Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.
A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency’s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.
आंतों का वायरस वायरस है कि मानव आंत्र प्रणाली को संक्रमित और जो मल-मौखिक मार्ग के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं की एक विविध समूह हैं। ये वायरस मलजल उपचार संयंत्र और सेप्टिक टैंक अपशिष्ट, अनुचित तरीके से बनाया गया है या टूट सेप्टिक टैंक, टूटे सीवर लाइनों, संयुक्त सीवर ओवरफ्लो, और अन्य बिंदु और गैर-बिंदु स्रोतों 1-4 के माध्यम से सतह और भूमिगत जल में प्रवेश। जलजनित वायरस से मानव में संक्रमण और बीमारी दूषित या अपर्याप्त कीटाणुरहित पानी की खपत के माध्यम से या मनोरंजन पानी संपर्क के माध्यम से होते हैं। रोग के लक्षण गंभीर आंत्रशोथ को हल्के शामिल हो सकता है; आँख आना; बुखार; ऊपरी श्वसन संकट; हाथ पैर और मुंह की बीमारी; मायोकार्डिटिस; सड़न रोकनेवाला मैनिंजाइटिस; इन्सेफेलाइटिस; पक्षाघात; पूति 5-8, और मौत 9,10।
USEPA विधि 1615 पर्यावरण और पीने के पानी में संक्रामक आंतों का वायरस कणों को मापने के लिए एक प्रक्रिया है। ये पानी एक में हो सकते हैंसंक्रामक और गैर-संक्रामक virions का मिश्रण है, लेकिन केवल संक्रामक कणों एक संभावित स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा कर। संक्रामक वायरस कणों किसी भी कीटाणुनाशक है कि वर्तमान 11-13 हो सकता है के कारण प्रोटीन capsid अखंडता, सूरज की रोशनी से पराबैंगनी विकिरण, और नुकसान की वजह से न्यूक्लिक एसिड को होने वाले नुकसान के नुकसान से पर्यावरण और पीने के पानी में समय के साथ संक्रामकता खो देते हैं। कुल कृषि योग्य वायरस विधि में प्रदान की प्रक्रिया भैंस के ग्रीन बंदर गुर्दा (बीजीएम) सेल लाइन में cytopathic प्रभाव (सीपीई) के उत्पादन पर आधारित है। यह सेल लाइन पर्यावरण विषाणु विज्ञान क्षेत्र 14,15 में इसकी व्यापक उपयोग के कारण चुना गया था, फिर भी पता लगाया संक्रामक वायरस प्रकार की सीमा निश्चित enteroviruses से 15 मुख्य रूप से प्रतिबंधित कर रहे हैं। इस पत्र का उद्देश्य पांच इंच विद्युत धन कारतूस फिल्टर का क्षालन, माध्यमिक एकाग्रता, और कुल कृषि योग्य वायरस की माप के लिए विधि 1615 की प्रक्रियाओं का वर्णन है। का मूल्यांकनसमग्र विधि Cashdollar एट अल। 16 में वर्णित है।
USEPA विधि 1615 अनियमित Contaminant निगरानी नियमन की तीसरी निगरानी चक्र (UCMR3) 17 के दौरान इस्तेमाल के लिए विकसित किया है और मुख्य रूप से भूजल में वायरस घटना को मापने के लिए डिजाइन किया गया था। यह सूचना संग्रह नियम (आईसीआर) विधि, 15,18 के साथ आम कदम के एक नंबर के शेयरों लेकिन दो नाबालिग मतभेद है। दोनों quantal assays का उपयोग वायरस उस पर सबसे संभावित संख्या (MPN) की गणना के आधार पर किया जा रहा quantitation साथ बीजीएम सेल monolayers पर सीपीई उत्पादन को मापने के लिए। विधि 1615 विभिन्न पानी matrices से वायरस को ध्यान केंद्रित करने के लिए एक नए विद्युत धन फिल्टर के उपयोग की अनुमति देता है और 20 से 10 दोनों मामूली परिवर्तन समग्र विधि लागत को कम करने के कमजोर पड़ने के प्रति सेल संस्कृति परीक्षण पोत की संख्या प्रतिकृति कम कर देता है। प्रतिकृति की संख्या में कमी श्रम को कम कर देता है, लेकिन एक से थोड़ा कम सीमा का पता लगाने में यह परिणाम है। हालांकि groundwaters सतह के पानी से वायरस की कम सांद्रता है की संभावना है, 19,20 वेंनमूने के ई राशि यत्न पांच बार है कि सतह के पानी की है, मतभेद के लिए भाग में प्रतिकारी। कम प्रतिकृति के उपयोग के सबसे सतह के पानी के लिए पर्याप्त होगा, लेकिन कुछ नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता होगी।
