Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

Bu biyo-deney, bir besleyici olarak benzer gıda matris kullanılarak, doğal konsantrasyonlarda deniz organizmalarının dokuların Organik özütlerden besleme-caydırıcı metabolitlerinin varlığını değerlendirmek için bir model yırtıcı balık kullanmaktadır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kimyasal ekoloji kimyagerler ve ekolojist işbirliği ile geliştirdi. Karasal kimyasal ekoloji subdiscipline bir süre için yaklaşık edilmiş olsa da, deniz kimyasal ekoloji sadece bir kaç yıl eski ama deniz organizmalarının 1-8 evrimsel ekoloji ve toplum yapısına önemli bilgiler sağlamıştır. Aletli dalış ve NMR spektroskopisi acil teknolojileri yararlanan, organik kimyacılar hızla 1970'lerde ve 1980'lerde 9 bentik omurgasız deniz ve yosun gelen yeni metabolitleri anlatan yayınların çok sayıda üretti. Sekonder metabolitler ampirik kanıt olmadan yeni bileşikler ekolojik önemli özellikleri atfedilen bu yayınların çoğu bazı amaca hizmet etmelidir varsayarsak. Hakkında aynı zamanda, ekolojistler de dağılımları ve daha önce sağa sola bilinen bentik hayvanların ve bitkilerin zengindi SCUBA dalış gelişiyle yararlanarak ve açıklayan edildiBöyle tarama gibi nispeten etkisiz örnekleme yöntemleri m. Bu araştırmacıların varsayım sesil şey ve yumuşak gövdeli kimyasal avcılardan 10 tarafından tüketimini önlemek için savunulması gerektiğini oldu. Türler bolluk aksi açıklayıcı bir işti ne ampirizmi tanıtmak için bir çaba, bazı ekolojistler toksisite deneyleri 11 kimyasal savunma extrapolating başladı. Çoğu toksisite deneyleri yarım tahlil organizmaları öldürmekten sorumlu özleri kuru kütle konsantrasyonlarının sonraki kararlılıkla, bütün balık veya omurgasız dokuların ham organik özler sulu süspansiyonlar diğer organizmaların poz çıkıyor. Ancak, toksisite deneyleri, potansiyel saldırganları doğal şartlar altında av algıladıkları hangi şekilde taklit değil, ve daha sonraki çalışmalar toksisite ve lezzet 12-13 arasında hiçbir ilişki bulduk. Bu prestijli dergilerde yayınlar çok az ya da hiç Ecologica olan teknikleri kullanılan şaşırtıcıdırl alaka 14-15 ve bu çalışmalar hala yaygın atıf bugün. Bu toksisite verilerine dayalı çalışmalar 16-18 yayınlanmaya devam unutmayın daha da endişe verici olduğunu. Burada açıklanan biyodeney yöntemi antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için deniz kimyasal ekolojistler için bir ekolojik ilgili yaklaşım sağlamak için 1980'lerin sonlarında geliştirilmiştir. yöntem daha ekolojik anlamlı toksisite verilerine göre olan lezzet veri sağlayan, bir beslenme karşılaştırılabilir gıda matrisi içinde doğal bir konsantrasyonda hedef organizmadan bir ham organik özü örnek bir modeli yırtıcı gerektirir.

(1) uygun bir kültürlü yırtıcı besleme deneylerinde kullanılabilir olmalıdır, (2) her polarizasyona organik metabolitleri etraflıca dokusundan ekstre edilmelidir: deniz organizmalarının dokuların antipredatory aktivitesinin değerlendirilmesi için genel bir yaklaşım, dört önemli kriterler içerir organizmayı hedef, (3) metabolitleri b gerekirAynı hacimsel konsantrasyonda bir beslenme uygun deneysel gıda içine karışık bir e onlar çıkarıldı, ve (4) deneysel tasarım ve istatistiksel bir yaklaşım anlamlı bir metrik göreceli distastefulness göstermek için sağlaması gerekir hangi organizmada bulunduğu gibi.

Aşağıda belirtilen prosedür Karayip deniz omurgasız antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için tasarlanmıştır. Bu tür Karayip mercan resifleri üzerinde yaygındır ve bentik omurgasızlar 19 geniş bir ürün yelpazesine örnek bilinmektedir çünkü bir örnek yırtıcı balık gibi bluehead akya, Thalassoma bifasciatum, istihdam. Hedef organizmadan alınan dokular, ilk önce, ekstre bir gıda karışımı ile bir araya getirilmiş ve son olarak T. gruplarına sunulmaktadır bifasciatum onlar özü ile tedavi edilen gıdalar reddetmek olmadığını gözlemlemek için. Bu yöntemi kullanarak tahlil verileri deniz organizmalarının 12,20-21, l savunma kimya önemli bilgiler sağladıife geçmişi ticaret-off 22-24, ve toplum ekolojisi 25-26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: Bu protokolün 3. Adım omurgalı hayvan denekleri içerir. Prosedür hayvanlar mümkün olan en insancıl tedavi böylece dizayn edilmiştir ve Kuzey Carolina Wilmington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1) Doku Ekstraksiyon

  1. Bu ikincil metabolitlerin hacimsel konsantrasyonunu değiştirecek gibi hidrasyon ve sıkılmış, kurutulmuş-out veya aşırı ıslak doğal haliyle olduğu doku kullanın. Kesilmiş veya 50 ml'lik bir santrifüj tüpü içine sokulabilir parçaları veya dilimleri için doku kıyılır. Not: Taze doku bazı durumlarda kullanılabilir, ancak, cut sıkma tabi değildir dondurulmuş doku, kesme veya kesmek için, genellikle daha iyidir.
  2. Bir 1 30 ml doku parçaları ekleyin: 40 ml'lik bir son hacme kadar dereceli bir santrifüj tüpüne 1 diklorometan (DKM) ve metanol (MeOH) ulaşılır. Transfer ile ilgili tüm adımları doğru yaptığınızdan emin olunYeterli havalandırma ile bir davlumbaz içinde solvent.
  3. Tüp kap ve bunu birkaç kez ters, sonra 4 saat çıkarma döneminde art arda çalkalayın. Not: Bu süre içinde, su, MeOH ile birleştirilir ve elde edilen MeOH: su fazı DCM fazı ayrılır. doku alternatif olarak DCM ile MeOH maruz: su bir emülsiyon halinde tüpleri çalkalanır gibidir.
  4. Yuvarlak tabanlı bir şişeye DCM özü aktarın ve düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde kuruluğa kadar buharlaşmasına (<40 ° C). En az bir çözücü kullanılarak, bir 20 mL sintilasyon şişesine kurutularak özü aktarın. Bir döner buharlaştırıcı adaptörü ile şişe yerleştirin ve daha düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde kuruluğa kadar buharlaşmasına (<40 ° C).
    Not: (1) somun (2) yıkayıcı ve (3) palamut somun: Bir sonraki adım, bir dişli çubuğun ucuna sırayla aşağıdaki öğeleri vidalanarak monte edilebilir bir ev yapımı sıkıştırma aracının kullanılmasını gerektirmektedir. yıkayıcı ya delikli olmalı veyabir 50 ml santrifüj tüpüne iç çapından daha küçük olacak şekilde donatılmış olabilir.
  5. Doku ve MeOH içeren mezun santrifüj tüpüne dönersek: Su özü, sıkıştırma yoluyla doku dışarı çıkarma orta sıkmak. MeOH transfer: Aynı yuvarlak dipli bir şişeye su ekstraktı ve soğutulmuş depolamak (<10 ° C).
  6. Su ekstraktı: daha sonra, yeni MeOH MeOH ihtiva eden soğutulmuş yuvarlak dipli bir şişeye özü transferi, hemen susuz doku 2-6 saat bir süre için bir ikinci çıkarma için batık kadar dereceli santrifüj tüpüne MeOH ekleyin. Doku tam ekstre edilmediğini herhangi bir endişe varsa, 2 saat 6 MeOH çıkarma tekrarlayın.
  7. Düşük bir ısı kullanılarak bir döner buharlaştırıcı üzerinde MeOH kurutun (<40 ° C). Yuvarlak tabanlı bir şişeye yıkamak için MeOH, minimal hacim ile yıkandı, kurutuldu polar olmayan özü ihtiva eden sintilasyon şişesine yuvarlak dipli bir şişede kalan Sulu ekstraktı aktarın.
  8. Ebir vakum yoğunlaştırıcısı düşük ısı (<40 ° C) kullanılarak kuruyana dek Sulu ekstraktı Vaporate. sintilasyon şişesi hemen doku içinde 10 ml toplam kuru ham organik özü içerir. , Oksidasyonunu önlemek için N2 gazı ile şişenin üst boşluğunu tahliye sıkı bir şekilde yapışması ve depolamak dondurulmuş (-20 ° C).

