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Environment

EPA विधि 1615. Enterovirus और संस्कृति और RT-qPCR द्वारा पानी में Norovirus घटना के मापन। द्वितीय। कुल कृषि योग्य वायरस परख

Published: September 11, 2016 doi: 10.3791/52437
Automatic Translation
1, 1
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency

Introduction

आंतों का वायरस वायरस है कि मानव आंत्र प्रणाली को संक्रमित और जो मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं की एक विविध समूह हैं। ये वायरस मलजल उपचार संयंत्र और सेप्टिक टैंक अपशिष्ट, अनुचित तरीके से बनाया गया है या टूट सेप्टिक टैंक, टूटे सीवर लाइनों, संयुक्त सीवर ओवरफ्लो, और अन्य बिंदु और गैर-बिंदु स्रोतों 1-4 के माध्यम से सतह और भूमिगत जल में प्रवेश। जलजनित वायरस से मानव में संक्रमण और बीमारी दूषित या अपर्याप्त कीटाणुरहित पानी की खपत के माध्यम से या मनोरंजन पानी संपर्क के माध्यम से होते हैं। रोग के लक्षण गंभीर आंत्रशोथ को हल्के शामिल हो सकता है; आँख आना; बुखार; ऊपरी श्वसन संकट; हाथ पैर और मुंह की बीमारी; मायोकार्डिटिस; सड़न रोकनेवाला मैनिंजाइटिस; इन्सेफेलाइटिस; पक्षाघात; पूति 5-8, और मौत 9,10।

USEPA विधि 1615 पर्यावरण और पीने के पानी में संक्रामक आंतों का वायरस कणों को मापने के लिए एक प्रक्रिया है। ये पानी एक में हो सकते हैंसंक्रामक और गैर-संक्रामक virions का मिश्रण है, लेकिन केवल संक्रामक कणों एक संभावित स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा कर। संक्रामक वायरस कणों किसी भी कीटाणुनाशक है कि वर्तमान 11-13 हो सकता है के कारण प्रोटीन capsid अखंडता, सूरज की रोशनी से पराबैंगनी विकिरण, और नुकसान की वजह से न्यूक्लिक एसिड को होने वाले नुकसान के नुकसान से पर्यावरण और पीने के पानी में समय के साथ संक्रामकता खो देते हैं। कुल कृषि योग्य वायरस विधि में प्रदान की प्रक्रिया भैंस के ग्रीन बंदर गुर्दा (बीजीएम) सेल लाइन में cytopathic प्रभाव (सीपीई) के उत्पादन पर आधारित है। यह सेल लाइन पर्यावरण विषाणु विज्ञान क्षेत्र 14,15 में इसकी व्यापक उपयोग के कारण चुना गया था, फिर भी पता लगाया संक्रामक वायरस प्रकार की सीमा निश्चित enteroviruses से 15 मुख्य रूप से प्रतिबंधित कर रहे हैं। इस पत्र का उद्देश्य पांच इंच विद्युत धन कारतूस फिल्टर का क्षालन, माध्यमिक एकाग्रता, और कुल कृषि योग्य वायरस की माप के लिए विधि 1615 की प्रक्रियाओं का वर्णन है। का मूल्यांकनसमग्र विधि Cashdollar एट अल। 16 में वर्णित है।

Protocol

नोट: कृपया परिभाषाएँ की एक सूची को देखने के लिए पूरक सामग्री अनुभाग एस 1। USEPA विधि 1615 के साथ जुड़े क्यूए प्रक्रियाओं पूरक सामग्री अनुभाग S2 में वर्णित हैं।

