수있다. 체적 대사 산물 농도의 결정은 두 문제를 해결하고 잠재적 포식자에 의하여 조직의 소비의 관점에서 가장 중요한 척도이다. 문학에서 예제를 포함하여이 항목은, 세부 사항 다른 8에 설명되어 있습니다.

.. 내용 "> (4) 실험 설계 및 통계적 접근법 적절한 실험 설계 및 데이터의 통계적 분석은 실험 결과의 차이의 중요성을 결정하는 것을 포함하는 다른 과학 연구로서 행동 분석을위한 중요하다 본원에 기재된 분석은 간단하다 : 차이는 수정 된 비상 테이블로 결정된다.이 방법은 모든 제어 음식 제공은 연구자가 제어 식품 (8)에 공급되지 않은 실험 육식 동물을 사용하지 않기 때문에 소비해야합니다. 피셔의 정확한 테스트의 사용이 초기에서 수정되었지만 Pawlik에 의해 사용 등. (12), 먹 (6) 처리 펠릿의 임계 값이 변경되지 않습니다. 지난 몇 년 동안, 다른 통계 테스트를 대체으로 제시하지만, 협력자 제임스 E. 블룸 (수학 통계의 UNCW학과와 협의 한 후 폐기 된 ). 예를 들어, McNemar의 시험이 제안되었다,이 데이터의 일치하는 집합이 부족하고, 비상 테이블의 행이 10 제어 펠렛에 고정되어 있기 때문에 식사를 모두 있기 때문에, 부적절하다.

이 분석 방법은 매우 명확한 결과를 제공하는 우리의 경험에도 불구하고, 그럼에도 불구하고 행동 응답에 의존한다. 물고기가 분석하기 전에 일정 기간 동안 굶어하는 경우, 그들은 더 많은 처리 수 펠릿 물고기가 방어 대사 활동의 거의 임계 농도에서 처리 된 음식 펠릿에 존재하는 경우에 특히 잘 공급 된 경우가 만들 때보를 먹을 수있다. 이러한 이유로, 공급 분석의 결과는 오버 해석 할 수 없습니다. 예를 들어, 1/10 9/10 먹게 VS 펠릿 개의 조직 샘플 사이의 차이는 제 샘플 억지력이고 두 번째가 아니라, 3/10 5/10 먹게 VS 펠릿의 차이가 행동 변화에 기인 할 수있다 나타낸다 분석하고, 제 1 샘플 사이 반드시 초 이상 억제하지 않다.

키 입학 원서이 생물 검정의 이온 조 추출물의 연속 파티션이 공급-억제 활동 29,32-33,35-38에 대한 책임이있는 화학 화합물을 분리하는 물고기에 테스트함으로써 생물 검정 유도 분류,에서의 사용이다. 화학적 방어의 존재가 확인되면, 조 유기 추출물을 크로마토 혼합물을 구성하는 화합물의 더 작은 서브 세트들로 분별 증류되고, 이러한 서브 세트는 동일한 공급 분석 생선에 공급된다. 다시, 이것은 조직 추출물보다는 질량 당량 "ml의 당량"를 사용하여, 체적 기준으로 이루어져야한다. × 4, 2 ×, 1 × : 박리가 진행되면서 분획 가장 자연 체적 농도로 용액을 희석 상대적으로 분석 하였다. 농도의이 기간은 계정에 두 개 이상의 크로마토 그래피 분수를 통해 또는 활성 대사 산물의 손실 throu에서 활성 대사 산물을 분리에서 오는 억지력 활동의 가능성이 감소한다성장 호르몬 분해, 반응, 나 첨부 파일이 미디어를 크로마토 그래피합니다. 활성 대사 물질이 생물 검정 유도 분류에 의해 분리되고 나면, 수사관 표준 분광 기술을 사용하여 식별 할 수 있으며 이차 대사 산물을 가질 수있다 비활성 분수에 대한 동일한 작업을 수행해야합니다. 그것은 8가되지 않는 대사 산물 알고로 생태 학적으로 관련 실험에서 활성화 된 보조하는 대사 산물 알고 똑같이 중요하다.

이 절차의 요소는 또한 새로운 실험 기법을 설계하는 데 사용될 수있다. 예를 들어,이 생물 검정 (예를 들어 구조적 방어 31,34,42과 경계색 27) 다른 지리적 영역 (41), (예 39에서 seastars 40 게는) 무척추 동물 포식자에 적합하고, 심지어는 다른 연구 문제를 해결하기 위해. 4 가지 기준은이 방법의 미래 적응에 대한 안내 역할을한다. 요약하면,이 생물 검정 절차 홍보해양 생물의 조직에서 antipredatory 화학 방어를 평가하기위한 생태 학적으로 적절한 방법을 ovides. 이 절차를 사용하여 연구는 카리브해 산호초 (예를 들어 가장 최근에, Loh에와 Pawlik 26) 약학, 생명 공학을 포함하여 탐구의 다양한 분야, 및 알릴 수 조사 및에 분포 및 해양 무척추 동물의 풍요 로움을 제어하는 요인에 대한 우리의 이해를 전진했다 진화 생태학.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
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물고기 먹이 실험 생물 검정은 해양 생물의 조직에서 이차 대사 산물의 Antipredatory 활동을 평가하기 위해
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Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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