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Bioengineering

El uso de un gran procesamiento Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52467
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

Summary

El objetivo de este documento métodos es describir el uso de un sistema de microfluidos para el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen especies típicamente identificados en la placa dental supragingival humano. Métodos para describir la arquitectura de biopelículas, la viabilidad de biopelículas, y un acercamiento a la cosecha biofilm para los análisis dependientes de la cultura o la cultura independiente se destacan.

Abstract

No son pocos los de alto rendimiento en sistemas in vitro que faciliten el desarrollo de biopelículas de especies múltiples que contienen numerosas especies comúnmente detectados dentro en vivo biofilms orales. Además, un sistema que utiliza la saliva humana natural como la fuente de nutrientes, en lugar de medios artificiales, es particularmente deseable con el fin de apoyar la expresión de propiedades celulares y biofilm específica que imitan las comunidades in vivo. Se describe un método para el desarrollo de múltiples especies biofilms orales que son comparables, con respecto a la composición de especies, a la placa dental supragingival, en condiciones similares a la cavidad oral humana. En concreto, este artículo se describen los métodos de cómo un sistema de microfluidos disponible en el mercado puede ser adaptado para facilitar el desarrollo de múltiples especies biofilms orales derivados de y crecido dentro de la saliva agrupado. Además, una descripción de cómo el sistema puede ser utilizado en conjunción con un confocal microscopio de barrido láser para generar 3-D reconstrucciones biofilm para los análisis de arquitectura y de viabilidad que se presentará. Dada la amplia diversidad de microorganismos que crecen dentro de los biofilms en el sistema de microfluidos (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, y Porphyromonas), un protocolo se presentará también la descripción de cómo cosechar las células del biofilm para más subcultura o la extracción de ADN y análisis. Se tratarán los límites tanto del sistema de biopelícula de microfluidos y los análisis de datos actualizadas con tecnología de última generación. En última instancia, se prevé que este artículo le proporcionará una técnica de línea de base que va a mejorar el estudio de las biopelículas orales y ayudar en el desarrollo de tecnologías adicionales que se pueden integrar con la plataforma de microfluidos.

Introduction

Los biofilms son comunidades complejas arquitectónicamente de bacterias, que se agrupan en las superficies 1. Estas comunidades típicamente contienen numerosas especies que interactúan entre sí dentro de la biopelícula 2. Biofilms orales, siendo la placa dental más conspicuo visualmente, son un problema persistente en los seres humanos y sus resultados para el desarrollo sin control en la generación de taxonómicamente diversas comunidades de especies múltiples 3. Las bacterias que componen estas comunidades diversas pueden ser de hasta 1.000 veces más resistentes a los antimicrobianos que sus homólogos (planctónicos) que flotan libremente 4-6. El no tratar estas comunidades biofilm orales, que pueden causar caries dental y la enfermedad periodontal, se ha traducido en una importante carga de salud pública: más de 500 millones de visitas a la oficina del dentista por año en los EE.UU., y una de aproximadamente 108 mil millones dólar para tratar o prevenir periodontal la enfermedad y la caries dental 7.

contenido ">" Si bien muchos microbiólogos abogan por estudiar el comportamiento microbiano en condiciones naturales, algunos de ellos lo hacen. Esto se debe a su estado de ánimo para vencer las dificultades que está constantemente minada por la atractiva facilidad de trabajar con cultivos de laboratorio. "-Smith 8.