1. फिल्टर क्षालन प्रक्रिया

  1. सबसे पहले क्षालन
    1. बफर 1.5% गोमांस निकालने, पीएच 9.0 की 500 मिलीलीटर की जगह, एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर में कमरे के तापमान पर गरम। फिल्टर कारतूस आवास खोलने और पूरी तरह से विद्युत धन फिल्टर कवर करने के लिए गोमांस निकालने के लिए पर्याप्त मात्रा में जोड़ें। फिल्टर आवास ढक्कन बदलें और एक बाँझ बीकर में शेष गोमांस निकालने डालना।
    2. संपर्क समय के 1 मिनट के बाद, कि बाँझ बीकर में शेष धीरे-धीरे फिल्टर के माध्यम से एक दबाव कंटेनर या क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग के साथ-साथ आवास में गोमांस निकालने समाधान गुजरती हैं। एक एल 2 गिलास बीकर में eluate लीजिए।
  2. दूसरा क्षालन
    1. दोहराएँ बफर 1.5% गोमांस निकालने के लिए एक अतिरिक्त 500 मिलीलीटर का उपयोग कर 1.1 कदम, लेकिन 15 मिनट के लिए कदम 1.1.2 पर संपर्क समय वृद्धि हुई है।
    2. 2 एल पहले क्षालन से युक्त है कि बीकर दूसरे क्षालन से गोमांस निकालने जोड़ें। बीकर के लिए एक बाँझ हलचल बार जोड़ें।

