Introduction
Los virus entéricos son un grupo diverso de virus que infectan el sistema intestinal humano y que se transmiten a través de la vía fecal-oral. Estos virus entran en las aguas superficiales y subterráneas a través de la planta de tratamiento de aguas residuales y efluentes de fosas sépticas, pozos sépticos incorrectamente diseñados o rotas, líneas de alcantarillado rotos, derrames de aguas negras combinadas, y otras fuentes puntuales y no puntuales 1-4. Las infecciones humanas y las enfermedades transmitidas por el agua de los virus se producen a través del consumo de agua contaminada o no adecuadamente desinfectada o por contacto de las aguas recreativas. síntomas de la enfermedad pueden implicar leve a severa; gastroenteritis conjuntivitis; fiebre; distrés respiratorio superior; la mano, la fiebre aftosa; miocarditis; meningitis aséptica; encefalitis; parálisis; sepsis 5-8, y la muerte 9,10.
Método USEPA 1615 proporciona un procedimiento para medir partículas de virus entéricos infecciosas en aguas ambientales y de agua potable. Estas aguas pueden contener unamezcla de viriones infecciosos y no infecciosos, pero sólo las partículas infecciosas representan un peligro potencial para la salud. Partículas de virus infecciosas pierden infectividad con el tiempo en las aguas ambientales y beber de pérdida de la integridad de la cápside de proteínas, daños a los ácidos nucleicos debido a la radiación UV de la luz solar, y el daño debido a desinfectantes que pueden estar presentes 11 a 13. El procedimiento de virus cultivables total proporcionada en el método se basa en la producción de efectos citopáticos (CPE) en la línea celular de riñón de mono verde de Buffalo (BGM). Esta línea celular fue elegido debido a su amplio uso en el campo de la virología ambiental 14,15, a pesar de que la gama de tipos de virus infecciosos detectados se limita principalmente a ciertos enterovirus 15. El propósito de este trabajo es describir los procedimientos del Método 1615 para la elución de los filtros de cartucho electropositivo de cinco pulgadas, la concentración secundaria, y la medición de los virus cultivables totales. Una evaluación de lamétodo global se describe en Cashdollar et al. 16.
Protocol
NOTA: Por favor, véase la sección Materiales suplementarios S1 para obtener una lista de definiciones. Los procedimientos de control de calidad asociados con el método USEPA 1615 se describen en la sección S2 materiales suplementarios.
1. Filtro Procedimiento elución
- Primera elución
- Colocar 500 ml de extracto de carne 1,5% tamponada, pH 9,0, se calentó a temperatura ambiente en un cilindro graduado. Abra la carcasa del cartucho de filtro y añadir una cantidad suficiente de extracto de carne para cubrir el filtro electropositivo completamente. Vuelva a colocar la tapa de la carcasa del filtro y vierta el extracto de carne que queda en un vaso estéril.
- Después de 1 minuto de tiempo de contacto, pasar la solución de extracto de carne de vacuno en la carcasa junto con la restante en el vaso de precipitados estéril lentamente a través del filtro utilizando un recipiente de presión o una bomba peristáltica. Recoger el eluido en un vaso de precipitados de vidrio de 2 L.
- En segundo lugar elución
- Repita los pasos 1.1 utilizando otros 500 ml adicionales de extracto de carne 1,5% tamponada, Pero aumentar el tiempo de contacto en el paso 1.1.2 a 15 min.
- Añadir el extracto de carne de la segunda elución al vaso de precipitados que contiene 2 L que a partir de la primera elución. Añadir una barra de agitación estéril al vaso de precipitados.
Procedimiento 2. Concentración orgánica floculación
- Esterilizar un electrodo de pH de tipo combinado con hipoclorito de sodio 0,525% durante al menos 5 min. Enjuagar el electrodo con estéril dH 2 O y luego eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M. Calibrar el medidor de pH con pH 4 y 7 estándares.
- Colocar el vaso que contiene el eluato en una placa de agitación. Encienda la placa y aumentar la velocidad de agitación hasta que se forma un vórtice.