En la actualidad, la investigación biofilm oral se llevó a cabo usando una variedad de in vivo e in vitro enfoques, cada uno con sus propias ventajas y desventajas 9,10. In vitro se acerca a menudo utilizan sistemas de biopelícula modelo que son relativamente fáciles de configurar, pero pueden carecer de clínica / relevancia en el mundo real 10,11. En vivo enfoques normalmente se basan en sistemas de modelos animales que pueden reproducir ciertos aspectos del entorno oral humana, pero una vez más sufren de limitaciones debido a diferencias en la anatomía, fisiología, microbiología e inmunología entre los animales y los seres humanos 12, 13. Cabe señalar que las biopelículas oralesTambién se pueden desarrollar en la superficie del esmalte, celebrada en un stent dentro de la boca de los voluntarios humanos, pero este enfoque es actualmente relativamente costoso y laborioso 14,15. En última instancia, los agentes o las tecnologías para mejorar la salud bucal nuevos se prueban en humanos en condiciones de ensayos clínicos controlados 11. En la actualidad, un modus operandi de uso frecuente para la identificación y evaluación de nuevos agentes de salud bucal es realizar primero los estudios de laboratorio para discernir la eficacia potencial y, a continuación, realizar estudios en animales y "pruebas de campo" que emplean los médicos para evaluar el éxito de la tecnología 9, 16,17. Desafortunadamente, los estudios de laboratorio tienden a basarse en sistemas modelo que ocupan una gran superficie, son tecnológicamente difícil de usar, y con frecuencia contienen simplifican comunidades de uno o como mucho unas pocas especies para derivar el potencial del mundo real que significa 10,18. Dado que los biofilms de la placa dental contienen múltiples especies y forma en un complex fluye medio salival, el desarrollo de biopelículas que contienen una o unas pocas especies en medios artificial es poco probable que genere comunidades que se comportan de una manera similar a las de un escenario del mundo real 10,19. Para hacer frente al tiempo, costo, los requisitos de formación, y la baja representatividad de los sistemas de biopelícula modelo de laboratorio en comparación con el medio ambiente del mundo real, recientemente hemos desarrollado un alto rendimiento y sistema de biopelícula relacionado con el medio ambiente 20 (Figura 1). El sistema se beneficia del uso de saliva libre de células agrupado humano (CFS) como agrupado saliva que contiene células bacterianas humano medio y sin tratar (CCS) como inóculo. Únicamente, el sistema también combina la tecnología de microfluidos, un microscopio de barrido láser confocal, y la diversidad bacteriana tecnología de análisis independiente del cultivo. Por lo tanto, el sistema modelo es pertinente para el medio ambiente (utilizando saliva como inóculo para crecer biopelículas de especies múltiples a 37 ° C en esterilizada por filtración fluyesaliva) y los biofilms orales contienen especies (incluyendo Streptococcus, Neisseria, Veillonella, y las especies Porphyromonas) en abundancias representante de las que se encuentran en la placa supragingival principios de los 20.

Al considerar que este trabajo se describe el uso del modelo de sistema de nuevo desarrollo, se debe prestar especial atención a la fusión de un microscopio confocal de barrido láser (CLSM) microfluidos, y tecnologías de análisis de la diversidad cultura independiente. La unión de estas tecnologías por parte de nuestro grupo de investigación fue intencional y no sólo añade una capacidad de alto rendimiento para el modelo de sistema de nuevo desarrollo, sino que también permite a las preguntas que se les pide que no podría ser fácilmente abordado antes con otros sistemas. En primer lugar, CLSM tiene claras ventajas sobre la microscopía tradicional ya que permite el análisis tridimensional de biofilms. A menudo no apreciado, esto es extremadamente importante como biofilms son ingenio heterogéneah respecto a la composición de especies y la posición espacial, así como las condiciones fisiológicas se imponen en diferentes lugares espaciales dentro del biofilm 6,21. En concierto con software tridimensional de renderizado y software de análisis de imagen, la arquitectura biofilm, las relaciones espaciales entre las especies componentes, y el alcance de la matanza antimicrobiana puede ser analizado 22-24. Estas habilidades no son posibles con luz transmitida estándar o microscopía de epifluorescencia. A continuación, la microfluídica ha obtenido una atención especial en el campo de la microbiología, ya que permite el estudio de biofilms en condiciones cuidadosamente controladas (flujo, temperatura, pH, etc.) y sólo requiere pequeños volúmenes de líquido 25-27. Como punto de comparación, el crecimiento de un biofilm oral en la saliva humana dentro de un sistema modelo de celda de flujo (un sistema que se considera posiblemente el modelo de apoyo principal para muchos estudios de biofilm oral) durante 20 horas a una velocidad de flujo similar y de cizallamiento que el logradoen un sistema de microfluidos requiere por lo menos 200 ml, en comparación con 800 l en el dispositivo de microfluidos 28-31. Por lo tanto, un sistema modelo biofilm microfluidos permite el estudio de los materiales cantidad limitada bajo condiciones definidas. Por último, la tecnología de pirosecuenciación se ha optimizado en la última década para requerir sólo pequeñas cantidades de material para llevar a cabo un análisis de la comunidad y es suficientemente versátil para controlar la profundidad de la secuenciación para obtener la identidad de las especies del biofilm incluso raros. El uso de esta tecnología, tales como bacterias etiqueta codificada FLX amplicón pirosecuenciación (bTEFAP), ha permitido preguntas pertinentes sobre la ecología de las biopelículas que se abordarán 32,33. Tales preguntas imbuidos dificultades en el pasado, cuando pirosecuenciación no estaba disponible debido al tiempo y los costes necesarios para crear bibliotecas de plásmidos y las complejas medidas tecnológicas y analíticas necesarias para obtener datos de 33,34. Por supuesto, una gran ventaja con independiente del cultivo apenfoques, tales como la pirosecuenciación, es que las especies bacterianas que no se pueden cultivar en el aislamiento dentro de los medios de laboratorio convencional (es decir, especies viables pero no cultivables) pueden ser cultivadas e identificadas en el sistema de modelo y su abundancia relativa en la comunidad cuantificaron 35, 36 . Para añadir perspectiva, tan pronto como 1963, el difunto Sigmund Socransky estima que aproximadamente el 50% de las bacterias en el material aisladas de la grieta gingival oral humana no podía cultivarse usando las condiciones de crecimiento de laboratorio 37.

