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Bioengineering

높은 처리량의 사용 doi: 10.3791/52467 Published: December 1, 2014

Summary

이 방법 용지의 목적은 일반적으로 인간 치은 연상 치석에서 식별 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을위한 마이크로 유체 시스템의 사용을 설명하는 것이다. 방법은 생물막 구조, 생물막 생존 및 강조 표시됩니다 문화에 의존 또는 문화 독립적 인 분석을위한 수확 바이오 필름에 대한 접근을 설명한다.

Abstract

일반적으로 생체 내에서 검출 경구 생물막 다수 종을 포함 멀티 종 생물막의 개발을 촉진 시험 관내 시스템에서의 약간 높은 처리량이있다. 또한, 인공 대신 미디어, 영양원으로서 천연의 사람의 타액을 사용하는 시스템은, 생체 모방 커뮤니티 셀룰러 및 생물막 별 속성의 표현을 지원하기 위해 특히 바람직하다. 우리는 인간 구강 유사한 조건 하에서, 치은 연상 치석을 위해 종 조성물에 대하여, 비교 가능한 멀티 종 경구 생물막의 개발을위한 방법을 설명한다. 특히,이 방법은 문서 시판 마이크로 유체 시스템이 멀티 - 유래의 종 경구 생물막의 개발을 용이하게하도록 적응 풀링 타액 내 성장시킬 수있는 방법을 설명한다. 더욱이, 방법은 시스템의 설명 confoca와 함께 사용될 수있다L 레이저 스캐닝 현미경 표시됩니다 건축과 생존 분석을위한 3-D 생물막 복원을 생성합니다. (연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella, Gemella포피 포함) 미세 유체 시스템에서 바이오 필름 ​​내에서 성장하는 미생물의 넓은 다양성을 감안할 때, 프로토콜은 또한 더 하위 문화 또는 DNA 추출 및 분석을위한 생물막 세포를 수확하는 방법에 대한 표시됩니다. 미세 유체 생물막 시스템과 현재의 최​​첨단 데이터 분석 모두의 한계는 해결 될 것입니다. 궁극적으로,이 문서가 구강 생물막 (biofilm)의 연구를 개선하고 미세 유체 플랫폼과 통합 할 수있는 추가 기술의 개발에 도움이 될 기본 기술을 제공 할 것으로 상상된다.

Introduction

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바이오 필름은 구조적으로 표면 일에 집계 박테리아의 복잡한 사회입니다. 이 사회는 일반적으로 바이오 필름이 내 서로 상호 작용하는 수많은 종을 포함하고있다. 구강 바이오 필름, 시각적으로 가장 눈에 띄는되는 치석은, 인간의 지속적인 문제 및 분류 학적으로 다양한 멀티 종 커뮤니티 3 세대에서의 통제되지 않은 개발 결과입니다. 이러한 다양한 지역 사회의 구성 요소 박테리아는 자신의 자유 부동 (플랑크톤)의 대응 4-6 이상의 항생제에 대한 저항력 1,000 배까지 될 수 있습니다. 미국에서 연간 치과 의사 사무실에 5 억 방문하고, 약 108,000,000,000달러는 치료 또는 치주을 방지하기 : 치아 우식증과 치주 질환을 일으킬 수있는 이러한 구강 생물막 지역 사회를 치료하지 않을 경우, 상당한 공중 보건 부담을 초래하고있다 질환과 충치 7.

어려움을 극복하기위한 그들의 사기가 지속적으로 실험실 문화 작업의 매력적인 용이성. "(8) - 스미스에 의해 약화되어 있기 때문에 내용은"> "많은 미생물이 자연 상태에서 미생물 동작을 공부 옹호하는 동안, 그들 중 몇 그렇게.입니다.

현재, 구강 생물막 연구가 생체 내생체 외 접근의 다양한 사용하여 수행되는, 자신의 장점과 각각 9,10 불리. 시험관이 자주 설정 비교적 용이하지만 임상 부족할 수있다 모델 생물막 시스템을 사용하는 접근 / 실제 관련성 (10, 11). 생체 내 접근 방식은 일반적으로 인간의 구강 환경의 특정 측면을 재현, 그러나 다시 제한으로 고통 때문에 동물 사이의 해부학, 생리학, 미생물학 및 면역학의 차이로 12 인간이 할 수있다 동물 모델 시스템에 의존, (13). 그것은 구강 생물막 주목해야한다또한 인간 자원 봉사자의 입을 내 스텐트에서 개최 에나멜 표면에 개발,하지만이 방식은 현재 상대적으로 비용이 많이 들고 노동 집약적 인 14, 15입니다 수 있습니다. 궁극적으로, 새로운 제 또는 구강 건강을 개선하는 기술은 임상 시험 조건 (11)에서 인간 시험한다. 현재, 새로운 구강 건강 관리 에이전트를 식별하고 평가하는 자주 사용하는 수법은 첫 번째 실험 연구는 잠재적 인 효과를 식별 한 다음 동물 연구 및 기술 (9)의 성공을 평가하기 위해 임상 사용 "현장 시험"을 수행하기 위해 수행하는 것입니다, 16, 17. 불행하게도, 실험실 연구는 큰 공간을 차지 모델 시스템에 의존하는 경향이 사용하기 기술적으로 도전하고, 자주 10,18 의미 잠재적 인 실제를 유도하기 위해 몇 종 하나 또는 최대 커뮤니티를 단순화가 들어 있습니다. 치석 바이오 필름이 COMPL에서 여러 종의 형태를 포함하는 점을 감안EX 인공 미디어 실제 시나리오 10,19에서와 유사한 방식으로 동작 공동체를 생성 할 가능성이 하나를 포함 생물막 또는 몇 종의 개발, 환경 타액 흐르는. 시간, 비용, 트레이닝 요구 사항, 실제 환경에 비해 실험실 모델 생물막 시스템의 빈약 대표성을 해결하기 위해, 우리는 최근 높은 처리량 및 환경 게르만 생물막 시스템 (20) (도 1)를 개발 하였다. 접종 등의 중간 처리되지 않은 풀링 인간의 박테리아 세포 함유 타액 (CCS) 등의 무 세포 풀링 된 인간의 타액 (CFS)의 사용으로 시스템의 혜택을 제공합니다. 유일하게, 시스템은 미세 유체 기술, 공 초점 레이저 주사 현미경, 및 세균 배양 독립적 다양성 분석 기술을 결합한다. 따라서, 모델 시스템은 접종 37 종 멀티 생물막을 성장 환경으로 게르만 (사용 타액이다 필터 살균이 흐르는 C를 °타액)과 구강 바이오 필름은 초기 치은 연상 치석 (20)에서 발견의 풍부함 대표의 연쇄상 구균, 나이 세리아, Veillonella포피 종을 포함하여 종 ()가 포함되어 있습니다.

이 작품은 새로 개발 된 모델 시스템의 사용을 설명하는 고려할 때 특히주의가 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) 미세 유체의 융합, 문화 독립적 인 다양성 분석 기술에 부여해야합니다. 우리의 연구 그룹에 의해 이러한 기술의 조합은 의도적이고뿐만 아니라 새로 개발 된 모델 시스템에 높은 처리량 기능을 추가 할뿐만 아니라 질문에 쉽게 다른 시스템과 이전에 해결 될 수 없다는 것을 질문 할 수 있습니다. 이 바이오 필름의 3 차원 분석을 가능으로 첫째, CLSM은 기존의 현미경을 통해 뚜렷한 장점이 있습니다. 바이오 필름은 이기종 재치이기 때문에 종종 진가를 인정받지 못한,이 매우 중요하다H 종 조성물 및 공간적 위치에 대해서뿐만 아니라 생리 학적 조건은 6,21 바이오 필름 ​​내의 상이한 공간 위치에 부과된다. 입체 렌더링 소프트웨어 및 이미지 분석 소프트웨어, 생물막 구조, 구성 요소 사이의 공간 관계 종 및 미생물 사멸의 정도와 협동하여 22-24을 분석 할 수있다. 이러한 능력은 표준 투과광 또는 표면 형광 현미경을 사용하여 불가능합니다. 주의 깊게 통제 된 조건 (유량, 온도, pH 등)에서 바이오 필름의 연구를 가능하게하고 만 액체 25-27의 작은 볼륨을 필요로 다음, 미세 유체 미생물학 분야에 특별한 관심을 얻고있다. 그 달성으로 비교 점으로, 비슷한 유량 및 전단에 20 시간 동안 흐름 셀 모델 시스템 (틀림없이 많은 구강 생물막 연구를위한 주력 모델로 간주되는 시스템) 내에서 인간의 타액에서 구강 생물막 성장미세 유체 소자 28-31 800 μL 대조적으로 마이크로 유체 시스템에서, 적어도 200 mL로 요구한다. 따라서, 미세 유체 모델 생물막 시스템은 정의 된 조건에서 수량 제한 물질의 연구를 할 수 있습니다. 마지막 pyrosequencing 기법 기술은 사회 분석을 수행하는 물질의 소량 만이 필요하도록 지난 10 년 최적화에도 희소 생물막 종의 ID를 획득하기 위해 시퀀스의 깊이를 제어하도록 충분히 다재다능되었다. 세균성 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP) 등이 기술의 사용은, 생물막의 생태에 관한 관련 질문에 대한 허용했다가 (32, 33)를 해결해야합니다. 이러한 질문은 pyrosequencing 기법 이유로 인해 시간과 플라스미드 라이브러리 및 데이터 (33, 34)를 도출하는 데 필요한 복잡한 기술 및 분석 단계를 작성하는 데 필요한 비용을 사용할 수없는 과거에 어려움을 고취. 문화 독립적 인 AP와 물론 큰 장점이러한 pyrosequencing 기법으로 proaches는, 기존의 실험실 미디어 (즉, 실행 가능한하지만 비 경작 종) 내에서 독립적으로 성장 할 수없는 종의 박테리아가 성장 식별 모델 시스템 내에서 그리고 지역 사회에서의 상대적인 풍부, 36 (35)를 정량화 할 수 있다는 것입니다 . 이르면 1963과 같은 관점을 추가하려면, 후반 지그문트 Socransky은 인간의 구강 잇몸 틈새에서 분리 된 물질에서 박테리아의 약 50 %가 실험실 성장 조건 (37)를 사용하여 배양 할 수 없다고 추정했다.

이 방법 용지의 목적은 시판중인 마이크로 유체 (Bioflux) 시스템에서의 경구 다중 종 생물막을 개발하는 방법을 설명하는 것이다 : (I) 조건 인간 구강 대표 및 (II) 종의 조성 및 풍부 그 치은 연상 치석 비교입니다. 또한, 모두 프리웨어 및 상용 소프트웨어를 사용하여, 우리는 어떻게 기본 생물막을 강조아키텍처 조치가 생물막 바이오 매스, 조도 및 생존 능력을 정량화하는 방법에 중점을두고, CLSM 데이터로부터 유도 될 수있다 (라이브 / 죽은 얼룩에 따라). 마지막으로, bTEFAP에 의해 다양성 분석을위한 바이오 필름 재료를 수확하는 데 필요한 단계가 설명되어 있습니다.

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Protocol

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여기에 설명 된 타액 수집 프로토콜은 인체 실험에​​ 대한 미시간 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학에 의해 검토되었다.
참고 :이 유형의 인간 대상 연구에 대한 기관 평가와 관련하여, 사전 준비 및 권한이 호스트 기관에서 얻고해야합니다. 특히, 기관에 따라 IRB 또는 윤리 승인은 지원자의 타액 수집을 진행하기 전에 모색하고 승인해야 할 수 있습니다. 응용 프로그램을 준비에 도움으로 유용한 NIH 알고리즘 / 차트는 여기에서 찾을 수 있습니다 : http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

환경 게르만 성장 매체로 사용하기 위해 풀링 침 1. 준비

  1. 타액 기부> 5 개인을 모집. 더 individu을 보장하지, 어떤 식별 정보를 복용하지 마십시오그들은 병, 또는 최근 3 개월 동안 경구 항생제를 촬영 한, 또는 음식물이나 액체를 소비 한 경우 루게릭 병은 기부 전에 이전 2 시간에 물을 제외하고, 침을 기부합니다.
  2. 50 ml의 플라스틱 튜브에 타액을 수집합니다. 얼음에 유지 플라스틱 비이커에 채취 타액 풀. 타액의 폴리머 내부 유리 표면에 부착되므로 유리를 사용하지 마십시오.
  3. 100 배 재고에서 2.5 mm의 최종 농도 디티 오 트레이 톨 (DTT)를 추가합니다. (주식은 단일 사용 분량 씩 냉동 -20 ° C). 얼음에 플라스틱 비커에서 10 분 동안 교반한다.
  4. 입자상 물질을 제거하기 위해 원심 분리를 17,500 X g에서 30 분 동안 풀링 된 타액.
  5. 사분에게 집중 타액을주고 dH보다 2 O 3 권으로 침을 희석.
  6. 필터 소독 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰 (PES), 저 단백 결합 필터를 이용하여 침을. 고 표면적 필터를 사용 또는 수 개의 작은 영역 필터를 사용한다. 에 침을 유지얼음에 플라스틱 용기를 필터링한다.
  7. 풀링 된 타액에서 동결 -80   50 ml의 플라스틱 튜브에 ° C 박테리아 성장을 필요할 때까지. 각각의 플라스틱 튜브는 하나의 사용할 수 있으며 각각의 미세 유체 아니라 1.2 ml의 최대 (1.2 ml의 X 24 우물 = 28.8 ml)에 보유하고 침 동결하는 동안 확장으로 공간이 각각의 튜브에 필요로 더 이상 35 ml의 포함되어야합니다.
  8. 사용을 위해, 실온에서 해동 풀링 타액. 일단 해동, (어떤 침전물을 제거하기 위해 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰, 낮은 단백질 결합 필터) 한 번 더 필터 소독.