2. कार्बनिक Flocculation एकाग्रता प्रक्रिया

  1. कम से कम 5 मिनट के लिए 0.525% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ एक संयोजन प्रकार पीएच इलेक्ट्रोड जीवाणुरहित। साथ बाँझ DH 2 हे इलेक्ट्रोड कुल्ला और फिर 0.05 एम सोडियम thiosulfate साथ dechlorinate। पीएच 4 और 7 मानकों का प्रयोग पीएच मीटर जांचना।
  2. एक हलचल प्लेट पर eluate युक्त बीकर रखें। प्लेट पर मुड़ें और सरगर्मी गति को बढ़ाने के लिए जब तक एक भंवर का गठन किया है।
  3. धीरे-धीरे eluate 1.2 एम एचसीएल की बूंद बुद्धिमान अलावा द्वारा 3.5 ± 0.1 eluate का पीएच को समायोजित करें। एचसीएल बूंद के लिहाज से जोड़े क्योंकि तेजी से इसके वायरस को निष्क्रिय करेगा। के रूप में एक वेग फार्म शुरू होता है इस समय के दौरान eluate बादल बन जाएगा।
  4. मिश्रण spe में कमीएक धीमी गति से हलचल करने के लिए प्रवर्तन निदेशालय और फिर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नजर रखने और 3.5 ± 0.1 पर eluate के पीएच बनाए रखने के लिए जारी है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2500 XG पर 15 मिनट के लिए एक या एक से अधिक सेंट्रीफ्यूज की बोतलों में उपजी गोमांस निकालने निलंबन और सेंट्रीफ्यूज डालो। सेंट्रीफ्यूज और या तो महाप्राण से बोतलों निकालें या धीरे-धीरे pelleted वेग के नुकसान को रोकने के लिए सतह पर तैरनेवाला छानना। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    ध्यान दें: मात्रा और वेग की गुणवत्ता में गोमांस निकालने बहुत सारे के बीच काफी भिन्नता हो सकता है। वेग कुछ बहुत से उत्पादित जल्दी भंग हो जाएगा, जबकि यह है कि अन्य बहुत से मुश्किल से हो जाती है।
  6. वेग से युक्त सेंट्रीफ्यूज की बोतल के लिए 0.15 मीटर सोडियम फास्फेट के 30 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. 0.15 मीटर सोडियम फास्फेट, मांस निकालने बहुत सारे है कि 5 मिनट के भीतर भंग से अवक्षेप के लिए 9.0 पीएच का प्रयोग करें। 10 मिनट के लिए हिलाओ के बाद वेग पूरी तरह से भंग कर रहा है, और फिर तुरंत जाना 2.7 कदम।
    2. अन्य सभी अवक्षेप के लिए 0.15 मीटर सोडियम फास्फेट, पीएच 7.0-7.5 का प्रयोग करें। 10-15 मिनट के लिए हिलाओ भंग करने के लिए, या अधिक मुश्किल अवक्षेप के लिए, उन्हें एक विंदुक के साथ सरगर्मी के दौरान, एक बाँझ रंग के साथ ब्रेक-अप को बार-बार समाधान ऊपर और नीचे ड्राइंग द्वारा एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 160 rpm पर वेग झटकों से, या इन प्रक्रियाओं के संयोजन के द्वारा।
      नोट: एक से अधिक सेंट्रीफ्यूज बोतल का उपयोग कर, सोडियम फास्फेट के कम से कम 30 मिलीलीटर का उपयोग कर अवक्षेप गठबंधन और फिर एक बोतल या बीकर में अवक्षेप संयोजन के बाद बोतलों कुल्ला करने के लिए 30 मिलीलीटर का शेष भाग का उपयोग करें।
    3. संयुक्त वेग एक फ्लैट नीचे सेंट्रीफ्यूज बोतल में है, तो बोतल के लिए एक हलचल बार जोड़ें। 2.6.5 चरण पर जाएँ।
    4. संयुक्त वेग एक शंक्वाकार नीचे के साथ एक अपकेंद्रित्र बोतल में है, तो यह एक छोटा गिलास बीकर में हस्तांतरण और बीकर एक हलचल बार जोड़ें।
    5. बोतल या बीकर एक चुंबकीय उत्तेजक पर रखें, और जनसंपर्क जब तक हलचलecipitate पूरी तरह से भंग कर दिया है।
    6. 0.525% सोडियम हाइपोक्लोराइट के साथ एक संयोजन प्रकार पीएच इलेक्ट्रोड पुन बाँझ और कदम 2.1 में वर्णित के रूप में 0.05 एम सोडियम thiosulfate साथ dechlorinate। पीएच 7 और 10 मानकों का प्रयोग पीएच मीटर जांचना। धीरे धीरे 1 एम NaOH के साथ 9.0 करने के लिए पूरी तरह से भंग वेग की पीएच को समायोजित और फिर 10 मिनट के लिए हलचल।
  7. हलचल बार निकालें और 4,000-10,000 XG और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए भंग वेग अपकेंद्रित्र।
  8. ध्यान से गोली परेशान बिना एक गिलास बीकर में सतह पर तैरनेवाला डालना। बीकर एक हलचल बार जोड़ें और गोली त्यागें।
  9. एक चुंबकीय उत्तेजक पर बीकर प्लेस, और समाधान हलचल। 1.2 एम एचसीएल बूंद 7.0-7.5 पीएच को समायोजित करने के लिए बुद्धिमान जोड़ें।
  10. फ़िल्टर एक स्टरलाइज़ फिल्टर एक prefilter कि 1.5% गोमांस निकालने की 15 मिलीलीटर, 0.05 एम ग्लाइसिन, पीएच 7.0-7.5 के साथ pretreated किया गया है जिसमें माध्यम से पारित होने से सतह पर तैरनेवाला बाँझ।
  11. परख नमूना Volumई (एस) गणना:
    1. का प्रयोग करें 1 समीकरण लैब गढ़वाले खाली और प्रयोगशाला अभिकर्मक खाली छोड़कर सभी नमूने परीक्षण के लिए एस गणना करने के लिए,
      1 समीकरण 1 समीकरण
      जहां डी (यत्न मूल पानी नमूने की मात्रा) भूजल के लिए 500 एल है, TSV (कुल नमूना मात्रा) क्षेत्र नमूना 5 इंच विद्युत धन कारतूस प्रयोगशाला द्वारा प्राप्त फिल्टर के माध्यम से पारित कर दिया की मात्रा है, और FCSV (अंतिम केंद्रित नमूना मात्रा) मात्रा 2.10 कदम में निस्पंदन पीछा कर रहा है। एक उदाहरण के पूरक सामग्री धारा S4.1 में दिखाया गया है।
    2. और प्रयोगशाला अभिकर्मक खाली (LRB, यानी, एक नकारात्मक गुणवत्ता अभिकर्मक ग्रेड पानी का उपयोग नियंत्रण) 0.3 से गुणा करके FCSV; लैब गढ़वाले खाली (यानी, एक सकारात्मक गुणवत्ता वरीयता प्राप्त अभिकर्मक ग्रेड पानी का उपयोग नियंत्रण LFB) के लिए एस गणना।
  12. thre में FCSV फूट डालोई subsamples।
    1. एक मात्रा 1.04 गुना परख नमूना मात्रा के बराबर के साथ subsamples 1 और 2 को तैयार है। ; पर या नीचे -70 डिग्री सेल्सियस वे कुल कृषि योग्य वायरस परख (subsample 1, चरण 4) का उपयोग विश्लेषण नहीं किया जा सकता या 24 घंटा के भीतर आणविक assays (नहीं दिखाया गया है) के लिए कार्रवाई की है कि अगर इन subsamples रुक अन्यथा, 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    2. पर या नीचे शेष मात्रा (subsample 3) रुक -70 डिग्री सेल्सियस।
  13. 10 से एस विभाजित करके Inoculum मात्रा की गणना।