El objetivo de este trabajo es describir los métodos de enfoque para desarrollar biofilms de especies múltiples orales en un sistema de microfluidos disponible comercialmente (BioFlux) en: (i) las condiciones representativas de la cavidad oral humana y (ii) con una composición y abundancia de especies que es comparable a la placa supragingival. Además, utilizando tanto software freeware y comercial, destacamos biofilm lo básicomedidas arquitectura se pueden derivar de los datos CLSM, con un enfoque en los enfoques para cuantificar la biomasa biopelícula, la rugosidad y la viabilidad (basadas en la tinción Live / Dead). Por último, se describen los pasos necesarios para cosechar material de biopelícula para el análisis de la diversidad por bTEFAP.

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Protocol

El protocolo de recogida de saliva se describe en este documento fue revisado por la Universidad de Michigan Institucional Review Board for Human Subject Investigación.
NOTA: Con respecto a las revisiones institucionales de trabajo sujeto humano de este tipo, los acuerdos anteriores y los permisos deben ser recogidas de la institución anfitriona. En particular, dependiendo de la institución, el IRB o aprobación ética que tenga que ser tratado y aprobado antes de la recogida de saliva de voluntarios humanos puede continuar. Como una ayuda para la preparación de una aplicación, un útil NIH algoritmo / gráfico se puede encontrar aquí: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Preparación de la Canasta de saliva para el uso como un medio de crecimiento ambientalmente Germane

  1. Reclutar> 5 personas para la donación de saliva. No tome ninguna información de identificación, asegúrese de no individudel als donará saliva si están enfermos o han tomado antibióticos orales en los últimos 3 meses, o han consumido alimentos o líquidos, con excepción del agua, en el 2 horas antes de la donación anterior.
  2. Recoger saliva en tubos de plástico 50 ml. Agrupar la saliva recogida en un vaso de precipitados de plástico, manteniéndolo en hielo. No utilizar vidrio como polímeros en la saliva se adhieren a las superficies de vidrio internos.
  3. Añadir ditiotreitol (DTT) a una concentración final de 2,5 mM de una reserva de 100x. (Stock se congela en un solo uso alícuotas a -20 ° C). Se agita durante 10 min en un vaso de precipitados de plástico en hielo.
  4. Con el fin de eliminar la materia en partículas, centrifugar la saliva agrupado de 30 min a 17.500 x g.
  5. Diluir la saliva con 3 volúmenes de dH 2 O para dar un cuarto saliva concentrado.
  6. Filter-esterilizar saliva usando 0,22 micras polietersulfona (PES), filtro de baja unión a proteínas. Utilice el filtro con gran superficie, o utilizar varios filtros pequeños de la zona. Mantenga la saliva en unarecipiente de plástico en el hielo mientras se filtra.
  7. Congelar la saliva agrupado a -80   ° C en tubos de plástico de 50 ml hasta que se necesite para crecer bacterias. Cada tubo de plástico es para un solo uso y no debe contener más de 35 ml como cada pocillo de microfluidos tiene un máximo de 1,2 ml (1,2 ml x 24 pozos = 28,8 ml) y se necesita espacio en cada tubo como saliva se expande durante la congelación.
  8. Para su uso, descongelar la saliva agrupado a temperatura ambiente. Una vez descongelado, filtro-esterilizar una vez más (0,22 micras polietersulfona, filtro de baja unión a proteínas para eliminar cualquier precipitado).