2) Gıda Hazırlama

  1. Dondurularak kurutulmuş kalamar manto tozu hazırlayın.
    Not: Squid manto diğer bentik omurgasız ile karşılaştırılabilir, ve 2.2 aşağıdaki alt-etapları bir terkip maddesi olarak kullanılacak olan bir beslenme kaynağı içerir.
    1. Sıcak deiyonize (DI) su kalamar mantonun çözülme dondurulmuş halkaları, daha sonra yüksek hızlı karıştırıcı onları püresi.
    2. Sığ çerez levha ve dondurularak (-20 ° C) üzerine püre kalamar manto ince bir tabaka dökün, daha sonra küçük parçalar halinde liyofilize edilecek dondurulmuş kalamar püresi sayfasını kırmak.
    3. Fr işletim prosedürleri takip dondurulmuş kalamar manto püresi lyophilizeeeze-kurutucu.
    4. Bir toz oluşturmak üzere yüksek hızlı bir karıştırıcı içinde kalamar manto püresi liyofilize parçaları toz haline.
    5. Bir çeker ocak içinde, bir döner un elek toz halinde kalamar manto dökün ve ince ebatlı tozun bir doku büyük boyutta ayrı eleyin.
    6. Bir yapışmalı kaba ince toz kalamar manto aktarın. Oksitlenmesini önlemek ve dondurulmuş depolama N2 gazı ile kap üst boşluğunu tahliye (-20 ° C).
  2. Gıda karışımı hazırlayın.
    Not: Gerekirse birden fazla ardışık deneyleri çalıştırırken, o ~ gıda karışımı 100 ml hazırlamak için pratik, ancak bu tarifi daha küçük birimlere ölçekli olabilir.
    1. 150 ml'lik bir cam kap içinde, 3 g alginik asit ve Dİ su, 100 ml 5 g dondurulup kurutulmuş kalamar manto bir toz karışımını bir araya getirin. Toz tamamen hidratlanmış ve karışım homojen olana kadar bir kaç dakika için bir microspatula ile kuvvetli bir şekilde karıştırın.
      Arzu edildiği takdirde, gıda boyası bu st ilave edilebilir: Notep: daha ziyade ekleyerek özü ile tedavi edilen karışımın rengi maç çalışırken daha (özü ile tedavi edilen karışımda özü doğal pigment maskeleme) hem tedavi ve kontrol karışımları üretecek gıda karışıma boya eklemek için kolay Kontrol karışımına boya. Yeşilimtırak veya kahverengimsi gıda boyası ham ekstre herhangi bir pigment maskelemek için genellikle arzu edilir.
    2. Bir dereceli enjektöre gıda karışımı tam 10 ml yükleyin. Bu işlem sırasında hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için dikkat edin.
    3. Dondurucu kuru ham organik ekstre 20 ml sintilasyon flakonu çıkarın. Bir damla ekleme veya MeOH iki, daha sonra bir microspatula homojen bir karışım halinde özü karıştırın.
    4. 20 mi sintilasyon şişesine içine gıda matris yüklenen 10 ml şırınga çıkarma ve ekstre ile muamele edilmiş gıda karışımı homojenleştirmek için bir microspatula ile karıştırın.
      R, sonra bu küçük artışlarla (yani şırıngayı çıkarmak için yardımcı olabilir 2 ml çıkarmak ve homojenize:. Not10 ml kadar EPEAT) homojenize edilmiştir.
  3. Tahlil pelet hazırlayın.
    1. Bir şırınga içine ekstre karışımı (~ 1 mi) içindeki bir çok küçük bir hacim yük ve 0.25 M CaCI2 çözeltisi içinde bir şırınga ucunu daldırın. Uzun, spagetti benzeri lifi oluşturmak üzere şırınga içeriğini çıkarın.
    2. Birkaç dakika sonra, daha sonra, bir jilet ile bir cam kesme tahtası üzerinde 4 mm uzunluğunda pelet içine doğrayın, sertleştirilmiş iplikçik kaldırmak deniz suyu ile durulayın.
    3. Tekrar kontrol pelet yapma doku özü dahil edilmeden 2.3.1 ve 2.3.2 adımları. Çözücü, eşdeğer hacimde kontrol pelet tedavisi için emin olun çözücü ilave kontrol etmek için (adım 2.2.3 tedavi karışımına MeOH ilave bakınız). Negatif kontrol, bu deney, balık besleme vazgeçirtecek teyid 2 mg ml bir konsantrasyonda denatonyum benzoat ilave -1 işlenmemiş gıda karışımına 27 isteniyorsa.