3. कुल कृषि योग्य वायरस Quantal परख

नोट: सभी कदम हमेशा समाधान सेल monolayer परेशान करने से बचने के लिए सावधानी से जोड़ें।

  1. छानना या परीक्षण 3-6 दिनों के बाद बंटवारे पर बीजीएम कोशिकाओं की एक monolayer युक्त वाहिकाओं से महाप्राण मीडिया और फिर हटा मीडिया के बराबर संतुलित नमक समाधान की एक मात्रा में जोड़ें।
  2. छानना या सेल संस्कृति ते से संतुलित नमक समाधान निकालनासेंट जहाजों इस्तेमाल किया जा रहा है और फिर सेल संस्कृति परीक्षण वाहिकाओं टीका लगाना
    1. Subsample 1 कुल कृषि योग्य वायरस quantal परख नियंत्रण (पूरक सामग्री अनुभाग S2.4) के साथ Inoculum मात्रा के बराबर की मात्रा के साथ प्रत्येक परीक्षण के नमूने के लिए 10 परीक्षा वाहिकाओं टीका लगाना।
    2. (LFSM, यानी, वरीयता प्राप्त पानी मैट्रिक्स नमूना) LFB और लैब दृढ़ नमूना मैट्रिक्स के लिए, 5, 25, और 125 गुना dilutions एक मंदक के रूप में subsample 3 और 0.15 मीटर सोडियम फास्फेट, पीएच 7.0-7.5 का उपयोग कर तैयार करते हैं। dilutions बनाने के लिए एक प्रक्रिया का एक उदाहरण पूरक सामग्री अनुभाग S3 में दी गई है। प्रत्येक कमजोर पड़ने वाहिकाओं चरण 3.2.1 में undiluted subsample 1 के साथ टीका के अलावा प्रत्येक परीक्षा पोत पर एक inoculum मात्रा का उपयोग श्रृंखला के लिए 10 धोया सेल संस्कृति परीक्षण वाहिकाओं टीका लगाना।
    3. चरण 3.2.1 (चरण 3.2.2 में टीका के अलावा अन्य) से किसी भी परीक्षण नमूना ऊष्मायन के 14 दिनों के बाद सभी 10 प्रतिकृति में सीपीई है कि के लिए (देखें चरण 3.3), पूर्वछाँटना subsample 3 में से 5, 25, और 125-, और 625 गुना dilutions टीका लगाना 10 प्रत्येक कमजोर पड़ने की कुल कृषि योग्य वायरस quantal का एक नया सेट के साथ-साथ प्रत्येक परीक्षा पोत पर एक inoculum मात्रा का उपयोग श्रृंखला के लिए सेल संस्कृति परीक्षण वाहिकाओं धोया परख नियंत्रण (पूरक सामग्री अनुभाग S2.4)।
    4. जहाजों के आगे और पीछे झुकने से सेल monolayers की सतह पर inoculum बांटो। 1-5 दोलनों / मिनट पर या जहाजों के हर 15-20 मिनट कमाल की किसी भी वायरस मौजूद कोशिकाओं को सोखना करने के लिए अनुमति देने के लिए के साथ एक यांत्रिक कमाल मंच पर 80-120 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर परीक्षण वाहिकाओं को सेते हैं।
    5. prewarmed रखरखाव मध्यम जोड़ें, और उसके बाद 36.5 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर परीक्षण वाहिकाओं सेते हैं।
  3. के लिए पहली 3 डी दैनिक एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्येक परीक्षा के बर्तन में सीपीई की उपस्थिति के लिए देखो और फिर उन्हें हर 2-3 दिनों दिन 14. स्थानांतरण करने के लिए ऊपर की जांच किसी भी परीक्षा वाहिकाओं है कि एक फ्रीजर में ≥75% सीपीई दिखाने पर सेट यानीचे -70 डिग्री सेल्सियस। पर या नीचे सभी शेष संस्कृतियों और कुल कृषि योग्य वायरस quantal परख नियंत्रण रुक -70 डिग्री सेल्सियस अंतिम दिन जहाजों की जांच के बाद।