2. Preparación de la Canasta de saliva para el uso como un inóculo

  1. Reclutar> 5 personas para la donación de saliva. No tome ninguna información de identificación, asegúrese de no individuos donan saliva si están enfermos, han tomado antibióticos orales en los últimos 3 meses, o haber consumido alimentos o líquidos, con excepción del agua, en el 2 horas antes de la donación anterior. Recoger samples más de 30 min.
  2. Recoger saliva en tubos de plástico de 50 ml a temperatura ambiente y en común la saliva recogida en un vaso de precipitados de plástico a temperatura ambiente.
  3. Diluir saliva combinado con glicerol esterilizada en autoclave grado reactivo en general para producir una acción con una relación final de 25% de glicerol, saliva que contiene células 75% [CCS].
  4. Congelar saliva a -80 ° C en 3 ml de un solo uso alícuotas hasta que se necesite.
  5. Cuando sea necesario para inocular el sistema de microfluidos, alícuotas se descongelaron a temperatura ambiente y se agitaron suavemente en un vórtex durante 5 segundos antes de ser pipeteó en el sistema de microfluidos como se describe en el paso 3 del protocolo, a continuación.

3. El crecimiento de biopelículas orales múltiples especies

  1. Pretratamiento CFS
    1. La primera mano los canales de microfluidos BioFlux con SFC. Añadir 100 l de CFS a cada punto de venta también. Utilizando el software de control BioFlux, seleccione flujo "manual" y establecer canales de Tha "B1-B24"t se van a utilizar.
    2. A continuación, establezca la cizalladura a 1,0 dinas / cm² y comenzar el flujo durante 2 minutos a temperatura ambiente para asegurar una distribución homogénea de los CFS a lo largo del canal. Asegúrese de que haya fluido en cada canal de entrada para verificar que el SFC fluía a través de todos los canales de manera uniforme.
    3. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 20 min.
    4. Retire la solución / pretratamiento CFS que permanece en los pozos de salida y traslado a los pozos de entrada. Este volumen total de 100 l servirá para equilibrar en contra de la presión que se aplica al inóculo de la toma de bien.
  2. Inoculación
    1. Para cada salida bien, añadir 100 l de CCS inóculo. Colocar la placa de microfluidos en la placa de calor (temperatura ajustada a 37 ° C), seleccione manual en el software de control, y establecer el flujo de salida de los pozos a los pocillos de entrada (es decir, hacia atrás) en 1,0 dinas / cm² durante exactamente 6 seg.
    2. Incubar la placa de microfluidos a 37 ° C durante 40 min para permitirpara la adherencia y el crecimiento de las bacterias en el inóculo inicial.
  3. Crecimiento Noche
    1. Para los canales inoculados se utilizan, aspirar el inóculo de residuos de cada uno de los pocillos de salida. Agregue hasta 1 ml de volumen total de CFS en cada uno de los pozos de entrada (se puede hacer en la parte superior del SFC existente).
    2. Incubar la placa de microfluidos a 37 ° C, seleccione manual y establecer el programa se ejecute en el 0,2 dinas / cm² durante 20 horas.
  4. Prelavado a las manchas
    1. Aspirar todo el líquido de los pocillos de entrada y salida y añadir 100 l de PBS (pH 7,4) a cada uno de los pocillos de entrada. El flujo durante 20 minutos a 0,2 dinas / cm².
  5. Además de la mancha mezcla de
    1. Para la tinción de viabilidad celular hacer 100 l de mezcla de tinción para cada canal a ser manchada. En concreto, añadir 3 l de SYTO 9 y 3 l de yoduro de propidio por ml de PBS utilizando el kit de tinción viabilidad celular comercial como LIVE / DEAD. Esto generauna mezcla de tinción que contiene 10 mM SYTO 9 y 60 mM de yoduro de propidio.
    2. Aspirar el PBS restante de los pozos de entrada y luego añadir 100 l de la mezcla mancha viabilidad celular a cada entrada también. Conjunto para fluir a 0,2 dinas / cm 2 y ejecutar la solución de entrada a la salida durante 45 min a temperatura ambiente.
  6. Lavado post-tinción
    1. Aspirar la mancha que queda en cada uno de los pozos de entrada y añadir 100 l de PBS a cada entrada bien. Conjunto para fluir a 0,2 dinas / cm² y ejecutar la solución de PBS de entrada a la salida durante 20 min a temperatura ambiente para eliminar cualquier exceso de colorante.

4. Imagen de la colección, la representación 3D, y Análisis de Imágenes

  1. Utilice un microscopio de barrido láser confocal invertido (CLSM) para recoger datos de imagen biofilm del sistema de microfluidos. Asegúrese de que el CLSM es capaz de soportar el peso de la placa BioFlux, que puede alcanzar los 150 g.
    NOTA: Dada la moneda de diez centavosnsions de los canales de microfluidos, la necesidad de sensibilidad para discernir estructura del biofilm, y los requisitos para la detección de la señal de fluorescencia de intensidad variable, se ajustan a la CLSM con un 40X 1,25 NA lente del objetivo o uno con similar calidad óptica, ampliación y apertura numérica.
  2. Estandarizar las puertas de captura de emisiones con ganancia y compensación de las mediciones que se mantienen constantes. Asegúrese de que la potencia del láser no supera el 25%, ya que esto puede resultar en foto-blanqueo.
  3. Convertir archivos MBRC del EICA L mago F tipo ile (LIF) para OME (O pluma M edio A mbiente icroscopy) tipo de archivo. Esto permite una mayor facilidad de acceso y la compatibilidad entre los programas de software. Utilice el software disponible en el mercado, tales como, Imaris para convertir archivos de este tipo.

Representación 3D de Imágenes / Cifras

  1. Una vez convertidos a formato OME, utilice el software disponible comercialmente como Imaris para construir las imágenesen 3D. Realice esta usando una combinación de opciones "superan" "Easy3D" y.
    Debe hacerse Atención a la señal de fondo y de umbral: NOTA. La función de histograma en Imaris se puede utilizar para obtener el rango de recogida y esta debe mantenerse constante entre las imágenes que se analiza.
  2. Guarde las imágenes usando la función de "instantánea" y hacer una cuidadosa consideración a la resolución de imagen antes de guardar tipos de archivos.
  3. Montar imágenes en figuras utilizando software de edición de imagen, tales como CorelDraw o Adobe Illustrator.