विधि 1615 में कई महत्वपूर्ण कदम और सीमाएँ हैं। बीफ अर्क बहुत से बहुत कुछ करने के लिए अलग अलग। प्रत्येक स्थल वायरस क्षालन की प्रभावशीलता और माध्यमिक एकाग्रता कदम के माध्यम से वायरस एकाग्रता के लिए क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में वर्णित पूरक सामग्री अनुभाग S2.3 है। विधि बीजीएम सेल संस्कृतियों पर टीका लगाना और वायरस titers निर्धारित करने के लिए नमूना की राशि की गणना के लिए सटीक फार्मूले का उपयोग करता है। यदि इन सूत्रों को कड़ाई से पालन नहीं कर रहे गलत परिणाम उत्पन्न हो जाएगा। उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक सेल संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। असंक्रमित बीजीएम सेल संस्कृति नियंत्रण है कि 14 दिन ऊष्मायन अवधि के दौरान संकट दिखाने की संभावना सेल संस्कृति रखरखाव के साथ समस्याओं का संकेत। महान देखभाल भी टा होना चाहिएकेन का टीका और सेल संस्कृति बोतल के लिए माध्यम के अलावा पार संक्रमण से बचने के साथ शामिल कदम pipetting के दौरान। गुणवत्ता के पूरक सामग्री धारा S2 में वर्णित नियंत्रण कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। धारा S2 भी गुणवत्ता के मुद्दों के लिए समस्या निवारण सलाह प्रदान करता है।
वायरस सोखना के प्राथमिक तंत्र फिल्टर विद्युत धन के लिए एक प्रभारी फिल्टर पर सकारात्मक चार्ज की ताकत और वायरस 'नकारात्मक अपने समविद्युतविभव बिंदु से संबंधित प्रभारी की ताकत और पानी का पीएच 21 परीक्षण किया जा रहा से संबंधित बातचीत है। फिल्टर से क्षालन भी इन संबंधों की ताकत से प्रभावित है। क्योंकि वे वायरस प्रकार के बीच और यहां तक कि एक ही प्रकार के भीतर उपभेदों के बीच में भिन्नता है, फिल्टर से क्षालन एक समान नहीं है। इसका मतलब यह है कि किसी भी परिणाम पर्यावरण के पानी में मौजूद वायरस की वास्तविक स्तर को नजरअंदाज कर सकते। एकल बीजीएम सेल लाइन का उपयोग भी वायरस घटना underestimates। क्षेत्रआंतों का वायरस है कि इस सेल लाइन मुख्य रूप से polioviruses और Enterovirus बी प्रजातियों सीरमप्रकारों के साथ ही कुछ reoviruses 14,15,22 तक सीमित है सीपीई उत्पादन कर सकते हैं। अन्य संक्रामक वायरस प्रकार पता नहीं होगा।
जमीन और अभिकर्मक ग्रेड पानी से पोलियो वायरस वसूलियां दोनों निष्पादन मूल्यांकन (पीई के लिए USEPA विधि 1,615 प्रदर्शन स्वीकृति मानदंडों से मुलाकात की, यानी, एक विश्लेषक के अज्ञात titers है कि शुरू करने से पहले विश्लेषक के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं के साथ वरीयता प्राप्त अभिकर्मक ग्रेड पानी के नमूने एक अध्ययन) और LFB नमूने (पूरक सामग्री तालिका एस 1) के। संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग भूजल से 58% वसूली नल का पानी 23,24 का उपयोग कर दूसरों से खबर दी है कि के समान है। 100% की (सीवी) भिन्नता के गुणांक के साथ 111% की LFB नमूनों से मतलब वसूली भी विधि प्रदर्शन स्वीकृति मानदंडों से मुलाकात की, भले ही वे पीई नमूने के लिए मनाया है कि अधिक से अधिक कर रहे हैं durआईसीआर हैैं। आईसीआर मतलब है, जबकि मतलब intralaboratory वसूली के 85% (सीवी 58 131%; आईसीआर पीई डेटाबेस से अप्रकाशित डेटा) के लिए 36 से विविध interlaboratory वसूली भिन्नता 92% की (सीवी) के गुणांक के साथ 56% थी। उच्चतर वसूलियां उच्चतर बीज के नमूने (122 42 बनाम%) के लिए की तुलना में कम बीज LFB नमूने के लिए इस अध्ययन में मनाया गया। समय है कि आईसीआर की योजना बनाई जा रही थी पर, यह उम्मीद थी कि पीई कम बीज मूल्यों प्राप्त नमूनों कम वसूली के लिए होता है कि उन उच्च बीज प्राप्त। यहाँ LFB नमूने के लिए मनाया कि इसी तरह, आईसीआर पीई नमूने के लिए पोलियो वायरस वसूली बीज मूल्यों के लिए 71% थे (सीवी 100%), 54% (सीवी 69%), और 44% (सीवी 71%) ≤300 एमपीएन, 300- 1,500 एमपीएन, और> 1,500 एमपीएन, क्रमशः।
वहाँ पानी के नमूने 25 में संक्रामक वायरस को मापने के लिए कई तरीके हैं। इस विधि के मानकीकरण की डिग्री में अन्य तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है। मानकीकरण न केवल गुणवत्ता और प्रदर्शन नियंत्रण भी शामिल है,लेकिन यह भी परिभाषित मात्रा और फार्मूले का उपयोग करता है सुनिश्चित करें कि सभी विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं विधि हूबहू प्रदर्शन करते हैं। मानकीकरण के बिना, यह प्रयोगशालाओं भर में परिणामों की तुलना करने के लिए मुश्किल है, और इसलिए मानकीकरण जब कई विश्लेषणात्मक प्रयोगशालाओं में बड़े पैमाने पर अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। निर्मित में मानकीकरण के साथ इस पद्धति भविष्य में विस्तार किया जा सकता अतिरिक्त वायरस प्रकार और सेल लाइनों शामिल करने के लिए। अनुसंधान विधि में एडीनोवायरस के शामिल किए जाने के लिए डेटा उपलब्ध कराने के लिए चल रहा है।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |