Summary
מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את השימוש במערכת microfluidic לפיתוח biofilms רב-מינים המכילים מינים מזוהים בדרך כלל ברובד השיניים supragingival אנושי. שיטות לתיאור ארכיטקטורת biofilm, כדאיות biofilm, וגישה לbiofilm קציר לניתוחים תלוית תרבות או תרבות העצמאית מודגשות.
Abstract
יש תפוקה גבוהה כמה במערכות חוץ גופית שתקלנה על הפיתוח של biofilms רב-מינים המכילים מינים רבים מזוהים בדרך כלל בתוך in vivo biofilms האוראלי. יתר על כן, מערכת המשתמשת ברוק אנושי טבעי כמקור התזונתי, במקום תקשורת המלאכותית, במיוחד רצויה על מנת לתמוך בביטוי של מאפיינים סלולריים וbiofilm ספציפי המחקים את in vivo הקהילות. אנו מתארים שיטה לפיתוח רב-מינים biofilms האוראלי כי הם דומים, ביחס להרכב מינים, לsupragingival רובד שיניים, בתנאים דומים לחלל הפה האנושי. באופן ספציפי, מאמר שיטות זה יתאר כיצד מערכת microfluidic זמינה מסחרי יכולה להיות מותאם כדי להקל על הפיתוח של biofilms האוראלי רב-מינים שמקורם וגדלה בתוך רוק נקווה. יתר על כן, תיאור של איך המערכת יכול לשמש בשילוב עם confocaמיקרוסקופ סריקת לייזר l לייצר שחזורי biofilm 3-D עבור ניתוחי כדאיות אדריכליים ויוצג. בהתחשב במגוון הרחב של מיקרו-אורגניזמים הגדלים בתוך biofilms במערכת microfluidic (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, וPorphyromonas), פרוטוקול יהיה גם הציג מתאר כיצד לקצור את תאי biofilm לתת-תרבות נוספת או מיצוי DNA וניתוח. גבולות הן את מערכת biofilm microfluidic ומנתח את הנתונים הנוכחיים מדינה-of-the-האמנות יטופלו. סופו של דבר, הוא חזה שמאמר זה יספק טכניקה בסיסית שתשפר את המחקר של biofilms האוראלי ולסייע בפיתוח של טכנולוגיות נוספות שיכול להיות משולבת עם פלטפורמת microfluidic.
Introduction
Biofilms הם ארכיטקטוני קהילות מורכבות של חיידקים המצטברות על משטחי 1. קהילות אלה מכילים בדרך כלל מינים רבים הפועלים באינטראקציה אחד עם השני בתוך biofilm 2. biofilms האוראלי, רובד השיניים להיות ביותר מבחינה ויזואלית הבולט, הוא בעיה מתמשכת בבני אדם ותוצאות הפיתוח בלתי מבוקרות שלהם בדור של קהילות רב-מינים טקסונומית מגוונות 3. חיידקי המרכיב של קהילות המגוונות אלה יכולים להיות עד 1,000 פעמים יותר עמידות לאנטיביוטיקה מאשר עמיתיהם משתנה חופשיים (פלנקטון) 4-6. כישלון לטיפול ביישובים אלה אוראליים biofilm, אשר יכול לגרום לעששת ומחלת חניכיים, הביא נטל משמעותי על בריאות ציבור: למעלה מ -500 מיליון ביקורים במשרד רופא השיניים בשנה בארה"ב, וכ -108 מליארד דולרים לטיפול באו למנוע חניכיים מחלה ועששת 7.