  4. सभी संस्कृतियों गला लें और एक 0.2 माइक्रोन स्टरलाइज़ फिल्टर के माध्यम से हर सीपीई पॉजिटिव परीक्षण पोत से मध्यम के ≥15% फिल्टर। निर्दिष्ट मात्रा फिल्टर के माध्यम से clogging, सेंट्रीफ्यूज के कारण 1,500-18,000 XG पर 10 मिनट के लिए मध्यम पारित नहीं किया जा सकता और 4 डिग्री सेल्सियस छानने का काम करने से पहले।
  5. सभी 1 सेंट पारित होने के परीक्षण वाहिकाओं धोया बीजीएम परीक्षण जहाजों का उपयोग करने का एक दूसरे बीतने के प्रदर्शन करना।
    1. एक टीका मात्रा है कि सभी नकारात्मक परीक्षण वाहिकाओं से और मध्यम सकारात्मक जहाजों से फ़िल्टर से thawed माध्यम के 10% का प्रतिनिधित्व करता है के साथ नए परीक्षण वाहिकाओं टीका लगाना।
    2. दोहराएँ 3.2.4-3.4.3 कदम है, लेकिन किसी भी परीक्षा पोत है कि 2 एन डी पर 1 सेंट पारित होने पर नकारात्मक और सकारात्मक कदम 3.3 में वर्णित के रूप में था फ्रीज। एक 3 आरडी पास करउम्र केवल नकारात्मक परख नियंत्रण और सेल संस्कृतियों है कि 2 एन डी पारित होने में 1 सेंट पारित होने के दौरान नकारात्मक और सकारात्मक थे का उपयोग कर 2 एन डी पारित होने के लिए वर्णित है।
  6. वायरस सकारात्मक रूप में व्यक्तिगत परीक्षा जहाजों की पहचान जब वे दोनों 1 और 2 अंश या में सीपीई दिखाने के लिए, इस मामले में जहां सीपीई 2 एन डी पारित होने तक, दोनों में 2 एन डी और 3 मार्ग में उत्पन्न नहीं होती है।
  7. डिफ़ॉल्ट प्रोग्राम के रूप में तालिका S2 में दिखाए गए सभी नमूने परीक्षण के वायरस titers की गणना करने के लिए सेट सेटिंग्स के साथ USEPA के सबसे संभावित संख्या कैलक्यूलेटर का प्रयोग करें।
    1. इनपुट प्रत्येक परीक्षा के लिए नमूना चरण में 3.6 से वायरस को सकारात्मक दोहराने परीक्षण जहाजों की संख्या कैलकुलेटर एमपीएन / एमएल मूल्य (एम एमएल) और ऊपरी (सीएल यूएमएल) और कम (सीएल एलएमएल) 95% आत्मविश्वास सीमा / एमएल मूल्यों को निर्धारित करने में ।
    2. हेइसी परीक्षण के नमूने 2 समीकरण का उपयोग करने का एमपीएन / एल मूल्य (एम एल) btain।
      2 समीकरण 2 समीकरण
      एम एमएल 3.7 चरण में एमपीएन / एमएल मूल्य है, एस परख नमूना मात्रा है, और डी यत्न मूल पानी नमूने की मात्रा है।
    3. एम एमएल मूल्य के लिए सीएल यूएमएल मूल्य प्रतिस्थापन द्वारा ऊपरी आत्मविश्वास सीमा / एल की गणना। एम एमएल मूल्य के लिए सीएल एलएमएल मूल्य प्रतिस्थापन से कम आत्मविश्वास सीमा / एल की गणना। एक उदाहरण गणना के पूरक सामग्री धारा S4.2 में दिखाया गया है।
    4. 0 के रूप में ≤ 1 / डी की रिपोर्ट एम एमएल मूल्यों। उदाहरण के लिए, ≤ 0.002 एमपीएन / भूजल के नमूनों के लिए एल (≤ 1/500 एल)।
    5. दृढ़ प्रत्येक लैब के लिए एमपीएन और 95% आत्मविश्वास की सीमा के मूल्यों की गणना खाली और लैब पुनएजेंट पहली एस द्वारा कैलकुलेटर में प्राप्त मूल्यों / एमएल गुणा और फिर 0.3 से परिणाम को विभाजित करके खाली।

Representative Results

वायरस तीन पीने के पानी के उपचार संयंत्रों और एक निजी विद्युत धन फिल्टर अच्छी तरह से उपयोग करने का भूजल स्रोत से ध्यान केंद्रित किया गया था। दो नमूने सेट, एक क्षेत्र का नमूना और LFSM नियंत्रण से मिलकर अलग-अलग अवसरों पर उपचार संयंत्रों से एकत्र किए गए थे, और एक नमूना सेट निजी अच्छी तरह से एकत्र किया गया था। कुल मिलाकर वायरस वसूली पौधों और निजी अच्छी तरह से (एक संयंत्र और एक दूसरे से नमूना से दो नमूनों में से दो से LFSM नमूने का उपयोग निर्धारित किया गया था, क्योंकि प्रत्येक नमूने के साथ बीजक की एमपीएन मूल्य सही कारण निर्धारित नहीं किया जा सका गणना से बाहर रखा गया दोहराने बोतल के बीच असामान्य सीपीई परिणाम) करने के लिए। भूजल के नमूनों से पोलियो वायरस वसूली मतलब 79% की भिन्नता के गुणांक के साथ 58% (चित्रा 2) 16 औसत। कोई कृषि वायरस नकली गैरवरीय भूजल क्षेत्र के नमूनों में से किसी में खोजा गया था।

विधि प्रदर्शन भी उपयोग कर मापा गया था LFB रोंamples दो अलग अलग स्तरों बीज का उपयोग करके संशोधित। एक "कम" पोलियो वायरस के 300 एमपीएन की अनुमापांक 'मानक' 500 एमपीएन LFB USEPA विधि 1615. एक "" उच्च अनुमापांक में इस्तेमाल स्तर से कम के स्तर पर प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के पोलियो वायरस के 1000 एमपीएन पर प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था LFSM नियंत्रण के स्तर पर। इन नियंत्रणों 111% का एक मतलब वसूली और 100% की भिन्नता के गुणांक (चित्रा 2) के साथ इसी तरह का प्रदर्शन किया। सभी LRB नमूने नकारात्मक रहे थे और सभी LFB नमूने स्वीकृति रेंज (पूरक सामग्री तालिका एस 1) के भीतर प्रदर्शन किया।

आकृति 1
चित्रा 1. फिल्टर क्षालन। कारतूस फिल्टर क्षालन के लिए एक दबाव कंटेनर का उपयोग कर के लिए एक योजनाबद्ध दिखाया गया है। सकारात्मक हवा के दबाव कारतूस आवास चुनाव के माध्यम से दबाव कंटेनर में गोमांस निकालने समाधान पुश करने के लिए प्रयोग किया जाता हैविद्युत धन कारतूस फिल्टर taining। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, दबाव कंटेनर के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता पंप के प्रवेश के साथ कंटेनर गोमांस निकालने समाधान पकड़ में रखा जा रहा है।

चित्र 2
चित्रा 2. मतलब पोलियो वायरस रिकवरी (%) जमीन से और अभिकर्मक ग्रेड पानी। मतलब प्रतिशत वसूली जमीन से पोलियो वायरस के लिए दिखाया गया है ( चित्र तीन ; एन = 4) और अभिकर्मक ग्रेड पानी ( चित्रा 4 ; एन = 12) नमूने हैं। बारह अभिकर्मक ग्रेड पानी के नमूने छह 300 एमपीएन और छह पोलियो वायरस के 1000 एमपीएन के साथ वरीयता प्राप्त के साथ वरीयता प्राप्त शामिल थे। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Discussion