- Ajustar el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 lentamente por adición gota a gota de HCl 1,2 M al eluido. Añadir el HCl gota a gota, porque además de la rápida será inactivar virus. Durante este tiempo el eluato se convertirá nublado como un precipitado comienza a formarse.
- Reducir la mezcla speed a un revuelo lento y luego continuar a controlar y mantener el pH del eluato a 3,5 ± 0,1 a temperatura ambiente durante 30 min.
- Se vierte la suspensión extracto de carne precipitado en una o más botellas de centrífuga y centrifugar durante 15 min a 2500 xg a 4 ° C. Retire las botellas de la centrífuga y, o bien aspirar o lentamente decantar el sobrenadante para evitar la pérdida del precipitado sedimentado. Descartar el sobrenadante.
NOTA: No puede haber una considerable variación entre lotes de extracto de carne de vacuno en la cantidad y calidad del precipitado. El precipitado producido a partir de algunos lotes se disolverá rápidamente mientras que a partir de otros lotes se disuelve con dificultad. - Añadir 30 ml de fosfato de sodio 0,15 M a la botella de centrífuga que contiene el precipitado.
- Utilizar fosfato de sodio 0,15 M, pH 9,0, para precipita a partir de lotes extracto de carne que se disuelven en 5 minutos. Se agita durante 10 minutos después de que el precipitado se haya disuelto completamente, y luego ir inmediatamente al paso 2.7.
- Utilice fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 para todos los otros precipitados. Se agita durante 10 a 15 min para disolver, o por precipitados más difíciles, romper con una espátula estéril, mediante la elaboración de la solución varias veces arriba y abajo durante la agitación con una pipeta, agitando el precipitado a 160 rpm en un agitador orbital, o por una combinación de estos procedimientos.
NOTA: Cuando se utiliza más de una botella de centrífuga, se combinan los precipitados utilizando menos de 30 ml de fosfato de sodio y luego utilizar la parte restante de los 30 ml para enjuagar las botellas después de combinar los precipitados en una botella o vaso de precipitados. - Si el precipitado combinado es en una botella de centrífuga de fondo plano, añadir una barra de agitación a la botella. Ir al paso 2.6.5.
- Si el precipitado combinado está en una botella de centrífuga con un fondo cónico, la transfiere en una pequeña cubeta de vidrio y añadir una barra de agitación al vaso de precipitados.
- Coloque la botella o vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita hasta que el precipitate se haya disuelto completamente.
- Re-esterilizar un electrodo de pH tipo combinación con hipoclorito de sodio 0,525% y eliminar el cloro con tiosulfato de sodio 0,05 M como se describe en el paso 2.1. Calibrar el medidor de pH con un pH de 7 y 10 estándares. ajustar lentamente el pH del precipitado completamente disuelto a 9,0 con NaOH 1 M y luego se agita durante 10 min.
- Retire la barra de agitación y centrifugar el precipitado disuelto durante 10 minutos a 4,000-10,000 xgy 4 ° C.
- Con cuidado, verter el sobrenadante en un vaso de vidrio sin perturbar el sedimento. Añadir una barra de agitación al vaso de precipitados y desechar el sedimento.
- Colocar el vaso de precipitados sobre un agitador magnético, y se agita la solución. Añadir gota 1,2 M HCl aconsejable ajustar el pH a 7,0-7,5.
- Filtro de esterilizar el sobrenadante mediante paso a través de un filtro esterilizante que contiene un filtro previo que se había pretratado con 15 ml de extracto de carne 1,5%, 0,05 M de glicina, pH 7,0 a 7,5.