Análisis de imágenes 3D para gráficos y tablas

  1. Utilice libremente disponible ImageJ 23 y COMSTAT / COMSTAT2 38 para el análisis de imágenes. Descargue los paquetes de http://rsb.info.nih.gov/ij/ y http://comstat.dk/, respectivamente. Haga que la actualización más reciente de Java instalada.
    NOTA: necesitará el JAVA plataforma de software para ser instalado prior para el uso del software de análisis de imagen.
    1. Utilice el software ImageJ con COMSTAT2 plugin para importar los archivos OME para cada imagen biofilm en el modo "HyperStack" y la vista con "canales divididos".
    2. Analizar individualmente los dos canales (rojo / propidio-yoduro / canal de ser muertos 0, / siendo VIVO canal verde / SYTO-9 1) mediante la función "histograma" de ImageJ. Esta función muestra el número total de píxeles de archivos OME 8 bits (que se muestran como "recuento") en cada una intensidad de color de 0 a 255 (que se muestra como "valor"), siendo 0 píxeles sin señal (fondo) y 255 bienestar píxeles con saturación de la señal completa.
    3. Exportar los datos en un programa de hoja de cálculo y estandarizar todos los valores de la señal mediante la ponderación de cada píxel de la intensidad de la señal correspondiente. Esto se realiza multiplicando el recuento total a una intensidad de señal dada por el valor de 8 bits numérico (0-255) de que la intensidad de la señal.
    4. Sume todos los valores ponderados, 0-255, para ambos canales para cada imagen capturada biofilm. Tome la suma de los valores ponderados para ambos canales para determinar la señal total por ciento de cualquiera de los canales. Haga esto para determinar la relación familiar o ciento por ciento rojo y señal verde (es decir, el porcentaje "muerto" y el porcentaje de "LIVE" para cada tratamiento).
    5. Realizar los análisis estadísticos, por ejemplo, utilizando dos colas t de Student modificado para varianza desigual. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos y los valores de p <0,01 se consideran altamente significativa.

5. Las células cosecha Biofilm para el Análisis Cultura-independiente

  1. Quite toda la saliva gastado y sin uso de pozos de entrada y salida. Lavar los pocillos con 1 ml de agua destilada estéril tres veces.
  2. Añadir 100 l de agua destilada estéril a los pocillos de entrada y, utilizando la interfaz de control de software, pasar elagua destilada estéril hacia adelante a través de los canales a> 8,0 dinas / cm 2 (caudal> 745 l / h, cizalla de 800 s-1) durante al menos 5 minutos. Repita en la dirección inversa durante al menos 5 min y luego repetir el proceso hacia adelante y etapa de lavado inversa.
  3. Compruebe por la luz o por microscopía de epifluorescencia (si se tiñeron células / marcado) para la eliminación del biofilm a fondo (Figura 2). Recoger el 100 l suspensión celular y se almacena a -80 ° C para el análisis de la cultura independiente. Un análisis costo-efectiva de composición de la comunidad se puede lograr mediante el uso de bacterias FLX pirosecuenciación amplicón etiqueta codificada (bTEFAP) utilizando el enfoque descrito en Nance et al. 20

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Representative Results

Representación 3D de biopelículas

Los resultados representativos se muestran en la Figura 3. Una herramienta útil en el software Imaris es la opción para examinar cada rebanada de la pila de biofilm recogido y combinarlos para crear reconstrucciones tridimensionales. Además, los efectos de sombreado artificiales se pueden añadir para ayudar a interpretar visualmente estructuras tridimensionales. Los biofilms prestados pueden orientarse en cualquier dirección con diferentes aumentos para explorar biofilm o micro-colonia estructura. Las imágenes presentan en la Fig. 3 muestran el resultado del tratamiento de un biofilm de múltiples especies oral. De particular interés es que el tratamiento con etanol al 70% resultó en el cambio de color significativo para la mayoría de la biopelícula (de verde a rojo), lo que sugiere muerte celular significativa o células de daños. Los grandes micro-colonias parecían contener más células muertas de las células micro-colonias subyacentes (y ahora expuestas). Such resultado se debe posiblemente a la de-adhesión de las células del biofilm porque el etanol es un antimicrobiano-membrana activa. Mediante la conversión de los archivos a OME formato y el análisis de las pilas prestados en ImageJ, se puede ver mediante la aplicación de funciones de histograma que la cantidad de señal roja y verde es inversamente proporcional entre las biopelículas no tratados y los tratados con etanol.

Cuantificación de la biopelícula Propiedades

La Tabla 1 muestra los promedios y las desviaciones estándar de los parámetros estructurales clave. Una ventaja clave para usar Imaris, ImageJ y COMSTAT, es que si Imaris se utiliza en primer lugar, los archivos OME se pueden generar para permitir que los archivos que se pipeline través ImageJ y COMSTAT. Los datos de la muestra se presentan en la Tabla 1 muestra que el tratamiento de los biofilms orales con etanol al 70% resultó en una caída muy significativa en la viabilidad de 80,8% a 28,3%. El etanol puede causar algún daño celular y c estructuralambios en biofilms, pero esto es a menudo veces no mensurable significativamente diferentes. Aquí, no hay diferencias en las medidas de biovolumen promedio, el espesor promedio y la rugosidad promedio fueron detectados (Tabla 1).