접종으로 사용하기 위해 풀링 타액 2. 준비

  1. 타액 기부> 5 개인을 모집. 기부 전에 이전 2 시간에 물을 제외하고는 최근 3 개월 동안 경구 용 항생제를 촬영 한, 또는 음식물이나 액체를 소비 한, 어떤 식별 정보를 가지고 그들이 아픈 경우에는 개인이 침을 기부하지 않습니다 보장하지 않습니다. SA를 수집30 분 이상 mples.
  2. 실온에서 50 ml의 플라스틱 튜브의 타액을 수집하고, 실온에서 플라스틱 비이커에 채취 타액 수영장.
  3. 25 % 글리세롤의 최종 비율 75 %의 세포를 함유 타액 [CCS]와 사진을 수득 멸균 된 일반적인 시약 특급 글리세롤 풀링 타액 희석.
  4. 필요할 때까지 3 ㎖ 회용 분량 씩 -80 ° C에서 타액 동결.
  5. 마이크로 유체 시스템을 접종하기 위해 필요한 경우, 분취 량 이하, 프로토콜의 단계 3에 기재된 마이크로 유체 시스템에 피펫되기 전에 실온에서 해동하고 5 초 동안 vortexer를 부드럽게 교반한다.

구강 다중 종의 바이오 필름 3. 성장

  1. CFS 전처리
    1. 먼저 코트 CFS와 Bioflux 미세 유체 채널. 물론 각각의 콘센트에 CFS의 100 μl를 추가합니다. Bioflux 제어 소프트웨어를 사용하면, 채널에서 "수동"을 설정 흐름을 선택 "B1-B24"그쪽으로t가 사용되어야한다.
    2. 다음에, 1.0 다인 / cm² 이상으로 설정하고 전단 채널에 걸쳐 균일 한 분포의 CFS를 위해 실온에서 2 분 동안 흐름을 시작한다. CFS 균등하게 모든 채널을 통해 유입 된 것을 확인하기 위해 각 입구 채널에서 유체가 있는지 확인하십시오.
    3. 실온에서 20 분 동안 플레이트를 인큐베이션.
    4. 출구 웰에 남아 CFS / 전처리 용액을 제거하고 웰에 유입 옮긴다. 100 μL이 총 부피 잘 콘센트에서 접종에 적용되는 압력에 균형을 될 것입니다.
  2. 접종
    1. 물론 각각의 콘센트에, CCS 접종의 100 μl를 추가합니다. 정확히 6 초 동안 1.0 다인 / cm² 이상에서 유입 우물 (즉, 역방향)에 미세 유체 열 접시에 플레이트 (온도 37 ° C에서 설정), 제어 소프트웨어 내에서 수동을 선택하고, 출구 우물에서 설정 흐름을 놓습니다.
    2. 40 분 수 있도록 37 ° C에서 미세 유체 플레이트를 품어초기 부착과 접종에 박테리아의 성장을위한.
  3. 하룻밤 성장
    1. 접종 채널이 사용중인 경우, 출구 각 웰로부터 폐기물 균액 대기음. (기존 CFS의 상부에 행해질 수있다) 입구 각 웰에 CFS 1 ml의 총 부피까지 추가한다.
    2. 37 ° C에서 미세 유체 플레이트를 품어, 수동 선택하고 20 시간 동안 0.2 다인 / cm² 이상에서 실행할 프로그램을 설정합니다.
  4. 얼룩 예비 세탁
    1. 입구와 출구에서의 유체 대기음 웰 모두와 입구 각 웰에 100 ㎕ PBS (PH 7.4)을 추가한다. 0.2 다인 / cm² 이상에서 20 분 동안 흐름.
  5. 얼룩 혼합물 추가
    1. 세포 생존 염색은 염색 할 각 채널에 대해 얼룩 혼합물 100 ㎕를 확인합니다. 특히, SYTO 9의 3 μL 및 DEAD / 라이브와 같은 상업 세포 생존 염색 키트를 사용하여 PBS 1 ㎖ 당 요오드화 프로피 듐의 3 μl를 추가합니다. 이 생성10 μM의 SYTO 9 및 60 μM의 요오드화 프로피 듐을 포함하는 염색 액.
    2. 입구 우물에 남아있는 PBS를 대기음 각 웰 입구에 세포 생존 능력 얼룩 혼합물 100 ㎕를 추가합니다. 실온에서 45 분 동안 입구로부터 출구로 용액을 0.2 다인 / cm 2의 흐름 및 실행하도록 설정.
  6. 후 염색 세척
    1. 입구 각 웰에 남아있는 얼룩을 대기음 아니라 각 입구에 PBS 100 ㎕를 추가합니다. 초과 얼룩을 제거하기 위해 실온에서 20 분 동안 콘센트에 입구에서 PBS 용액을 0.2 다인 / cm² 이상에서 흘러 실행 설정합니다.