- Volum de la muestra de ensayoe (S) de los cálculos:
- Utilizar la ecuación 1 para calcular S para todas las muestras de prueba, excepto el Laboratorio fortificada en blanco y el reactivo de laboratorio en blanco,
Ecuación 1
donde D (Volumen de la muestra original de agua ensayada) es de 500 l para las aguas subterráneas, TSV (volumen total de muestra) es el volumen de la muestra de campo pasa a través del filtro de cartucho electropositivo 5 pulgadas recibido en el laboratorio, y FCSV (Final Concentrado Volumen de la muestra) es el volumen después de la filtración en el Paso 2.10. Un ejemplo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.1. - Calcular S para la fortificada laboratorio en blanco (LFB; es decir, un control positivo de la calidad del agua mediante sembrado de grado reactivo) y el reactivo de laboratorio en blanco (LRB, es decir, un control negativo calidad utilizando agua de grado reactivo) multiplicando el FCSV por 0,3.
- Utilizar la ecuación 1 para calcular S para todas las muestras de prueba, excepto el Laboratorio fortificada en blanco y el reactivo de laboratorio en blanco,
- Divida la FCSV en three submuestras.
- Preparar submuestras 1 y 2 con un volumen igual a 1,04 veces el volumen de muestra de ensayo. Congelar estas submuestras en o por debajo de -70 ° C si no pueden ser analizados usando el ensayo de virus cultivables totales (Submuestra 1, Paso 4) o tratados a los ensayos moleculares (no mostrados) dentro de las 24 horas; de lo contrario, mantener a 4 ° C.
- Congelar el volumen restante (submuestra 3) en o por debajo de -70 ° C.
- Calcular el volumen del inóculo dividiendo el S por 10.
Ecuación 1 3. Virus Total Culturable quantal Ensayo
NOTA: Para todas las medidas siempre se agregan soluciones con cuidado para no perturbar la monocapa de células.
- Decantar o aspirar el contenido de los medios recipientes de ensayo que contenían una monocapa de células BGM a los 3-6 días después de la división y luego añadir un volumen de solución salina equilibrada igual a los medios de comunicación eliminado.
- Decantar o aspirar la solución salina equilibrada de la te de cultivo celularvasos st usadas, y se inoculan los recipientes de ensayo de cultivo de células
- Inocular 10 recipientes de ensayo para cada muestra de ensayo con un volumen de submuestra 1 igual al volumen del inóculo junto con el total de los controles de ensayo cuánticos de virus cultivables (materiales suplementarios sección S2.4).
- Para la LFB y el Laboratorio fortificada matriz de la muestra (LFSM, es decir, cabeza de serie de la muestra de matriz de agua), preparar 5-, 25-, y diluciones de 125 veces utilizando submuestra 3 y fosfato de sodio 0,15 M, pH 7,0 a 7,5 como diluyente. Un ejemplo de un procedimiento para hacer las diluciones se da en la sección de materiales suplementario S3. Inocular 10 recipientes de ensayo de cultivo de células lavadas para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo además de los vasos inoculados con Submuestra no diluido 1 en el paso 3.2.1.
- Para cualquier muestra de prueba de la etapa 3.2.1 (excepto los inoculado en el paso 3.2.2) que tiene CPE en las 10 repeticiones después de 14 días de incubación (véase el paso 3.3), prepare diluciones 5-, 25- y 125-, y 625 veces de submuestra 3. Inocular 10 lava recipientes de ensayo de cultivo de células para cada serie de dilución utilizando un volumen de inóculo en cada recipiente de ensayo junto con un nuevo conjunto de la quantal total de virus cultivables controles del ensayo (materiales suplementarios sección S2.4).
- Distribuir el inóculo sobre la superficie de las monocapas de células por la inclinación de los vasos de ida y vuelta. Incubar los recipientes de ensayo a temperatura ambiente durante 80-120 min en una plataforma oscilante mecánica en 1-5 oscilaciones / min o con balanceo de los vasos cada 15-20 minutos para permitir que cualquier virus presente para adsorber a las células.
- Añadir medio de mantenimiento precalentado, y luego se incuban los recipientes de ensayo a 36,5 ± 1 ° C.