Figura 1
Figura 1. El sistema de biofilm oral de microfluidos BioFlux. (A) Un diagrama que muestra una sección transversal vertical del sistema BioFlux mientras está montado en un CLSM SPE invertida. (B) Un anotado (líneas negras) fotografía destacando dos canales de microfluidos y los pozos de entrada y salida. (C) Un ejemplo de un biofilm mostrada bidimensional Live / Dead manchado oral que ha sido tratada con una solución de CPC 0,01%, resultando en muerte heterogénea, en parte debido a la limitación de la difusión de reacción. El color verde indica células vivas, manchadoscon Syto 9; células de color rojo están muertos o dañados y se tiñeron con yoduro de propidio Fig. 1A y 1B de Nance et al. 20 con permiso. Bar en la Fig. 1C representa 30 micras.

Figura 2
La Figura 2. El uso de microscopía confocal de barrido láser (CLSM) para generar dos vistas dimensionales y tridimensionales de biofilms prestados 20 hr. Estas biopelículas se desarrollaron en la saliva libre de células agrupadas (CFS) a partir de un inóculo de saliva que contiene células agrupadas (CCS). Una comunidad biofilm sin tratar (izquierda columna de imágenes) se compara contra un tratado con etanol comunidad biofilm 70% y un biofilm representativo se muestra en diferentes planos de vista (XY, XZ, y ZYZ). Los histogramas que muestran las diferencias en rojo (células muertas / dañados) y verde (células vivas) unre mostrado para cada pila de imágenes (datos registrados muestran en datos de color negro y no registradas que aparecen en gris). Todos los datos se deriva de imágenes de 8 bits y por lo tanto en una escala de 0-255 (256 incrementos). Las barras de escala representan 30 micras.

Figura 3
Figura 3. Diagrama de flujo que demuestra el resultado de la extracción / recolección de 20 hr oral de biofilm de múltiples especies (desarrollado a partir de un inóculo de CCS en que fluye CFS) desde el dispositivo de microfluidos BioFlux utilizando la técnica de cizallamiento / flujo elevada. Las líneas de puntos se han aplicado a las imágenes para ayudar a determinar la ubicación de las paredes del canal. La composición de la comunidad de la biopelícula cosechado se puede analizar mediante pirosecuenciación 454 tecnologías tales como bacterias etiqueta codificada FLX amplicón pirosecuenciación (bTEFAP) y se expresa en múltiples niveles taxonómicos (phylum a través de las especies), dependiendo de requirements. Se muestra un ejemplo de la composición de la comunidad, a nivel de filo, de biofilms cosechadas de tres canales de microfluidos. Las barras representan escala en micrómetros.

Parámetro / Tratamiento Si no se trata 70% EtOH
Viabilidad media (%) 80,8 (0,9) 28,3 (5,8) **
Biovolumen media (m 3 / m 2) 17,7 (8,4) 16,1 (3,0)
Espesor medio (m 2) 23,3 (11,3) 15,6 (6,4)
Rugosidad media 0,4 (0,3) 0.50 (0.2)

Tabla 1. Cuantificación de las propiedades del biofilm de etanol sin tratar y 70% de los tratados 20 hr biofilms desarrollados en la saliva libre de células agrupadas (CFS) de una saliva que contiene células de inóculo (CCS). Los valores en negrita son los promedios y valores no negrita entre paréntesis son las desviaciones estándar. Los datos son de al-menos cinco imágenes de tres canales de microfluidos. Las diferencias significativas en el control sin tratar se destacan con un asterisco (** p <0,01%).