USEPA विधि 1615 अनियमित Contaminant निगरानी नियमन की तीसरी निगरानी चक्र (UCMR3) 17 के दौरान इस्तेमाल के लिए विकसित किया है और मुख्य रूप से भूजल में वायरस घटना को मापने के लिए डिजाइन किया गया था। यह सूचना संग्रह नियम (आईसीआर) विधि, 15,18 के साथ आम कदम के एक नंबर के शेयरों लेकिन दो नाबालिग मतभेद है। दोनों quantal assays का उपयोग वायरस उस पर सबसे संभावित संख्या (MPN) की गणना के आधार पर किया जा रहा quantitation साथ बीजीएम सेल monolayers पर सीपीई उत्पादन को मापने के लिए। विधि 1615 विभिन्न पानी matrices से वायरस को ध्यान केंद्रित करने के लिए एक नए विद्युत धन फिल्टर के उपयोग की अनुमति देता है और 20 से 10 दोनों मामूली परिवर्तन समग्र विधि लागत को कम करने के कमजोर पड़ने के प्रति सेल संस्कृति परीक्षण पोत की संख्या प्रतिकृति कम कर देता है। प्रतिकृति की संख्या में कमी श्रम को कम कर देता है, लेकिन एक से थोड़ा कम सीमा का पता लगाने में यह परिणाम है। हालांकि groundwaters सतह के पानी से वायरस की कम सांद्रता है की संभावना है, 19,20 वेंनमूने के ई राशि यत्न पांच बार है कि सतह के पानी की है, मतभेद के लिए भाग में प्रतिकारी। कम प्रतिकृति के उपयोग के सबसे सतह के पानी के लिए पर्याप्त होगा, लेकिन कुछ नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता होगी।

विधि 1615 में कई महत्वपूर्ण कदम और सीमाएँ हैं। बीफ अर्क बहुत से बहुत कुछ करने के लिए अलग अलग। प्रत्येक स्थल वायरस क्षालन की प्रभावशीलता और माध्यमिक एकाग्रता कदम के माध्यम से वायरस एकाग्रता के लिए क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में वर्णित पूरक सामग्री अनुभाग S2.3 है। विधि बीजीएम सेल संस्कृतियों पर टीका लगाना और वायरस titers निर्धारित करने के लिए नमूना की राशि की गणना के लिए सटीक फार्मूले का उपयोग करता है। यदि इन सूत्रों को कड़ाई से पालन नहीं कर रहे गलत परिणाम उत्पन्न हो जाएगा। उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। असंक्रमित बीजीएम सेल संस्कृति नियंत्रण है कि 14 दिन ऊष्मायन अवधि के दौरान संकट दिखाने की संभावना सेल संस्कृति रखरखाव के साथ समस्याओं का संकेत। महान देखभाल भी टा होना चाहिएकेन का टीका और सेल संस्कृति बोतल के लिए माध्यम के अलावा पार संक्रमण से बचने के साथ शामिल कदम pipetting के दौरान। गुणवत्ता के पूरक सामग्री धारा S2 में वर्णित नियंत्रण कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। धारा S2 भी गुणवत्ता के मुद्दों के लिए समस्या निवारण सलाह प्रदान करता है।

वायरस सोखना के प्राथमिक तंत्र फिल्टर विद्युत धन के लिए एक प्रभारी फिल्टर पर सकारात्मक चार्ज की ताकत और वायरस 'नकारात्मक अपने समविद्युतविभव बिंदु से संबंधित प्रभारी की ताकत और पानी का पीएच 21 परीक्षण किया जा रहा से संबंधित बातचीत है। फिल्टर से क्षालन भी इन संबंधों की ताकत से प्रभावित है। क्योंकि वे वायरस प्रकार के बीच और यहां तक ​​कि एक ही प्रकार के भीतर उपभेदों के बीच में भिन्नता है, फिल्टर से क्षालन एक समान नहीं है। इसका मतलब यह है कि किसी भी परिणाम पर्यावरण के पानी में मौजूद वायरस की वास्तविक स्तर को नजरअंदाज कर सकते। एकल बीजीएम सेल लाइन का उपयोग भी वायरस घटना underestimates। क्षेत्रआंतों का वायरस है कि इस सेल लाइन मुख्य रूप से polioviruses और Enterovirus बी प्रजातियों सीरमप्रकारों के साथ ही कुछ reoviruses 14,15,22 तक सीमित है सीपीई उत्पादन कर सकते हैं। अन्य संक्रामक वायरस प्रकार पता नहीं होगा।

जमीन और अभिकर्मक ग्रेड पानी से पोलियो वायरस वसूलियां दोनों निष्पादन मूल्यांकन (पीई के लिए USEPA विधि 1,615 प्रदर्शन स्वीकृति मानदंडों से मुलाकात की, यानी, एक विश्लेषक के अज्ञात titers है कि शुरू करने से पहले विश्लेषक के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के साथ वरीयता प्राप्त अभिकर्मक ग्रेड पानी के नमूने एक अध्ययन) और LFB नमूने (पूरक सामग्री तालिका एस 1) के। संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग भूजल से 58% वसूली नल का पानी 23,24 का उपयोग कर दूसरों से खबर दी है कि के समान है। 100% की (सीवी) भिन्नता के गुणांक के साथ 111% की LFB नमूनों से मतलब वसूली भी विधि प्रदर्शन स्वीकृति मानदंडों से मुलाकात की, भले ही वे पीई नमूने के लिए मनाया है कि अधिक से अधिक कर रहे हैं durआईसीआर हैैं। आईसीआर मतलब है, जबकि मतलब intralaboratory वसूली के 85% (सीवी 58 131%; आईसीआर पीई डेटाबेस से अप्रकाशित डेटा) के लिए 36 से विविध interlaboratory वसूली भिन्नता 92% की (सीवी) के गुणांक के साथ 56% थी। उच्चतर वसूलियां उच्चतर बीज के नमूने (122 42 बनाम%) के लिए की तुलना में कम बीज LFB नमूने के लिए इस अध्ययन में मनाया गया। समय है कि आईसीआर की योजना बनाई जा रही थी पर, यह उम्मीद थी कि पीई कम बीज मूल्यों प्राप्त नमूनों कम वसूली के लिए होता है कि उन उच्च बीज प्राप्त। यहाँ LFB नमूने के लिए मनाया कि इसी तरह, आईसीआर पीई नमूने के लिए पोलियो वायरस वसूली बीज मूल्यों के लिए 71% थे (सीवी 100%), 54% (सीवी 69%), और 44% (सीवी 71%) ≤300 एमपीएन, 300- 1,500 एमपीएन, और> 1,500 एमपीएन, क्रमशः।

वहाँ पानी के नमूने 25 में संक्रामक वायरस को मापने के लिए कई तरीके हैं। इस विधि के मानकीकरण की डिग्री में अन्य तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है। मानकीकरण न केवल गुणवत्ता और प्रदर्शन नियंत्रण भी शामिल है,लेकिन यह भी परिभाषित मात्रा और फार्मूले का उपयोग करता है सुनिश्चित करें कि सभी विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं विधि हूबहू प्रदर्शन करते हैं। मानकीकरण के बिना, यह प्रयोगशालाओं भर में परिणामों की तुलना करने के लिए मुश्किल है, और इसलिए मानकीकरण जब कई विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। निर्मित में मानकीकरण के साथ इस पद्धति भविष्य में विस्तार किया जा सकता अतिरिक्त वायरस प्रकार और सेल लाइनों शामिल करने के लिए। अनुसंधान विधि में एडीनोवायरस के शामिल किए जाने के लिए डेटा उपलब्ध कराने के लिए चल रहा है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beef extract, desiccated powder BD Bacto 211520
Cryogenic tubes Thermo Fisher 3775/945373
Hank’s balanced salt solution Invitrogen 14170-112
Mechanical rocking platform Daigger EF4907G
Orbital shaker Thermo Fisher 14-285-729
Sterilizing filter with prefilter VWR 28143-295
Sterilizing syringe filter Corning 431219
pH Standards Sigma-Aldrich 33643, 33646, 33648
MEM Sigma-Aldrich M1018 or M4642
Leibovitz L-15 Sigma-Aldrich L4386
Sodium bicarbonate, 7.5% Sigma-Aldrich S8761
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Antibiotic-Antimycotic Life Technologies 15240-062
Trypsin, EDTA Invitrogen 25200072

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 115 वायरस संक्रामक जलजनित एकाग्रता का पता लगाने घटना कुल कृषि योग्य वायरस परख
EPA विधि 1615. Enterovirus और संस्कृति और RT-qPCR द्वारा पानी में Norovirus घटना के मापन। द्वितीय। कुल कृषि योग्य वायरस परख
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Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (115), e52437, doi:10.3791/52437 (2016).

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