- Buscar la aparición de CPE en cada recipiente de ensayo utilizando un microscopio al día durante los primeros 3 d y luego examinarlas cada 2-3 días hasta el día 14. Transferencia ningún recipientes de ensayo que muestran ≥75% de CPE a un congelador fijado en opor debajo de -70 ° C. Congelar todas las culturas restantes y el total de los controles de análisis de virus cultivables cuánticos igual o inferior a -70 ° C después de examinar los vasos en el último día.
- Descongelar todas las culturas y filtrar ≥15% de la media de cada recipiente de ensayo CPE-positivo a través de un filtro de esterilización de 0,2 micras. Si el volumen especificado no se puede pasar a través del filtro debido a la obstrucción, se centrifuga el medio durante 10 minutos a 1,500-18,000 xg y 4 ° C antes de la filtración.
- Realizar un segundo paso de los 1 st recipientes de ensayo pasaje utilizando recipientes de ensayo BGM lavadas.
- Inocular los nuevos recipientes de ensayo con un volumen de inoculación que representa el 10% del medio descongelado de todos los recipientes de ensayo y negativos del medio filtrado de los vasos positivos.
- Repita los pasos 3.2.4-3.4.3, pero congelar cualquier recipiente de ensayo que fue negativo en el paso 1 st y positivo en el 2º como se describe en el paso 3.3. Realizar un pase 3ªedad tal como se describe para el paso 2 nd utilizando sólo los controles de ensayo negativos y cultivos celulares que fueron negativos durante el paso 1 st y positivo en el paso 2 nd.
- Identificar los recipientes de ensayo individuales como el virus positivo cuando muestran CPE tanto en el 1 ° y 2 pasajes nd o, en el caso en que el CPE no se produce hasta el paso 2º, tanto en los pasajes 2 ª y 3 ª.
- Utilice la calculadora de número más probable de la EPA con los ajustes por defecto del programa establecidos como se muestra en la Tabla S2 para calcular los títulos de virus de todas las muestras de ensayo.
- Introducir el número de virus positivos vasos de ensayo en paralelo desde el paso 3.6 para cada muestra de ensayo en la calculadora para determinar el valor NMP / ml (M ml) y la superior (CL UML) y el 95% límites de confianza / valores ml más bajos (CL LML) .
- Obtain el valor NMP / L (M L) de la muestra de ensayo correspondiente usando la ecuación 2.
Ecuación 2
M ml es el valor / ml NMP en el paso 3.7, S es el volumen de la muestra de ensayo, y D es el volumen de la muestra original de agua ensayada. - Calcular el límite de confianza superior / L sustituyendo el valor CL UML para el valor M ml. Calcular la menor confianza límite / L sustituyendo el valor CL LML para el valor M mL. Un ejemplo de cálculo se muestra en la sección materiales suplementarios S4.2.
- Informe valores M mL de 0 como ≤ 1 / D. Por ejemplo, ≤ 0,002 NMP / L (≤ 1/500 L) para las muestras de agua subterránea.
- Calcular los valores de límite de confianza del MPN y el 95% para cada laboratorio fortificada en blanco y Re Labagente en blanco multiplicando primero los valores / ml obtenidos en la calculadora S y dividiendo el resultado por 0,3.
Ecuación 2 Representative Results
El virus se concentra a partir de la fuente de agua subterránea tres plantas de tratamiento de agua potable y una privada, así que utilizan filtros electropositivos. Dos conjuntos de la muestra, que consta de una muestra de campo y control LFSM, se recogieron de las plantas de tratamiento en ocasiones separadas, y un conjunto de muestras se recogieron desde el pozo privado. La recuperación total del virus se determinó utilizando muestras LFSM de dos de las plantas y el pozo privado (dos muestras de una planta y una muestra de otro fueron excluidos del cálculo porque el valor de la MPN de la semilla utilizada con cada muestra no se pudo determinar con precisión debido a los resultados de CPE anormales entre matraces replicados). La media de recuperación de poliovirus a partir de muestras de aguas subterráneas promedio de 58% con un coeficiente de variación del 79% (Figura 2) 16. No virus cultivables se detectó en ninguna de las muestras de campo de aguas subterráneas cabeza de serie duplicados.
el funcionamiento del método también se midió utilizando LFB sejemplos modificados mediante el uso de dos niveles de semillas diferentes. Se utilizó un título de "baja" de 300 NMP de poliovirus para evaluar el rendimiento en niveles inferiores al nivel 500 "estándar" NPF LFB utilizado en el método USEPA 1615. Un "alto" título de 1,000 NMP de poliovirus se utilizó para probar el rendimiento en el nivel del control LFSM. Estos controles a cabo de manera similar con una recuperación media del 111% y un coeficiente de variación de 100% (Figura 2). Todas las muestras fueron negativas LRB y todas las muestras LFB realizan dentro del rango de aceptación (material complementario el cuadro S1).
Se muestra la Figura 1. La elución de filtro. Un esquema para el uso de un recipiente a presión para la elución filtro de cartucho. presión de aire positiva se utiliza para empujar solución de extracto de carne en el recipiente de presión a través del con alojamiento de cartuchocontiene el filtro de cartucho electropositivo. Una bomba peristáltica puede ser sustituido por el recipiente de presión, con la entrada de la bomba se coloca en el recipiente que contiene la solución de extracto de carne de vacuno.
Figura 2. Media Poliovirus Recuperación (%) del suelo y el agua de grado reactivo. La recuperación media por ciento se muestra para el poliovirus de suelo ( 
; n = 4) y de grado reactivo agua ( 
; n = 12) muestras. Las doce muestras de agua de grado reactivo incluyen seis sembró con 300 MPN y se sembró con seis 1,000 NMP de poliovirus. Las barras de error representan el error estándar.
Discussion
Método USEPA 1615 fue desarrollado para su uso durante el tercer ciclo de monitorización del Reglamento los contaminantes no regulados (UCMR3) 17 y diseñado fundamentalmente para medir la ocurrencia del virus en el agua subterránea. Se comparte una serie de pasos comunes con el método de información de regla de colección (ICR), 15,18 pero tiene dos diferencias menores. Tanto el uso de ensayos para medir cuánticos virus que producen CPE sobre monocapas de células BGM con cuantificación de ser en base a mayoría de los cálculos del número más probable (NMP). Método 1615 permite el uso de un filtro de electropositivo más reciente para la concentración de virus a partir de varias matrices de agua y reduce el número de recipiente de ensayo de cultivo de células réplicas por dilución de 20 a 10. Tanto los cambios de menor importancia reducir los costos generales del método. La reducción en el número de repeticiones reduce la mano de obra, pero da lugar a un límite de detección ligeramente inferior. Aunque se espera que las aguas subterráneas a tener menores concentraciones de virus que las aguas superficiales, 19,20 ºe cantidad de muestra ensayada es cinco veces mayor que la de las aguas superficiales, compensando en parte las diferencias. El uso de un menor número de repeticiones será adecuado para la mayoría de las aguas de superficie, pero algunos requieren dilución de la muestra.
Método 1615 tiene varios pasos críticos y limitaciones. extractos de carne de res varían de lote a lote. Cada lote debe ser probado para la eficacia de la elución del virus y la capacidad de concentración del virus a través de las etapas de concentración secundaria es como se describe materiales suplementarios sección S2.3. El método utiliza fórmulas precisas para el cálculo de la cantidad de muestra para inocular en cultivos celulares de música ambiental y determinar los títulos de virus. Los resultados inexactos se generarán si estas fórmulas no se siguen rigurosamente. una técnica aséptica apropiada debe ser utilizado para el mantenimiento de cultivos de células. No infectadas control de cultivos celulares de música ambiental que muestran angustia durante el período de incubación de 14 días probable que indican problemas con el mantenimiento del cultivo celular. El gran cuidado debe ser también taken durante el pipeteo pasos a seguir para la inoculación del medio y adición a matraces de cultivo de células para evitar la contaminación cruzada. Los controles de calidad que se describen en la Sección S2 suplementaria materiales deben seguirse rigurosamente. Sección S2 también proporciona consejos para la solución de problemas problemas de calidad.