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Discussion

Este documento pone de relieve los métodos pasos básicos necesarios para configurar y ejecutar un sistema de microfluidos de manera de permitir el desarrollo de biopelículas de especies múltiples orales derivados de agrupado saliva humana y cultivadas en esterilizada por filtración 25% agrupado saliva humana. Se dan aproximaciones para caracterizar el biofilm, pero cabe recordar que estos enfoques descritos son modificables y tecnologías adicionales como, por ejemplo, manchas o etiquetas se pueden introducir. Como cuestión de ejemplo, se podría utilizar concebible anticuerpos marcados o introducir una cepa fluorescente para visualizar y examinar la posición espacial de ciertas especies dentro de la biopelícula oral de múltiples especies. Además, dependiendo del modelo del sistema de microfluidos que se utiliza, es posible desarrollar biofilms en condiciones anaerobias (en el caso del sistema de BioFlux, una nota técnica está disponible en Fluxion.com sobre este tema).

Un aspecto clave para la microfluido BioFluxsistema ic es su compatibilidad con múltiples tecnologías y esto se pone de relieve aquí por la capacidad de realizar la diversidad cultura análisis independientes (Figura 3). Mientras que las superficies internas del sistema de microfluidos no son fácilmente accesibles, vigoroso hacia adelante y flujo inverso no permitir que la biomasa sustancial biofilm que ser eliminado. Si bien toda la biopelícula no se puede quitar fácilmente y esto podría ser considerado una debilidad en el sistema, es pertinente señalar que muchos sistemas modelo de biofilm también tienen un problema similar y las reclamaciones de cualquier tipo de datos recogidos han de ser templado con este conocimiento . Por ejemplo, es posible que la abundancia de los estreptococos podría ser mayor en la biopelícula que en realidad determinado experimentalmente debido a que muchas especies de Streptococcus tienen excepcionalmente buenas capacidades para unirse a superficies recubiertas de saliva 39.

Al igual que con todos los sistemas modelo de biofilm, uno tiene que ser consciente de las preguntas que se hacen. Fo ejemplo, este sistema no sería adecuado para estudios longitudinales a largo plazo. Un sistema de modelo tal como un reactor constante película de profundidad, un sistema Sorbarod, o un reactor de goteo podría ser más adecuado 40-42. Aunque, el problema de cantidades limitadas de saliva para un sistema de modelo se convierte en un problema ya que estos no son diseños basados ​​microfluidos. En una luz similar, sin embargo, el sistema BioFlux descrito aquí también podría ser adaptado para el estudio de las biopelículas en otros entornos en los fluidos biológicos están disponibles sólo en pequeñas cantidades. Por ejemplo, esto podría incluir la orina y exudado de la herida.

En conclusión, al igual que con cualquier sistema de modelo in vitro, uno tiene que ser consciente de las fortalezas y debilidades del sistema de microfluidos para el crecimiento de biopelículas orales. Mientras que el sistema de microfluidos es posiblemente pertinente para el medio ambiente y permite el desarrollo de biopelículas que son de composición similar a la situación in vivo, no se the igual que la situación in vivo y es probable que nunca sea así. Un sistema de modelo de laboratorio es sólo tan buena como sus supuestos y con el sistema de microfluidos tiene muchas coincidencias con las condiciones dentro de la cavidad oral humana, factores tales como los efectos basados ​​en host y biótico externa y desafíos abióticos (por ejemplo a través de beber y de comer) no pueden ser fácilmente replicado. Está claro, sin embargo, que la naturaleza de alto rendimiento, así como la microbiológica ambiental y las superposiciones con la situación oral real mundial hacen de este un sistema de microfluidos atractivo para hacer predicciones antes de participar en estudios clínicos logísticamente difíciles.

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Acknowledgments

Los autores agradecen a William Nance (Universidad de Michigan) para obtener ayuda en la formulación de los protocolos de crecimiento del biofilm y Juan Battista (Fluxion, San Francisco, CA) para obtener asesoramiento sobre cuestiones tecnológicas relacionadas con el sistema BioFlux. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH: R21DE018820 a AHR) y la Universidad de Michigan fondos iniciales para AHR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

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References

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El uso de un gran procesamiento<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema de microfluidos para el Desarrollo de biopelículas orales múltiples especies
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Samarian, D. S., Jakubovics, N. S.,… More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

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