4. 이미지 모음, 3D 렌더링 및 이미지 분석

  1. 미세 유체 시스템에서 바이오 필름 이미지 데이터를 수집 반전 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용합니다. CLSM은 150g에 도달 할 수 Bioflux 판의 무게를 견딜 수 있는지 확인합니다.
    참고 : 한푼도 주어미세 유체 채널, 생물막 구조를 식별 감도에 대한 필요성 및 요구 nsions은 다양한 강도의 형광 신호를 검출 40X 1.25 NA 대물 렌즈 또는 이와 유사한 광학 품질, 배율 및 개구 수를 가지는 하나 CLSM 맞게.
  2. 이득 배출 캡처 게이트 표준화 및 오프셋 측정은 일정하게 유지된다. 이 사진 표백을 초래할 수 있으므로 레이저 파워가 25 %를 초과하지 않도록하십시오.
  3. 내가 F의 ILE 유형 OME에 (LIF) (OM의 icroscopy E의 nvironment) 파일 형식 마법사 L의 eica에서 CLSM 파일을 변환합니다. 이 소프트웨어 프로그램 사이의 액세스 및 호환성을 더 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 유형의 파일을 변환하는 등 IMARIS, 상업적으로 사용할 수있는 소프트웨어를 사용합니다.

이미지 / 도표를위한 3D 렌더링

  1. 일단 OME 형식으로 변환 그러한 이미지를 렌더링 IMARIS 같은 상용 소프트웨어를 사용3D로. "Easy3D"및 "능가"옵션의 조합을 사용하여이를 수행한다.
    참고 : 배경 신호 및 임계 값에주의해야한다. IMARIS의 히스토그램으로 수집 범위를 획득하기 위해 사용될 수 있고, 이미지가 분석되고,이 사이에서 일정하게 유지되어야한다.
  2. "스냅 샷"기능을 사용하여 이미지를 저장하고 파일 형식을 저장하기 전에 이미지 해상도에 신중하게 고려해야합니다.
  3. 이러한 코렐 드로우 또는 어도비 일러스트 레이터와 같은 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 그림으로 이미지를 조립합니다.

그래프 및 표에 대한 3D 이미지 분석

  1. 이미지 분석을위한 ImageJ에 23 COMSTAT / COMSTAT2 38 자유롭게 사용할 수 있습니다. 각각 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 및 http://comstat.dk/에서 패키지를 다운로드합니다. 가장 최근의 자바 업데이트가 설치되어 있습니다.
    참고 : 소프트웨어 플랫폼 자바는 프리 오을 설치해야합니다이미지 분석 소프트웨어를 사용하려면 r.
    1. "분할 채널"로 "hyperstack"모드와보기 각 생물막 이미지의 OME 파일을 가져올 COMSTAT2 플러그인과 ImageJ에 소프트웨어를 사용합니다.
    2. 개별적으로 두 채널 ImageJ에의 "히스토그램"기능을 사용하여 (레드 / 프로피 듐 요오드화 / 죽은 존재 채널 0, 녹색 / SYTO-9 / 라이브 인 채널 1)를 분석 할 수 있습니다. 이 함수는 신호 (배경)와 0 인 픽셀 (255) 인 상태 ( "가치"로 도시) 0에서 255까지 각각의 컬러 강도 ( "카운트"로 도시) 8 비트 OME 파일의 픽셀들의 총 수를 나열 완전한 신호 포화와 픽셀.
    3. 스프레드 시트 프로그램에 데이터를 반출하고 대응하는 신호 강도에 의해 각 화소에 가중을 모든 신호 값을 표준화. 이것은 그 신호 강도의 수치 8 비트 값 (255)에 의해 소정의 신호 강도에 총 개수를 승산함으로써 수행된다.
    4. 캡처 된 각각의 바이오 필름 이미지의 두 채널에 대한 모든 가중치, 0-255 합계. 어느 채널로부터의 총 신호 퍼센트를 결정하기 위해 두 채널 가중치의 합을 가라. 빨간색과 녹색 신호 퍼센트 (%가 "DEAD"와 퍼센트 각각의 치료를위한 "라이브"IE)의 상대적 비율 또는 백분율을 결정하기 위해이 작업을 수행합니다.
    5. 동일하지 않은 분산에 대한 수정이 꼬리 학생의 T-test를 이용하여 예를 들어, 통계 분석을 수행합니다. P <0.05의 값은 의미있는 것으로 간주되고 P <0.01의 그 값은 매우 중요한 것으로 간주됩니다.

문화 독립적 인 분석 5. 수확 생물막 세포

  1. 입구와 출구 우물에서 모든 시간에 사용되지 않은 침을 제거합니다. 1 ml의 멸균 증류수로 3 회 우물을 씻으십시오.
  2. 소프트웨어 제어 인터페이스를 사용하여, 흡입 웰 멸균 증류수 100 ㎕를 추가하고, 합격> 8.0 다인 / cm 2의 채널을 통해 앞으로 멸균 증류수 (800 초, 전단 속도> 745 μL / 시간 흐름 -1)에서 5 분 이상. 적어도 5 분 동안 반대 방향으로 반복하고 순방향를 반복하고 세정 공정 과정을 역방향.
  3. 철저한 바이오 필름 ​​제거 (그림 2)에 대한 (세포를 염색하는 경우 / 표시) 빛에 의해 또는 표면 형광 현미경으로 확인합니다. 문화 독립적 인 분석을 위해 -80 ° C에서 100 μL 세포 현탁액 및 저장소를 수집합니다. 커뮤니티 조성물의 비용 효과 분석 낸스에 기재된 방법을 이용하여 세균 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP)을 사용을 통해 달성 될 수있다. (20)

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Representative Results

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바이오 필름의 3D 렌더링

대표 결과는 그림 3에 표시됩니다. IMARIS 소프트웨어의 유용한 도구가 수집 된 생물막 스택의 각 슬라이스를 검사하고 입체 복원을 만들 결합하는 옵션입니다. 또한, 인공 음영 효과는 시각적 도움 입체 구조를 해석하기 위해 첨가 될 수있다. 렌더링 된 바이오 필름은 바이오 필름 또는 마이크로 식민지 구조를 탐구하는 다른 배의 배율 어떤 방향으로 지향 할 수 있습니다. 이미지도 표시. 도 3은 다중 구강 종 생물막의 치료 결과를 보여준다. 특히 참고로 70 % 에탄올과 치료가 중요한 세포 사망 또는 세포 손상을 제안, (녹색에서 빨간색으로) 바이오 필름의 대부분을위한 중요한 색상 변경 결과 것입니다. 큰 마이크로 식민지는 기본 (현재 노출) 마이크로 식민지 세포보다 더 많은 죽은 세포를 포함 나타났다. SUCH는 결과는 에탄올 막 - 항균 활성 때문에 생물막 세포의 접착을 해제 하였기 때문이라고 생각된다. OME 형식으로 변환하고 파일의 렌더링 ImageJ에 스택을 분석함으로써, 적색, 녹색 신호의 양이 미처리 생물막을 에탄올 및 이들 사이의 반비례 히스토그램 함수를 적용 해 볼 수있다.

바이오 필름 ​​특성의 정량화

표 1은 평균 키 구조 매개 변수의 표준 편차를 보여줍니다. IMARIS, 및 ImageJ에 COMSTAT를 사용하는 주요 장점은, IMARIS 처음 사용되는 경우, 파일 OME가 ImageJ에 파일과 COMSTAT 통해 파이프 라인 될 수 있도록 생성 될 수 있다는 것이다. 표 1에 제시된 샘플 데이터를 70 % 에탄올로 경구 생물막의 치료에 28.3 % 80.8 %에서 생존율이 높은 상당한 떨어짐을 볼 것을 보여준다. 에탄올은 일부 세포 손상 및 구조 C가 발생할 수 있습니다생물막 hanges 그러나 이것은 잴 유의 한 차이를 자주 시간이 아니다. 여기에, 평균 biovolume, 평균 두께와 평균 조도의 측정에 차이는 (표 1) 검출되지 않았다.

그림 1
그림 1. Bioflux 미세 유체 구강 생물막 시스템. (A)의 반전 CLSM SPE 상에 장착 된 상태 Bioflux 시스템의 수직 단면을 나타낸 도면. (B)는 두 개의 미세 유체 채널 및 입구 및 출구를 강조 웰 주석 (검은 선) 사진. (C)으로 인해 반응 확산 제한으로 일부를 이종 살해 결과에 CPC 0.01 % 수용액으로 처리 된 렌더링 이차원 라이브 / 죽은 스테인드 경구 생물막의 예. 그린 색 염색 생균을 나타낸다SYTO 9; 붉은 색 세포 낸스 등. 권한을 가진 20에서 죽었거나 손상 및 요오드화 프로피 듐 염색. 그림 1A1B입니다. 도 바. 1c는 30 μm의를 나타냅니다.

그림 2
렌더링 20 시간 생물막의 이차원 및 삼차원 뷰를 생성하는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)의도 2. 용도. 이 바이오 필름은 풀링 세포 함유 타액 (CCS)의 접종에서 풀링 된 무 세포 타액 (CFS)에서 개발되었다. 치료 생물막 커뮤니티 (이미지의 왼쪽 열) 70 % 에탄올 처리 생물막 지역 사회와 비교하고, 대표적인 바이오 필름은보기의 다른 평면 (XY, XZ 및 ZYZ)에 표시됩니다. 빨간색의 차이 (죽은 / 손상된 세포)과 녹색 (생균)을 보여주는 히스토그램각 이미지 스택 표시 재 (회색으로 표시 검정과 기록되지 않은 데이터에 표시된 데이터를 기록). 모든 데이터는 8 비트 이미지에서 따라서 255 (256 단위)의 규모에 유도된다. 스케일 바는 30 μm의를 나타냅니다.

그림 3
20 시간 경구 용 다중 종의 바이오 필름의 추출 / 수확의 결과를 보여주는 그림 3. 플로우 차트는 상승 전단 / 흐름 기술을 사용하여 Bioflux 미세 유체 장치에서 (CFS를 흐르는 CCS 접종에서 개발). 점선 채널 벽의 위치를​​ 결정을 돕기 위해 이미지에 적용되어왔다. 수확 된 바이오 필름의 지역 사회 조성은 REQ에 따라 세균​​성 태그 인코딩 FLX 앰플 리콘 pyrosequencing 기법 (bTEFAP)으로 454 pyrosequencing 기법을 기술로 분석 한 결과, 다수의 분류 학적 수준에서 (종을 통해 문을) 표현 될 수있다uirements. 커뮤니티 조성물의 예는 세 개의 미세 채널에서 수확 생물막, 문 레벨에서 도시되어있다. 바 마이크로 미터의 규모를 나타냅니다.

매개 변수 / 치료 처리되지 않은 70 % EtOH로
평균 생존 (%) 80.8 (0.9) 28.3 (5.8) **
평균 Biovolume (μm의 / μm의 2 3) 17.7 (8.4) 16.1 (3.0)
평균 두께 (μm의 2) 23.3 (11.3) 15.6 (6.4)
평균 조도 0.4 (0.3) 0.50 (0.2)

치료 및 70 % 에탄올 바이오 필름 ​​특성 표 1. 정량 접종 세포 함유 타액 (CCS)에서 풀링 된 무 세포 타액 (CFS)에서 개발 된 20 시간의 바이오 필름을 처리 하였다. 굵은 값은 괄호 안에 평균과 비 굵은 값은 표준 편차입니다 있습니다. 데이터는 세 개의 미세 유체 채널의에서 - 적어도 다섯 이미지에서이다. 처리되지 않은 대조군에 유의 한 차이는 별표 (** P <0.01 %)에 의해 강조 표시됩니다.