3) LezzetBiyoanalizler

  1. Vahşi yakalanmış sarı-fazlı bluehead wrasse, Thalassoma bifasciatum ile beslenme deneyleri gerçekleştirmek, laboratuvar akvaryumlarda opak taraflı bölümlerinde üçlü gruplar halinde tutulur.
  2. Bir lastik ampul ile bir cam pipet kullanarak deniz suyu bir bardağa gıda pelet sunun. Not: Bu şekilde yiyecek almak için balık yetiştirmek için birkaç gün sürebilir. Gıda teslim önündeki bir klima uyaran (akvaryum camına pipet gibi birkaç musluklar) gıda pelet eklenmesini beklemek balık yetiştirmek için yararlı olabilir.
  3. Pelet Puanlama. Kolayca balık tarafından tüketilen eğer bir pelet kabul düşünün. Onların ağız boşluğuna almak için bir veya daha fazla balık üç girişimleri en az sonra yenen değilse bir pelet reddetti düşünün, pelet yaklaştı ve böyle bir denemeden sonra göz ardı edilir ya da eğer.
  4. Skor örnekleri. Not: Tahlil prosedürü Şekil 1'de bir akış şeması olarak tasvir edilir yemek reddediyorum balık Grupları.protokolünde herhangi bir aşamada kontrol pelet daha kabul edilmez. Tahlil tek bir vadede iki potansiyel sonuçları vardır: Örnek kabul veya red edilir ya.
    1. Balık grubu kooperatif olduğunu doğrulamak için bir kontrol pelet ile başlayın. Tedavi edilen bir pelet teklif. Balık tedavi pelet kabul ederseniz kabul edilen, örnek puan. Balık tedavi pelet reddederseniz, balık besleme durdurdu olup olmadığını belirlemek için bir sonraki kontrol pelet sunuyoruz. Balık sonraki kontrol pelet kabul ederseniz reddedilmiş gibi, örnek puan.
  5. Çoğaltma. Her ekstresi için balık on bağımsız gruplar ile tahlil işlemi tekrarlayın.

4) değerlendirilmesi Önemi

  1. Fisher testi 26 değiştirilmiş bir versiyonu ile tedavi pelet vs kontrol tüketimi farklılıkların önemini değerlendirir. Kontrolü için marjinal toplamları ve tedavi pelet sabit böylece testi değiştirinOnlara hem de rastgele örnekler tedavi. Not: Bu p = 0.057 sağlar 7 pelet yemiş zaman; 7 veya daha fazla pelet yenir eğer dolayısıyla, herhangi bir özü 6 veya daha az pelet yenir eğer caydırıcı kabul ve lezzetli olduğunu.
  2. Ekstrelerinin gruplar arasında nispi lezzetini karşılaştırmak için, her grup içinde yenen pelet ortalama sayısını hesaplamak. Pelet ortalama sayısı + yenirse o kadar çoğaltmak özler bir grup caydırıcı olarak kabul edilir 6 pelet eşiği tutun standart hata (SE) ≤6. Not: temsilcisi sonuçları, grup atama türdür, yani çoğaltmak özler farklı bireylerden gelen ve göreli lezzet türler arasında karşılaştırılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada ortak Karayip sünger altı türün (Şekil 2) Bu biyoassay sonuçlarını rapor. Bu veriler başlangıçta Pawlik ark. 12 tarafından 1995 yılında yayınlanan ve ortak meydana takson arasında kimyasal savunma stratejileri farklılıkları araştırmak için bu yaklaşımın gücünü göstermek edildi. Sonuçlar standart hata (SE) her tür için + yemiş gıda pelet ortalama sayısı olarak rapor edilmiştir. Hemen hemen hiç peletler Agelas clathrodes, Amphimedon compressa ve Aplysina cauliformis ham organik ekstraktlar deneylerde yenilmiştir. Buna karşılık, Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa ve Mycale laevis'ten özleri ile yapılan topaklar kolayca tahlil 12 tüketilen bulundu. En az altı pelet ilk üç tür için yemiş, bu yüzden onlar üzerinde önemli caydırıcı edildi. Buna karşılık, ikinci üç tür kontrollerden anlamlı farklı değildi, ve vardılezzetli kabul.