תוכן ">" בעוד מיקרוביולוגים רבים תומכים בלימוד התנהגות של חיידקים בתנאים טבעיים, כמה מהם לעשות זאת. סיבה לכך הוא המורל שלהם להתגבר על הקשיים מתפוגג ללא הרף על ידי הקלות אטרקטיביות של עבודה עם תרבויות מעבדה. "-Smith 8.נכון לעכשיו, מחקר biofilm אוראלי מתבצע תוך שימוש במגוון של in vivo ובגישות חוץ גופית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משל 9,10. במבחנה גישות לעתים קרובות משתמש במערכות biofilm מודל שהנן קלים יחסית להגדיר אבל ייתכן חוסר קליני / רלוונטי בעולם האמיתי 10,11. בvivo גישות בדרך כלל להסתמך על מערכות מודל חיה שעלול להתרבות היבטים מסוימים של סביבת הפה האנושית, אבל שוב סובלים ממגבלות בשל הבדלים באנטומיה, פיזיולוגיה, מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה בין חיות ובני האדם 12, 13. יש לציין כי biofilms האוראלייכול להיות גם שפותח על משטחי אמייל שנערכו בסטנט בתוך הפה של מתנדבים אנושיים, אבל גישה זו היא כיום יחסית יקרה ועתירת עבודה 14,15. סופו של דבר, סוכנים או טכנולוגיות לשיפור בריאות פה רומן נבדקים בבני אדם בתנאי ניסוי קליניים מבוקרים 11. נכון לעכשיו, דרך פעולה לעתים קרובות נעשה שימוש לזיהוי והערכת סוכני בריאות פה חדשים היא לבצע מחקרי המעבדה ראשון להבחין ביעילות פוטנציאלית, ולאחר מכן לבצע מחקרים בבעלי חיים ו" שדה ניסויים "שמעסיקים רופאים להעריך את ההצלחה של הטכנולוגיה 9, 16,17. למרבה הצער, מחקרי מעבדה נוטים להסתמך על מערכות מודל שמעסיקות את טביעת רגל גדולה, הם מבחינה טכנולוגית מאתגרים לשימוש, ולעתים קרובות מכיל פשוטים קהילות של אחד או לכל היותר כמה מינים לגזור עולם אמיתי פוטנציאלי כלומר 10,18. בהתחשב בכך שbiofilms רובד שיניים מכיל מינים וצורה מרובים בcomplלשעבר זורם סביבת רוק, פיתוח biofilms המכיל אחד או כמה מינים בתקשורת מלאכותית סביר כדי ליצור קהילות שמתנהגות באופן דומה לאלה בתרחיש של עולם אמיתי 10,19. כדי לטפל בזמן, העלות, דרישות הכשרה, ואת אופי הנציג הירוד של מערכות biofilm מודל מעבדה בהשוואה לסביבה בעולם האמיתי, לאחרונה פיתחו מערכת biofilm שמקורן הסביבה 20 (איור 1) תפוקה וגבוהה. יתרונות המערכת מהשימוש ברוק תא ללא במאגר אנושי (CFS) כמו רוק בינוני ולא מטופל ונקווה אדם בקטריאלי המכיל תא (CCS) כבידוד. באופן ייחודי, המערכת משלבת גם טכנולוגית microfluidic, מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal, וטכנולוגיה ניתוח מגוון חיידקי תרבות עצמאית. לפיכך, מערכת המודל הוא רוק שמקורן הסביבה (באמצעות כבידוד לגדול biofilms רבי מינים ב 37 ° C בזורם מעוקר מסנןרוק) וbiofilms האוראלי מכילים מינים (כולל Streptococcus, Neisseria, Veillonella, ומיני Porphyromonas) בנציג שכיחותם של אלה שנמצאו ברובד supragingival המוקדם 20.
כאשר בהתחשב בכך שעבודה זו מתארת את השימוש במערכת המודל חדש שפותחה, תשומת לב מיוחדת יש לתת למיזוג של מיקרופלואידיקה מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM), וטכנולוגיות ניתוח גיוון תרבות עצמאית. האיחוד של טכנולוגיות אלה על ידי קבוצת המחקר שלנו היה מכוון ולא רק מוסיף יכולת תפוקה גבוהה למערכת המודל החדש שפותחה, אלא גם מאפשר לי שאלות שיש לשאול שלא יכולות להיות בקלות לטפל לפני עם מערכות אחרות. ראשית, יש CLSM יתרונות ברורים על פני מיקרוסקופיה המסורתית שכן היא מאפשרת לניתוח תלת-ממדי של biofilms. לעתים קרובות שלא מעריכים, זה חשוב מאוד כbiofilms הוא שנינות הטרוגניתכבוד h להרכב מינים ומיקום המרחבי, כמו גם את התנאים הפיסיולוגיים שהוטל במקומות שונים במרחבי biofilm 6,21. בתיאום עם תוכנה תלת ממדי טיוח ותוכנת ניתוח תמונה, ארכיטקטורת biofilm, יחסים מרחביים בין מיני רכיב, והרג מיקרוביאלית מידה ניתן לנתח 22-24. יכולות כאלה אינן אפשריות באמצעות אור רגיל שמועבר או מיקרוסקופיה epifluorescence. בשלב הבא, מיקרופלואידיקה זכתה לתשומת לב מיוחדת בתחום מיקרוביולוגיה כפי שהיא מאפשרת המחקר של biofilms בתנאים מבוקרים היטב (זרימה, טמפרטורה, pH, וכו '), ורק דורשת כמויות קטנות של 25-27 הנוזלי. כנקודת השוואה, גידול biofilm אוראלי ברוק אנושי בתוך מערכת מודל תא זרימה (מערכת שנחשבת למודל התווך למחקרים רבים biofilm אוראליים לטעון) במשך 20 שעות בספיקה וגזירה דומות לזה שהושגבמערכת microfluidic דורש לפחות 200 מיליליטר, בניגוד ל -800 μl במכשיר microfluidic 28-31. לפיכך, מערכת biofilm מודל microfluidic מאפשרת העיון בחומר מוגבל כמות בתנאים מוגדרים. לבסוף, טכנולוגית pyrosequencing כבר מותאמת בעשור האחרון לדורשת רק כמויות קטנות של חומר לבצע ניתוח קהילה ומספיק תכליתי כדי לשלוט עומק של רצף כדי לקבל את הזהות של מיני biofilm אפילו נדירים. השימוש בטכנולוגיה זו, כגון pyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP), אפשר לשאלות רלוונטיות הנוגעות לאקולוגיה של biofilms לטפל 32,33. שאלות מסוג זה חדורים קשיים בעבר כאשר pyrosequencing לא היה זמין בגלל הזמן והעלויות הנדרשות ליצירת ספריות פלסמיד ונדרשו להפיק נתונים 33,34 צעדים טכנולוגיים ואנליטיות המורכבים. כמובן, יתרון גדול עם ap התרבות העצמאיתגישות, כגון pyrosequencing, היא שמיני חיידקים שלא ניתן לגדל בבידוד בתוך תקשורת מעבדה הקונבנציונלית (מינים ברי קיימא כלומר אבל אינם ראויים לעיבוד חקלאי) ניתן לגדל וזיהו בתוך מערכת המודל והשפע היחסי שלהם בקהילה לכמת 35, 36 . כדי להוסיף נקודת מבט, מוקדם ככל 1963, זיגמונד Socransky מאוחר ההערכה היא כי כ -50% מהחיידקים בחומר המבודדים מנקיק החניכיים הפה האנושי לא יכולים להיות מתורבת באמצעות תנאי גידול מעבדה 37.
מטרת נייר שיטות זה היא לתאר את הגישה לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים במערכת microfluidic זמינה מסחרי (Bioflux) תחת: נציג תנאים (i) של חלל הפה האנושי ו( ii) עם הרכב מינים ושפע ש דומה לשלט supragingival. יתר על כן, שימוש בשתי תוכנות חופשית ומסחריות, אנו מדגישים biofilm איך בסיסיניתן לגזור אמצעי ארכיטקטורה מנתוני CLSM, עם דגש על גישות לכמת ביומסה biofilm, חספוס, ואת כדאיות (המבוסס על צביעה חי / מת). לבסוף, את הצעדים הנדרשים כדי לקצור חומר biofilm לניתוח גיוון ידי bTEFAP מתוארים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול אוסף הרוק המתואר כאן נסקר על ידי אוניברסיטת מישיגן Institutional Review Board לניסויים בבני אדם.
הערה: לגבי ביקורות מוסדיות לעבודת הסובייקט אנושית מסוג זה, צריכים להיות זכו הסדרים והרשאות מראש מהמוסד המארח. בפרט, תלוי במוסד, IRB או אישור אתיקה ייתכן שיצטרך לחפש ואושר לפני אוסף רוק ממתנדבים אנושיים יכול להמשיך. כסיוע להכנת בקשה, ניתן למצוא אלגוריתם / תרשים NIH שימושי כאן: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
1. הכנת נקווה הרוק לשימוש כצמיחה בינונית לסביבה שמקורן
- לגייס> 5 אנשים על תרומת רוק. אל תיקח את כל מידע מזהה, להבטיח שאין individuals יתרום רוק אם הם חולים, או לקחו אנטיביוטיקה דרך הפה ב -3 החודשים האחרונים, או שצרכו מזון או נוזלים, למעט מים, בשעת 2 הקודמת לפני התרומה.
- לאסוף רוק ב 50 צינורות פלסטיק מיליליטר. בריכת הרוק שנאסף בכוס פלסטיק, להשאיר אותו על קרח. אין להשתמש בזכוכית כמו פולימרים ברוק ידבק משטחי זכוכית הפנימיים.
- להוסיף dithiothreitol (DTT) לריכוז סופי של 2.5 מ"מ ממניות 100x. (צילומים קפוא בaliquots שימוש היחיד ב -20 מעלות צלזיוס). מערבבים במשך 10 דקות בכוס פלסטיק על קרח.
- על מנת להסיר חומר חלקיקים, צנטריפוגות הרוק נקווה למשך 30 דקות ב 17,500 x ז.
- לדלל את הרוק עם 3 כרכים של DH 2 O לתת רבע רוק מרוכז.
- סנן לעקר רוק באמצעות 0.22 מיקרומטר polyethersulfone (PES), מסנן מחייב חלבון נמוך. השתמש במסנן עם שטח פנים גדול, או להשתמש במספר קטן מסנני אזור. שמור רוק במיכל פלסטיק על קרח תוך סינון.
- להקפיא את הרוק נקווה ב -80 מעלות צלזיוס בצינורות פלסטיק 50 מיליליטר צורך עד לגדול חיידקים. כל צינור פלסטיק מיועד לשימוש אחד בלבד וצריך להכיל לא יותר מ 35 מיליליטר ככל טוב microfluidic מחזיק מרבי של 1.2 מיליליטר (1.2 מיליליטר x 24 בארות = 28.8 מיליליטר) ומרחב נחוץ בצינור אחד כמו רוק מתרחב במהלך הקפאה.
- לשימוש, להפשיר את הרוק נקווה בטמפרטורת חדר. מופשר פעם, מסנן לעקר (0.22 מיקרומטר polyethersulfone, מסנן חלבון נמוך מחייב כדי להסיר כל משקעים) פעם נוספת.
2. הכנת נקווה הרוק לשימוש כבידוד
- לגייס> 5 אנשים על תרומת רוק. אל תיקח את כל מידע מזהה, להבטיח שאין אנשים יתרמו רוק אם הם חולים, לקחו אנטיביוטיקה דרך הפה ב -3 החודשים האחרונים, או שצרך מזון או נוזלים, למעט מים, בשעה 2 הקודמת לפני התרומה. לאסוף samples מעל 30 דקות.
- לאסוף רוק בצינורות פלסטיק 50 מיליליטר בטמפרטורת חדר וברכת הרוק שנאסף בכוס פלסטיק בטמפרטורת חדר.
- לדלל רוק במאגר עם גליצרול כיתה מגיב כללית autoclaved להניב מניות עם יחס סופי של גליצרול 25%, 75% רוק המכיל תא [CCS].
- להקפיא רוק ב -80 מעלות צלזיוס aliquots שימוש יחיד 3 מיליליטר עד צורך.
- בעת הצורך לחסן את מערכת microfluidic, aliquots מופשר בטמפרטורת חדר ונסער בעדינות על vortexer במשך 5 שניות לפני שpipetted למערכת microfluidic כמתואר בשלב 3 של הפרוטוקול, להלן.
3. צמיחה של Biofilms Multi-מינים שבעל פה
- טיפול מראש CFS
- שכבה ראשונה ערוצי microfluidic Bioflux עם CFS. הוספה של CFS 100 μl לכל נקודת מכירה היטב. tha "B1-B24" שימוש בתוכנת שליטת Bioflux, בחר זרימה "ידנית" ולהגדיר מערוציםt הוא לשמש.
- בשלב הבא, שנקבע גזירה ל1.0 דִין / cm² ולהתחיל זרימה למשך 2 דקות בטמפרטורת חדר כדי להבטיח חלוקה הומוגנית של CFS לאורך הערוץ. ודא שיש נוזלים בכל ערוץ כניסה כדי לוודא שCFS זרם דרך כל הערוצים באופן שווה.
- דגירה צלחת בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
- הסר את הפתרון / Pretreat CFS שנותר בבארות לשקע ולהעביר לבארות הכניסה. נפח כולל של 100 μl זה ישמש כדי לאזן נגד הלחץ שמופעל על הבידוד מהשקע בקיר גם.
- הִתחַסְנוּת
- לכל נקודת מכירה היטב, להוסיף הבידוד של CCS 100 μl. מניחים את צלחת microfluidic על צלחת החום (הטמפרטורה שנקבעה על 37 מעלות צלזיוס), המדריך לבוחר בתוכנת השליטה, והזרימה להגדיר מבארות שקע לבארות הכניסה (כלומר, להפוך) ברמה של 1.0 דִין / cm² בדיוק 6 שניות.
- דגירה את צלחת microfluidic על 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות, כדי לאפשרלדבקות וצמיחה של החיידקים בבידוד ראשוניים.
- צמיחת לילה
- לשימוש ערוצים מחוסן, לשאוב את הבידוד פסולת מכל אחת מהבארות לשקע. הוסף עד נפח כולל של 1 מיליליטר של CFS לכל אחת מבארות הכניסה (ניתן לעשות זאת על גבי CFS הקיים).
- דגירה את צלחת microfluidic על 37 מעלות צלזיוס, בחר ידני ולהגדיר את התכנית לפעול בדִין 0.2 / cm² במשך 20 שעות.
- כביסה מוקדמת כתם
- לשאוב את כל הנוזל מהבארות הכניסה ויציאה ולהוסיף של PBS 100 μl (pH 7.4) לכל אחד מבארות הכניסה. לזרום במשך 20 דקות ב 0.2 דִין / סמ"ר.
- בנוסף תערובת כתם
- עבור מכתים כדאיות תא להפוך את תערובת של כתם 100 μl לכל ערוץ להיות מוכתמת. באופן ספציפי, להוסיף 3 μl של 9 SYTO ו -3 μl של יודיד propidium לכל מיליליטר של PBS באמצעות ערכת צביעת כדאיות תא מסחרית כגון LIVE / DEAD. זה יוצרתערובת כתמים המכילה 10 מיקרומטר SYTO 9 ו -60 יודיד propidium מיקרומטר.
- לשאוב PBS שנותר מהבארות הכניסה ולאחר מכן להוסיף את התערובת של כתם כדאיות תא 100 μl לכל כניסה גם. הגדר לזרום על 0.2 דִין / 2 סנטימטר ולהפעיל את הפתרון מכניסה לפורקן 45 דקות בטמפרטורת חדר.
- לשטוף הודעה מכתימה
- לשאוב את הכתם שנותר בכל אחת מבארות הכניסה ולהוסיף של PBS 100 μl לכל כניסה גם. הגדר לזרום על 0.2 דִין / cm² ולהפעיל את פתרון PBS מכניסה לשקעים עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר כדי להסיר כל כתם עודף.
4. אוסף תמונה, 3D Rendering, וניתוח תמונה
- השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal הפוך (CLSM) כדי לאסוף נתוני תמונת biofilm ממערכת microfluidic. ודא שCLSM הוא מסוגל לעמוד במשקל של צלחת Bioflux, אשר יכול להגיע ל -150 גר '.
הערה: בהתחשב באגורהnsions של ערוצי microfluidic, את הצורך ברגישות להבחין מבנה biofilm, והדרישות לגילוי אותות הקרינה בעוצמה משתנה, כך שיתאים לCLSM עם עדשת 40X 1.25 NA אובייקטיבי או אחד עם איכות דומה אופטית, הגדלה, וצמצם מספרי. - מדידות לתקנן את שערי לכידת פליטה עם רווח לקזז נשמרו קבועות. ודא שעוצמת הלייזר אינה עולה על 25% כפי שזה יכול לגרום לצילום הלבנה.
- להמיר קבצי CLSM מeica L אני קוסם סוג ile F (LIF) לשת (nvironment E icroscopy M עט O) סוג קובץ. זה מאפשר בקלות רבה יותר של גישה ותאימות בין תוכנות. השתמש בתוכנה זמינה מסחרי כגון, Imaris להמיר קבצים מסוג זה.
Rendering 3D עבור תמונות / דמויות
- ברגע שהומרה לפורמט שת, להשתמש בתוכנה זמינה מסחרי כגון Imaris כדי להבהיר את התמונותב3D. לבצע את זה באמצעות שילוב של "Easy3D" ואפשרויות "לעלות".
הערה: שים לב לאות רקע וthresholding צריך להיעשות. פונקצית ההיסטוגרמה בImaris ניתן להשתמש כדי להשיג את טווח אוסף וזה חייב להישמר קבוע בין תמונות להיות מנותחות. - לשמור תמונות באמצעות הפונקציה "תמונת המצב" ולהפוך את שיקול דעת לרזולוציה של תמונה לפני שמירת סוגי קבצים.
- להרכיב תמונות לדמויות באמצעות תוכנה לעריכת תמונות כגון CorelDraw או Adobe Illustrator.
ניתוח תמונת 3D עבור גרפים וטבלאות
- השתמש זמין באופן חופשי ImageJ 23 וסטטמ"מ / COMSTAT2 38 לניתוח תמונה. הורד את החבילות מhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ וhttp://comstat.dk/, בהתאמה. התקין את עדכון Java האחרון.
הערה: JAVA פלטפורמת תוכנה צריכה להיות מותקן PRIOr לשימוש בתוכנת ניתוח תמונה.- השתמש בתוכנת ImageJ עם תוסף COMSTAT2 לייבא קבצים שתו עבור כל תמונת biofilm במצב "hyperstack" ותצוגה עם "ערוצים לפצל".
- בנפרד לנתח שני ערוצים (אדום / propidium יודיד / ערוץ מת יצור 0, / ערוץ LIVE להיות ירוק / SYTO-9 1) באמצעות הפונקציה "היסטוגרמה" של ImageJ. פונקציה זו מציגה את המספר הכולל של פיקסלים של קבצים שתו 8 סיביות (כפי שמוצגים "ספירה") בכל עוצמת צבע 0-255 (כפי שמוצגים "ערך"), עם 0 פיקסלים להיות ללא אות (ברקע) ו- 255 ישות פיקסלים עם הרוויה אות מלאה.
- לייצא את הנתונים לתוכנת גיליונות אלקטרוניים ולתקן את כל ערכי האות על ידי שקלול כל פיקסל על ידי עוצמת האות המקבילה. זו מבוצעת על ידי הכפלת המספר הכולל בעוצמת אות שניתנה על ידי הערך המספרי של 8 ביט (0-255) של שעוצמת האות.
- לסכם את כל הערכים המשוקללים, 0-255, לשני הערוצים עבור כל תמונת biofilm נתפסה. קח את סכום הערכים המשוקללים לשני הערוצים כדי לקבוע את האות כוללת אחוזים משני ערוצים. לעשות את זה כדי לקבוע את היחס או אחוזים ביחס אדום ואות ירוק אחוזים (כלומר אחוזים "מתים" ואחוזים "LIVE" לכל טיפול).
- לבצע ניתוחים סטטיסטיים, למשל באמצעות מבחן t שני זנב שונה לשונות בלתי שוויוניות. ערכים של p <0.05 נחשבים משמעותיים ואלה הערכים של p <0.01 נחשבים משמעותיים ביותר.
5. תאי הקציר Biofilm לניתוח תרבות עצמאי
- הסר את כל הרוק בילה ושאינו בשימוש מבארות כניסה ויציאה. לשטוף את הבארות עם 1 מיליליטר מים מזוקקים סטריליים שלוש פעמים.
- להוסיף מים מזוקקים סטריליים 100 μl לבארות כניסה ו, באמצעות ממשק שליטת תוכנה, להעביר אתמים מזוקקים סטריליים קדימה דרך הערוצים ב> 8.0 דִין / 2 סנטימטר (קצב זרימה> 745 μl / hr, גזירה של 800 שניות -1) במשך 5 דקות לפחות. חזור בכיוון ההפוך במשך לפחות 5 דקות ולאחר מכן לחזור על קדימה ולהפוך את תהליך שלב כביסה.
- בדוק על ידי אור או על ידי מיקרוסקופ epifluorescence (אם תאים היו מוכתמים / כותרת) להסרה יסודית biofilm (איור 2). לאסוף את תא ההשעיה 100 μl ולאחסן ב -80 ° C לניתוח התרבות עצמאית. ניתוח עלות-תועלת של הרכב קהילה יכול להיות מושגים באמצעות שימוש בpyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP) באמצעות הגישה המתוארת בet al Nance. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D Rendering של Biofilms
נציגי תוצאות מוצגות באיור 3. כלי שימושי בתוכנת Imaris הוא האפשרות לבחון כל פרוסה של ערימת biofilm נאסף ולשלב אותם כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים. בנוסף, ניתן להוסיף אפקטי הצללה מלאכותיים כדי לסייע מבחינה ויזואלית לפרש מבנים תלת-ממדיים. יכול להיות מכוון biofilms שניתנו לכל כיוון עם הגדלה שונה כדי לחקור מבנה biofilm או מיקרו-מושבה. התמונות מוצגות באיור. 3 מראים את התוצאה של הטיפול בbiofilm רב-מינים אוראליים. שים לב במיוחד הוא כי הטיפול באתנול 70% הביא לשינוי צבע משמעותי עבור רוב biofilm (מירוק לאדום), המצביע על תא-מוות משמעותי או תא-נזק. מיקרו-המושבות הגדולות הופיעו להכיל תאים מתים יותר מאשר תאי מיקרו-מושבה יסוד (ועכשיו נחשפו). Such תוצאה היא להעלות על הדעת בשל דה-הידבקות של תאי biofilm כי אתנול הוא מיקרוביאלית קרום-אקטיבי. על ידי המרת הקבצים לפורמט שת וניתוח הערימות שניתנו בImageJ, ניתן לראות אותו על ידי יישום פונקציות היסטוגרמה כי הסכום של אות אדומה וירוקה הוא מידתי ביחס הפוך בין biofilms שלא טופל ואלו שטופלו באתנול.
כימות של Biofilm מאפיינים
טבלת 1 מציגה את הממוצעים וסטיות התקן של פרמטרים מבניים מפתח. יתרון מפתח לשימוש Imaris, ImageJ וסטטמ"מ, הוא שאם Imaris משמש ראשון, יכולים להיות שנוצרו קבצים שתו כדי לאפשר לpipelined קבצים באמצעות ImageJ וסטטמ"מ. נתוני המדגם מוצגים בלוח 1 מראה כי הטיפול בbiofilms האוראלי עם אתנול 70% הביא לירידה משמעותית מאוד ביכולת קיום מ80.8% ל- 28.3%. אתנול יכול לגרום לניזק לתאים וג המבניhanges בbiofilms אבל זה לעתים קרובות-פעמים לא מדידה שונה באופן משמעותי. כאן, לא נמצא הבדלים במדדים של biovolume הממוצע, עובי ממוצע וחספוס ממוצע התגלו (טבלה 1).
המערכת האוראלית microfluidic Bioflux biofilm איור 1.. (א) תרשים המציג חתך אנכי של מערכת Bioflux בעת היותו רכוב על CLSM SPE הפוך. צילום מבואר (קווים שחורים) הדגשת שני ערוצים microfluidic ובארות כניסה ויציאה (B). (ג) דוגמא של biofilm שניתנו דו-ממדי בשידור חי / מת המוכתם האוראלי שטופל עם פתרון 0.01% CPC וכתוצאה מהרג הטרוגנית, בין שאר בשל מגבלת דיפוזיה תגובה. צבע ירוק מציין תאי חיים, מוכתמיםעם 9 Syto; תאים בצבע אדומים מתים או פגום ומוכתם ביודיד propidium. איור 1 א ו -1 B מet al Nance. 20 ברשות. בר באיור. 1C מייצג 30 מיקרומטר.
איור 2. שימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר confocal (CLSM) כדי ליצור שתי השקפות ממדיות ותלת-ממדיות של 20 biofilms שעות שניתנו. biofilms אלו פותחו ברוק במאגר תא ללא (CFS) מבידוד של רוק נקווה המכיל תא (CCS). קהילה שלא טופלה biofilm (עמודה השמאלית של תמונות) מושווה קהילת biofilm אתנול שטופל 70% וbiofilm נציג מוצג במישורים שונים של תצוגה (XY, XZ, וZYZ). היסטוגרמות מראה את ההבדלים באדום (תאים מתים / פגומים) וירוק (תאי חיים)מחדש הראה לכל ערימת תמונה (מחובר הנתונים המוצגים בנתונים שחורים והלא-מחובר מוצגים באפור). כל הנתונים נגזרים מ8 תמונות קצת וכך בסולם של 0-255 (256 מרווחים). ברים סולם מייצגים 30 מיקרומטר.
איור 3. תרשים זרימה המדגים את התוצאה של שאיבה / קציר של biofilm רב-מינים אוראליים 20 שעות (שפותח מבידוד CCS בזורם CFS) ממכשיר microfluidic Bioflux באמצעות גזירה / זרימת הטכניקה הגבוהה. קווים מקווקווים הוחלו על התמונות כדי לסייע בקביעת המיקום של קירות הערוץ. הרכב הקהילה של biofilm נקטף יכול להיות מנותח על ידי 454 טכנולוגיות pyrosequencing כגון pyrosequencing חיידקים בקידוד תג FLX amplicon (bTEFAP) ומתבטא ברמות טקסונומיות מרובות (מַעֲרָכָה באמצעות מינים) בהתאם requirements. מוצג הוא דוגמא להרכב הקהילה, ברמה מַעֲרָכָה, של biofilms שנקטפו משלושה ערוצי microfluidic. ברים מייצגים בקנה מידה במיקרומטרים.
| פרמטר / טיפול | שלא טופל | 70% EtOH |
| הכדאיות ממוצעת (%) | 80.8 (0.9) | 28.3 (5.8) ** |
| ממוצע Biovolume (מיקרומטר 3 / מיקרומטר 2) | 17.7 (8.4) | 16.1 (3.0) |
| עובי ממוצע (מיקרומטר 2) | 23.3 (11.3) | 15.6 (6.4) |
| חספוס ממוצע | 0.4 (0.3) | 0.50 (0.2) |
טבלת 1. כימות של נכסי biofilm של אתנול שלא טופל ו -70% טופלו 20 biofilms שעה שפותח ברוק תא ללא במאגר (CFS) מרוק הבידוד תא המכיל (CCS). ערכים מודגשים הם ממוצעים והערכים שאינם מודגשים בסוגריים מציינים את סטיית התקן. הנתונים הוא מחמש ב- לפחות תמונות משלושה ערוצי microfluidic. הבדלים משמעותיים לשליטת המטופל מודגשים על ידי כוכבית (** P <0.01%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נייר שיטות זה מדגיש הנדרש להקמת השלבים הבסיסיים ולהפעיל מערכת microfluidic באופן שיאפשר לפיתוח biofilms רב-מינים אוראליים נגזר מרוק אנושי ונקווה וגדל ב- 25% רוק אנושי ויקווה-מעוקר מסנן. מקבלות גישות לאפיין את biofilm אך יש לזכור כי גישות המתוארות אלה הן טכנולוגיות לשינוי ונוספות כגון, למשל, יכולים להיות הציגו כתמים או תוויות. כעניין של דוגמא, אחד יכול להעלות על הדעת להשתמש בנוגדנים שכותרתו או להציג את מתח ניאון כדי לחזות ולבחון את המיקום המרחבי של מינים מסוימים בתוך biofilm רב-מינים האוראלי. יתר על כן, בהתאם למודל של מערכת microfluidic בשימוש, ניתן לפתח biofilms בתנאים אנאירוביים (במקרה של מערכת Bioflux, הערה טכנית זמינה בFluxion.com בנושא זה).
היבט מרכזי לmicrofluid Biofluxמערכת ic היא התאימות שלה עם מספר רב של טכנולוגיות וזה מודגש כאן על ידי היכולת לבצע מגוון תרבות עצמאית ניתוחים (איור 3). בעוד המשטחים הפנימיים של מערכת microfluidic אינם נגישים בקלות, נמרצים קדימה לאחור זרימה אין לאפשר ביומסה biofilm המשמעותית שיש להסירו. בעוד כל biofilm לא ניתן להסיר בקלות וזה יכול להיחשב חולשה במערכת, זה רלוונטי לציין שגם יש לי מערכות biofilm מודל רבות בעיה דומה וטענות מכל הנתונים שנאספו כאלה שמזג עם הידע הזה . לדוגמא, ייתכן שהשפע של סטרפטוקוקוס עשוי להיות גבוה יותר בbiofilm מאשר למעשה בניסוי נקבע, כי יש לי מיני Streptococcus רבים יכולות טובות במיוחד להיקשר למשטחים מצופים רוק 39.
כמו בכל מערכות biofilm המודל, יש להיות מודע לשאלות שהוא שאל. Fאו דוגמא, מערכת זו לא תהיה מתאימה למחקרים ארוכי טווח לטווח ארוך. מערכת מודל כגון כור קבוע סרט עומק, מערכת Sorbarod, או כור טפטוף יכולה להיות יותר מתאימה 40-42. אמנם, הבעיה של כמויות מוגבלות של רוק למערכת מודל הופכת לנושא שהינם לא תכנונים מבוססי microfluidic. באור דומה אם כי, מערכת Bioflux המתוארת כאן יכולה גם להיות מותאמת למחקרים של biofilms בסביבות אחרות שבו נוזלים ביולוגיים זמינים רק בכמויות קטנות. לדוגמא, זה יכול לכלול שתן וexudate פצע.
לסיכום, כמו בכל מערכת מודל במבחנה, יש להיות מודע לנקודתי החוזק והחולשה של מערכת microfluidic לצמיחה של biofilms האוראלי. בעוד מערכת microfluidic היא לטעון שמקורן הסביבה ומאפשרת לפיתוח biofilms שcompositionally בדומה למצב בvivo, זה לא thדואר זהה למצב in vivo וסביר להניח שלעולם לא יהיה כל כך. מערכת מודל מעבדה היא רק טובה כמו הנחותיה ואילו מערכת microfluidic יש חפיפה רבות עם תנאים בתוך חלל הפה האנושי, גורמים כגון אפקטים מבוססי מארח ויוטיים חיצוניים ואתגרי אביוטי (לדוגמא, באמצעות שתייה ואכילה) לא יכולים להיות בקלות משוכפל. ברור, עם זאת, כי טבע התפוקה הגבוה, כמו גם המיקרוביולוגית הסביבתית וחופף את מצב הפה בעולם האמיתי לעשות את זה מערכת microfluidic מפתה להכנת תחזיות לפני עוסק במחקרים קליניים לוגיסטי מאתגרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים ויליאם Nance (אוניברסיטת מישיגן) לעזרה בגיבוש פרוטוקולי צמיחת biofilm וג'ון בטיסטה (Fluxion, סן פרנסיסקו, קליפורניה) לקבלת ייעוץ בנושאים טכנולוגיים הנוגעים למערכת Bioflux. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (NIH: R21DE018820 לAHR) ואוניברסיטת מישיגן קרנות הזנק לAHR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent | |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system | |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system | |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices | |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices | |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Ultra Low Temperature Freezer -80 °C | Multiple choices | Multiple choices | |
| Tips (20, 200, and 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Software | |||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | ||
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
- Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