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Discussion

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이 방법 용지 설정하는 데 필요한 기본 단계를 하이라이트 및 풀링 인간 타액에서 유래 필터 멸균 25 %의 풀링 된 인간 타액에서 재배 경구 다중 종 생물막의 개발을 허용하는 방식으로 마이크로 유체 시스템을 실행. 생물막을 특성화 방법들이 주어진다 있지만 이러한 설명 방식이, 예를 들어, 얼룩 또는 라벨을 도입 할 수있다, 등의 수정 및 추가 기술이라는 것을 기억해야한다. 예를 들어 말하자면, 사람은 생각할 표지 항체를 사용하거나 시각화하고 구강 다중 종의 바이오 필름 내에서 특정 종의 공간적 위치를 검사 할 수있는 형광 변형을 소개 할 수있다. 또한, 사용되는 마이크로 유체 시스템의 모델에 따라서는 혐기성 조건 하에서 생물막을 개발하는 것이 가능하다 (Bioflux 시스템의 경우, 기술적 인 참고이 피사체에 Fluxion.com에서 가능).

Bioflux의 마이크로 유체에 핵심 요소IC 시스템은 여러 기술과의 호환성이며, 이는 독립적 인 다이버 시티 배양 분석 (도 3)를 수행 할 수있는 능력에 의해 여기에서 강조된다. 미세 유체 시스템의 내부 표면이 쉽게 앞으로 활발한, 접근 할 수없는 상당한 생물막 바이오 매스를 사용 않습니다 역류하는 동안 제거한다. 바이오 필름이 모두 용이하게 제거 할 수없고,이 시스템에 약점이 고려 될 수 있지만, 많은 모델 생물막 시스템이 기술와 단련 할 필요 유사한 문제 및 이에 수집 된 데이터로부터 청구항을 참고 관련된 . 예를 들어, 연쇄 구균의 존재 량이 많은 구균 종 타액 코팅면 (39)에 결합하는 매우 우수한 능력을 가지고 있기 때문에 실제 실험적으로 결정된 생물막에보다 높을 수도있다.

모든 모델 생물막 시스템과 마찬가지로, 하나는 질문 요청을 받고 염두해야한다. F또는 예를 들어,이 시스템은 길이 장기 연구에 적합하지 않을 것이다. 이러한 일정한 깊이 막 반응기, Sorbarod 시스템, 또는 반응기 등의 드립 모델 시스템은 40-42보다 적합한 것이다. , 모델 시스템에 대한 침의 제한된 수량의 문제가이 같은 문제가된다하더라도 미세 유체 기반 설계되지 않습니다. 하지만 비슷한 관점에서, 여기에 설명 된 Bioflux 시스템은 생체 액이 소량으로 만 사용할 수있는 다른 환경에서 생물막 (biofilm)의 연구에 적용 할 수 있습니다. 예를 들어, 소변 및 상처 삼출물을 포함 할 수있다.

결론적으로, 모든 시험 관내 모델 시스템에서와 같이, 하나는 경구 생물막의 성장을위한 장점과 마이크로 유체 시스템의 단점을 인식되어야한다. 마이크로 유체 시스템 틀림 환경 게르만이며 생체 내 상황에 구조적으로 유사하다 생물막의 개발을 가능하게하지만, 토륨되지 않는다전자 생체 내 상황과 동일하게 가능성이 그럴하지 않습니다. 실험실 모델 시스템은 가정에 지나지 않습니다 및 미세 유체 시스템은 인간의 구강 내 조건, 같은 호스트 기반의 효과와 외부 생물과 비 생물 적 문제 등의 요인에 많은 중복을 가지고있는 동안 (예를 들어 음주와 식습관을 통해) 쉽게 될 수 없다 복제. 이는 고 스루풋뿐만 아니라 자연 환경 미생물은 경구 실제 상황과 중첩이 물류 도전 임상 연구에 참여하기 전에 예측하기위한 마이크로 유체 시스템 유인하게 있다는 것은 분명하다.

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Acknowledgments

저자는 생물막 성장 프로토콜과 존 바티스타 (Fluxion, 샌프란시스코, CA) Bioflux 시스템에 관한 기술적 인 문제에 관한 조언을 수립하는 데 도움을 윌리엄 낸스 (미시간 대학) 감사합니다. 창업 자금 AHR에 (AHR에 R21DE018820 NIH)와 미시간 대학이 작품은 국립 보건원에 의해 지원되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는
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Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

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