El principal mecanismo de la adsorción del virus a electropositivo filtros es una interacción de carga relacionada con la fuerza de la carga positiva en el filtro y la fuerza de carga negativa del virus relacionado con su punto isoeléctrico y el pH del agua que se está probando 21. La elución de los filtros también se ve afectada por la fuerza de estas interacciones. Debido a que varían entre los tipos de virus, e incluso entre las cepas dentro del mismo tipo, la elución de los filtros no es uniforme. Esto significa que cualquier resultado puede subestimar el nivel real de virus presente en las aguas ambientales. El uso de la línea celular BGM única también subestima la aparición de virus. El rangode virus entérico que puede producir CPE en esta línea celular principalmente está limitada a los poliovirus y serotipos especies Enterovirus B, así como algunos reovirus 14,15,22. No se detectaron otros tipos de virus infeccioso.
Recuperaciones de poliovirus de las aguas subterráneas y de grado reactivo cumplan las 1615 criterios de aceptación de rendimiento método USEPA tanto para la Evaluación del Desempeño (PE; es decir, las muestras de agua sin semillas de grado reactivo con títulos desconocidos a un analista que se utilizan para evaluar el desempeño del analista antes del inicio de un estudio) y muestras (LFB materiales suplementarios Tabla S1). La recuperación del 58% de las aguas subterráneas mediante el procedimiento de cultivo es similar a la reportada por otros que usan el agua del grifo 23,24. La recuperación media de las muestras de la LFB 111% con un coeficiente de variación (CV) de 100% también se reunió con los criterios de aceptación de rendimiento del método a pesar de ser mayor que la observada para las muestras de PE during del ICR. ICR recuperación media entre laboratorios era 56% con un coeficiente de variación (CV) de 92%, mientras que las recuperaciones medias intralaboratorio variaron desde 36 hasta 85% (CV 58 a 131%; datos no publicados de la base de datos ICR PE). Se observaron mayores recuperaciones en este estudio para la baja de semillas muestras LFB que para las muestras de semillas más altas (122 frente a 42%). En el momento en que el ICR se estaba planeando, se esperaba que las muestras de PE que reciben valores bajos de semillas tendrían la recuperación de un menor que aquellos que recibieron semillas de alto. Similar a la observada aquí por las muestras de la LFB, la recuperación de poliovirus para muestras ICR PE eran 71% (CV 100%), 54% (CV 69%), y el 44% (CV 71%) para los valores de semilla ≤300 MPN, 300- 1.500 RPM, y> 1.500 RPM, respectivamente.
Hay muchos métodos para la medición de virus infeccioso en muestras de agua 25. Este método es significativa con respecto a otros métodos en el grado de estandarización. La normalización no sólo incluye los controles de calidad y rendimiento,pero también utiliza volúmenes y fórmulas definidas para garantizar que todos los laboratorios analíticos realizar el método de forma idéntica. Sin la normalización, es difícil comparar los resultados entre laboratorios, y por lo tanto la normalización es esencial cuando se realizan estudios a gran escala en varios laboratorios de análisis. Con la estandarización incorporado en este método podría ampliarse en el futuro para incluir tipos adicionales del virus y líneas celulares. La investigación está en marcha para proporcionar datos para la inclusión de adenovirus en el método.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Beef extract, desiccated powder | BD Bacto | 211520 | |
| Cryogenic tubes | Thermo Fisher | 3775/945373 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | |
| Mechanical rocking platform | Daigger | EF4907G | |
| Orbital shaker | Thermo Fisher | 14-285-729 | |
| Sterilizing filter with prefilter | VWR | 28143-295 | |
| Sterilizing syringe filter | Corning | 431219 | |
| pH Standards | Sigma-Aldrich | 33643, 33646, 33648 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M1018 or M4642 | |
| Leibovitz L-15 | Sigma-Aldrich | L4386 | |
| Sodium bicarbonate, 7.5% | Sigma-Aldrich | S8761 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-139 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Trypsin, EDTA | Invitrogen | 25200072 |
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