Şekil 1,
Şekil 1:. Tahlil prosedürünün şematik bütün aşamalarında, bir kontrol pelet reddi tahlil balık bu seti yapmayan veya tok ve daha fazla kullanılamaz gösterir. protokol tedavi pelet ardından balık bir kontrol pelet her kümesi sunarak başlar. Kabul edilen Sonraki tedavi pelet kabul edilirse örnek atılırsa. Tedavi pelet reddedilir ancak sonraki kontrol pelet kabul edilirse reddedilmiş gibi, örnek atılırsa.

Şekil 2,
Şekil 2: Gıda pelet Thalassoma bifasciatum tarafından Tüketim ilk Pawlik tarafından 1995 yılında bildirilen doğal konsantrasyonlarda sünger ham organik özler içeren (SE + ortalama) 12 Balık tüm durumlarda 10 kontrol pelet tüketilen. Her tür adından sonra, çoğaltmak numune sayısı (her sünger doku coğrafi ayrı numunenin ayrı çıkarılmasından çoğaltmak) belirtilir. Grafikteki noktalı çizgi ile gösterildiği gibi, herhangi bir birey tahlili için, ekstreler yemiş pelet sayısı daha az ya da 6 eşit ise (p = 0.057, Fisher kesinlik testi değiştirilmiş) caydırıcı kabul edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada tarif edilen prosedür, deniz organizmalarında antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için nispeten basit ve ekolojik olarak uygun laboratuar protokolü sağlar. Burada yöntemler bu set ile memnun olan önemli kriterleri gözden:

(1) Uygun yırtıcı. Bu beslenme deneyi bluehead akya, Thalassoma bifasciatum, Karayipler genelinde mercan resifleri üzerinde en bol balıklar birini kullanır. bluehead bentik omurgasızlar 19 geniş bir ürün yelpazesine örnek bilinen bir kültürlü etobur olduğunu. Genelci yırtıcı resifleri üzerinde yırtıcı balıkların çoğunluğu pratisyen çünkü bu ilk tahliller için en iyi seçimdir, ve savunma aşmak için mekanizmalar evrimleşmiş olabilir uzman predatör aksine antipredatory savunmalar geniş, onlara karşı yönlendirilmiş olacağını beklenir. Tek bir potansiyel yırtıcı kullanılarak kimyasal savunma laboratuvar araştırmaları vardırOn saha koşullarında 28-33 potansiyel yırtıcı tam bir tamamlayıcı yanıtları güveniyor fazla zaman alıcı ve karmaşık alan deneyleri izledi.

(2) ekstraksiyon prosedürü., Eşit parça diklorometan (DKM) ve metanol (MeOH), bir çözücü madde karışımı kullanılır hızla membranlar çözündürücü ve hücresel malzemenin suyunun sıkılması, doku nüfuz ilk doku çıkarma aşaması. Doku Bu adımdan sonra susuz olduğunu, bu nedenle sonraki adımlar MeOH tüm kutupları kalan metabolitleri ayıklamak. Tam ekstre edilir doku kapsamlı bir ekstraksiyon prosedürü teşkil kadar MeOH çıkarma tekrarlamak. Bu ekstre düzeni küçük varyasyonlar, örneğin, aynı polaritede bir başka için, bir özütleme çözücüsü ikame olarak kabul edilebilir, ancak uygun olmayan bir çözücü kullanıldığı takdirde, doku çıkarma eksik olabilir. Yanlış doku çıkarma prosedürlerinin potansiyel tuzaklar başka ayrıntılı olarak ele alınmıştır <sup> 8.

(3) Deneysel gıda hazırlanması. Yapay gıda matris besin kalitesi ve ikincil metabolitlerin konsantrasyonu hem de hedef organizmanın doku taklit gerekir. Bu yırtıcı besleme-caydırıcı metabolitleri reddetmek için kullandığınız aynı duyusal süreçler de gıdaların besin kalitesi algılamasında rol olasıdır. Düşük besin kalitesi ile Gıdalar kimyasal savunma çok daha düşük seviyelerde reddedilebilir ve bu metabolitler dokuya göre daha besleyici bir yapay gıda sunulmaktadır eğer tersine, sekonder metabolitler, sadece daha yüksek doğal konsantrasyonlarda caydırıcı olabilir hangi Bu elde edilmiştir. Ölçmek kolay, hazır, çünkü Toz, dondurularak kurutulmuş kalamar manto yararlı bir besin yerini tutamaz, ve besin özellikleri zaten 34 tespit edilmiştir.

hazırlanmasındaki ikinci husus Deneysel Gıda hacmi değil, kitle bazında yapılmalıdır özü konsantrasyonu, belirlenmesini ilgilidir. Predators ıslak mendil yemek ve deniz organizmalarının dokular su içeriği büyük ölçüde değişmektedir. Bir avcı açısından bakıldığında, bir denizanası ya da deniz anemon bir lokma, bir kalamar ya da deniz salyangozu aynı büyüklükte ısırık daha birim kuru kütle başına önemli ölçüde daha fazla su ihtiva edecektir. Yüksek hidratlı dokuları, birim kuru kütle başına metabolitin konsantrasyonu birim hacmi başına çok daha yüksek olduğu, ancak hacim (sokması) ekolojik açıdan uygun bir ölçüsüdür. Ayrıca, deniz organizmalarının dokular nedeniyle maden iskelet elemanlarının çok farklı yoğunluklarına sahip olabilir. Hacimce metabolit konsantrasyonunun belirlenmesi hem sorunları çözer ve potansiyel avcı tarafından dokusunun tüketimi açısından en uygun ölçüdür. Literatürden örnekler de dahil olmak üzere bu konu, detaylı başka 8 tartışılmıştır.

.. İçerik "> (4) Deneysel tasarım ve istatistiksel bir yaklaşım uygun deneysel tasarım ve verilerin istatistiksel analizleri, deneysel sonuçların farklılıkların önemini belirleyen içerir başka bir bilimsel araştırma gibi davranışsal tahliller için önemli olan burada açıklanan analiz basit: farklılıklar modifiye kontenjan tablosu ile belirlenir. yöntem tüm kontrol gıda teklifleri araştırmacı kontrol gıdalar 8 beslenen değil, deneysel yırtıcı kullanarak olmaz çünkü tüketilen gerektirir. Fisher'in kesin testi kullanımı ilk değiştirilmiş olmasına rağmen Pawlik tarafından kullanımı ve ark. 12, yemiş 6 tedavi pelet eşik değeri değişmeden kalır. Yıllar geçtikçe, diğer istatistiksel testler ikame olarak önerilen, ancak işbirlikçi James E. Blum (Matematik ve İstatistik Bölümü UNCW ile görüştükten sonra iptal edildi ). Örneğin, McNemar testi öne sürülmüştür,bu verilerin bir eşleştirilmiş dizi yoksun, ve acil tablonun bir satır 10 kontrol pelet sabit çünkü yemiş hem çünkü, uygun değildir.

Bu deney yöntemi oldukça net sonuçlar sağlar bizim deneyim rağmen, yine de bir davranış tepkisi üzerine dayanır. Balık analizden önce bir süre aç bırakıldı, bunlar daha çok muamele edilmiş peletler balık savunma metabolit aktivitesi yakın bir eşik konsantrasyonu tedavi edilen gıda pelet içinde mevcut olan, özellikle çok iyi beslenen halinde elde edileceğinden daha harcayabilir. Bu nedenlerden dolayı, besleme deneylerin sonuçları aşırı yorumlanmamalıdır. Örneğin, yemiş 1/10 9/10 vs pelet iki doku örneklerinin arasında bir fark ilk örnek caydırıcı ve ikinci değil, ancak yemiş 3/10 5/10 vs pelet fark davranışsal değişim nedeniyle olabilir gösterir deneyleri, ilk numune arasındaki mutlaka saniyeden daha fazla caydırıcı değil.

Önemli bir ApplicatBu biyo-deney iyon ham ekstre ardışık bölümler besleme-caydırıcı aktivitesi 29,32-33,35-38 sorumlu olan kimyasal bileşikleri izole etmek için balık test edilir, böylece biyo-deney kılavuzlu fraksiyonasyon bölgesi kullanımıdır. Bir kimyasal savunma varlığı tespit edildikten sonra, ham organik özüt kromatografik karışımı oluşturan bileşiklerin küçük alt-grup halinde parçalandı ve bu alt-gruplar aynı besleme deneyinde balık beslenir. Yine, bu doku özü ziyade kitlesel eşdeğer "ml'lik eşdeğer" seçeneğini kullanarak, bir hacimsel olarak yapılmalıdır. 4 × 2 × ve 1 ×: ayırma ilerledikçe, kesirler en iyi doğal hacimsel konsantrasyonuna bir seri seyreltme göreceli olarak analiz edilir. Konsantrasyonlarının, açıklık dikkate iki veya daha fazla kromatografik fraksiyonları üzerinde ya da aktif metabolitler kaybı Throu aktif metabolitleri bölme gelen caydırıcı aktivitesinde olası bir azalma alırgh ayrışma, reaksiyon, veya ek medya kromatografik. Aktif metabolitler bioassay-güdümlü fraksiyonlaşması ile izole edildikten sonra, araştırmacı, standart spektroskopik teknikleri kullanarak bunları tespit edebilir ve aynı zamanda ikincil metabolitleri olabilir inaktif kesirler için aynı şeyi yapmalı. Bu 8 değil hangi metabolitleri bilmek gibi ekolojik ilgili deneylerde aktif ikincil metabolitler hangi bilmek aynı derecede önemlidir.

Bu prosedürün elemanları yeni deneysel teknikler tasarlamak için de kullanılabilir. Örneğin, bu biyoanaliz (örn yapısal savunmaları 31,34,42 ve aposematism 27), diğer coğrafi bölgelere 41, (örneğin 39 ve 40 Seastars yengeçler) omurgasız yırtıcılar için uyarlandı, ve hatta diğer araştırma soruları için. Dört kriter bu yöntemin gelecekte uyarlamaları için bir rehber olarak hizmet etmelidir. Özet olarak, bu biyodeney prosedürü PRdeniz organizmalarının dokulardan antipredatory kimyasal savunma değerlendirmek için daha ekolojik ilgili yöntem ovides. Bu yordamı kullanarak çalışmalar Karayip mercan resifleri (örneğin en son, Loh ve Pawlik 26) farmakoloji, biyoteknoloji dahil olmak üzere soruşturma çeşitli alanlarda, ve bilgilendirebilir araştırmalar ve üzerine dağılımını ve deniz omurgasız bereket kontrol faktörleri anlayışımızı gelişmiş evrimsel ekoloji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
  2. Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93, (5), 1911 (1993).
  3. Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44, (5), 476-476 (1996).
  4. McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
  5. Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. Springer. New York. (2008).
  6. Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
  7. Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61, (11), 888 (2011).
  8. Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. 677-710 (2012).
  9. Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
  10. Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
  11. Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
  12. Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
  13. Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
  14. Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
  15. Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
  16. Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
  17. Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
  18. Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
  19. Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
  20. O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
  21. Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159, (2), 389-398 (2012).
  22. Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45, (2), 352-358 (2005).
  23. Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
  24. Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401, (1-2), 80-84 (2011).
  25. Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8, (5), e62573 (2013).
  26. Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
  27. Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
  28. Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
  29. Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
  30. Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
  31. Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107, (2), 225-231 (1996).
  32. Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208, (1-2), 185-196 (1997).
  33. Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25, (12), 2811-2823 (1999).
  34. Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127, (1), 195-211 (1995).
  35. Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58, (5), 647-652 (1995).
  36. Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
  37. Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15, (4), 275-285 (2001).
  38. Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28, (6), 1103-1115 (2002).
  39. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
  40. Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
  41. Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
  42. Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322, (1), 67 (2005).
Bir Balık-besleme Laboratuvar biyodeneyinde Deniz Organizmaların Dokular Sekonder Metabolitlerin Antipredatory Aktivite değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter