Summary
Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive bruken av et mikrofluidsystem for utvikling av multi-arter biofilmer som inneholder arter vanligvis identifisert i human supragingival dental plakk. Metoder for å beskrive biofilm arkitektur, biofilm levedyktighet, og en tilnærming til å høste biofilm for kulturavhengig eller kulturuavhengig analyser er uthevet.
Abstract
Det er få høy gjennomstrømming in vitro-systemer som letter utviklingen av flerbestands biofilmer som inneholder mange arter som vanligvis oppdages innenfor in vivo muntlige biofilm. Videre er et system som bruker naturlig menneskelig spytt som næringskilde, i stedet for kunstige medier, særlig ønskelig for å støtte uttrykket av cellulære og biofilmspesifikke egenskaper som etterligner in vivo lokalsamfunn. Vi beskriver en fremgangsmåte for utvikling av multi-art orale biofilmer som er sammenlignbare med hensyn til sammensetning art, å supragingival dental plakk, under betingelser som ligner på den menneskelige munnhulen. Konkret vil dette metoder artikkelen beskriver hvordan en kommersielt tilgjengelig microfluidic system kan tilpasses til rette for utvikling av flerbestands muntlige biofilmer avledet fra og vokst innenfor samlet spytt. Videre kan en beskrivelse av hvordan systemet brukes i forbindelse med en confocal laser scanning mikroskop for å generere 3D-biofilm rekonstruksjoner for arkitektoniske og levedyktighet analyser vil bli presentert. Gitt den brede mangfold av mikroorganismer som vokser innenfor biofilmer i microfluidic system (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, og Porphyromonas), vil en protokoll også bli presentert som beskriver hvordan du høste biofilmceller for ytterligere subkultur eller DNA-ekstraksjon og analyse. Grensene til både microfluidic biofilm system og dagens state-of-the-art dataanalyser vil bli behandlet. Til syvende og sist, er det for seg at denne artikkelen vil gi en baseline teknikk som vil forbedre studie av oral biofilm og hjelp i utviklingen av flere teknologier som kan integreres med microfluidic plattform.
Introduction
Biofilmer er arkitektonisk komplekse samfunn av bakterier som aggregeres på overflater 1. Disse samfunnene typisk inneholde mange arter som samhandler med hverandre innenfor biofilm to. Muntlige biofilmer, den mest visuelt iøynefallende være plakk, er et vedvarende problem hos mennesker og deres ukontrollerte utviklingsresultater i generering av taksonomisk diverse flerartssamfunn tre. Komponent bakterier av disse ulike samfunnene kan være opptil 1000 ganger mer motstandsdyktig mot antibiotika enn sine frittflytende (planktoniske) kolleger 4-6. Unnlatelse av å behandle disse muntlige biofilmsamfunn, noe som kan føre til karies og periodontal sykdom, har resultert i en betydelig offentlig helsebelastning: over 500 millioner besøk til tannlegen kontoret per år i USA, og en ca $ 108 000 000 000 for å behandle eller forebygge periodontal sykdom og tannråte 7.
innhold ">" Mens mange mikrobiologer argumentere studere mikrobiell oppførsel under naturlige forhold, noen av dem gjøre det. Dette er fordi deres moral for å overvinne vanskelighetene er stadig tappet av den attraktive enkel å jobbe med laboratoriekulturer. "-Smith 8.I dag, er oral biofilm forskning utført ved hjelp av en rekke in vivo og in vitro tilnærminger, hver med sine egne fordeler og ulemper 9,10. In vitro nærmer ofte bruker modellbiofilmsystemer som er relativt enkelt å sette opp, men kan mangle klinisk / virkelige verden relevans 10,11. In vivo tilnærminger vanligvis stole på dyremodellsystemer som kan gjengi visse aspekter ved den menneskelige muntlig miljø, men igjen lider av begrensninger på grunn av forskjeller i anatomi, fysiologi, mikrobiologi og immunologi mellom dyr og mennesker 12, 13. Det bør bemerkes at orale biofilmerkan også utvikles på emaljerte overflater holdt i en stent i munn av frivillige mennesker, men denne tilnærmingen er i dag relativt kostbart og arbeidskrevende 14,15. Til syvende og sist, er nye midler eller teknologier for å forbedre munnpleie testet på mennesker under kontrollerte kliniske studier forhold 11. I dag er en ofte brukt modus operandi for å identifisere og evaluere nye orale helsetjenester agenter for å først utføre laboratoriestudier for å skjelne potensiell effekt, og deretter utføre dyreforsøk og "feltforsøk" som ansetter leger for å vurdere effekten av teknologien 9, 16,17. Dessverre, laboratoriestudier har en tendens til å stole på modellsystemer som opptar en stor plass, er teknologisk utfordrende å bruke, og inneholder ofte forenklet samfunn av ett eller høyst noen få arter å utlede potensiell virkelige verden betyr 10,18. Gitt at dental plakk biofilmer inneholde flere arter og form i en komplex flyter spytt miljøet, utvikle biofilm som inneholder ett eller noen få arter i kunstige medier vil neppe kunne gi lokalsamfunn som oppfører seg på en lignende måte som de i et realistisk scenario 10,19. For å adressere tid, kostnader, krav til opplæring, og de fattige representant natur laboratorium modellbiofilmsystemer i forhold til den virkelige verden miljø, vi har nylig utviklet en høy gjennomstrømming og miljø germane biofilm system 20 (figur 1). Systemet tilbyr bruk av mobilfrie pooled menneskelig spytt (CFS) som medium og ubehandlet sammenslått humant bakteriecellen holdig spytt (CCS) som inokulum. Unikt, kombinerer systemet også microfluidic teknologi, et konfokal laser scanning mikroskop, og kulturuavhengig bakteriell mangfold analyse-teknologi. Således er modellsystemet miljømessig germane (ved hjelp av spytt som inokulum til å vokse multiarts biofilmer ved 37 ° C i filter-sterilisert strømmerspytt) og den muntlige biofilmer inneholde arter (inkludert Streptococcus, Neisseria, Veillonella og Porphyromonas arter) i hopetall er representative for de som finnes i tidlig supragingival plakett 20.
Når de vurderer at dette arbeidet beskriver bruk av den nyutviklede modellsystemet, må spesiell oppmerksomhet gis til sammenslåing av et konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) MicroFluidics, og kulturuavhengig mangfold analyseteknologier. Unionen av disse teknologiene ved vår forskningsgruppe var tilsiktet og ikke bare legger en høy gjennomstrømming evne til den nyutviklede modellsystemet, men tillater også spørsmål som skal stilles som ikke kunne være lett adressert før med andre systemer. For det første har CLSM distinkte fordeler i forhold til tradisjonell mikroskopi som gjør det mulig for tredimensjonal analyse av biofilmer. Ofte lite verdsatt, dette er ekstremt viktig som biofilm er heterogene viddh hensyn på artssammensetning og romlig posisjon, så vel som de fysiologiske betingelser som pålegges på forskjellige romlige steder i biofilmen 6,21. I konsert med tredimensjonal gjengivelse programvare og programvare for bildeanalyse, biofilm arkitektur, romlige relasjoner mellom komponent arter, og omfanget av antimikrobiell drap kan analyseres 22-24. Slike evner er ikke mulig å bruke standard overført lys eller epifluorescence mikroskopi. Deretter har MicroFluidics fått særlig oppmerksomhet innen mikrobiologi som gjør det mulig å studere biofilmer under nøye kontrollerte betingelser (strømning, temperatur, pH, etc.) og krever bare små volumer av væske 25-27. Som et utgangspunkt for sammenligning, vokser en oral biofilm i humant spytt i en strømningscelle modell system (et system som uten tvil betraktes som bærebjelken modell for mange orale biofilm studier) i 20 timer ved en tilsvarende strømningshastighet og skjærkraft som det som ble oppnåddi et mikrofluidsystem krever minst 200 ml, i motsetning til 800 ul i mikrofluid enheten 28-31. Dermed gjør en mikrofluid modell biofilm system studiet av kvantitet begrenset materiale under definerte forhold. Endelig har Pyrosekvensering teknologi blitt optimalisert i det siste tiåret til å kreve bare små mengder av materialet for å utføre en analyse fellesskap og er tilstrekkelig allsidig til å kontrollere dybden av sekvensering for å oppnå identiteten til og med sjeldne biofilm arter. Bruk av denne teknologien, som bakteriell tag-kodet FLX amplicon Pyrosekvensering (bTEFAP), har gjort det mulig for relevante spørsmål om økologi av biofilm tas opp 32,33. Slike spørsmål yret vanskeligheter i det siste når Pyrosekvensering var ikke tilgjengelig på grunn av tid og kostnader som kreves for å skape plasmid biblioteker og de komplekse teknologiske og analytiske trinnene som kreves for å utlede data 33,34. Selvfølgelig en stor fordel med kulturuavhengig apgangsmåter, slik som Pyrosekvensering, som er den bakterielle arter som ikke kan dyrkes i isolasjon i konvensjonell laboratoriemedier (dvs. levedyktige, men ikke dyrkbare arter) kan dyrkes og identifisert i modellsystemet og deres relative overflod i fellesskap kvantifisert 35, 36 . For å legge perspektiv, så tidlig som i 1963 anslått sen Sigmund Socransky at ca. 50% av bakteriene i materialet isolert fra human oral gingival sprekken ikke kan dyrkes ved hjelp av laboratorievekstbetingelser 37.
Målet med denne fremgangsmåter papir er å beskrive tilnærming for å utvikle orale multiarts biofilmer i en kommersielt tilgjengelig mikrofluid (Bioflux) system i henhold til: (i) betingelser er representative for den menneskelige munnhulen og (ii) med en art sammensetning og mengde at kan sammenlignes med supragingival plaque. Videre bruker både freeware og kommersiell programvare, merker vi hvordan grunnleggende biofilmarkitektur tiltak kan være avledet fra CLSM data, med fokus på metoder for å kvantifisere biofilm biomasse, råhet, og levedyktighet (basert på Levende / Døde farging). Endelig er de trinnene som kreves for å høste biofilm materiale for mangfold analyse av bTEFAP beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Spytt samling protokollen beskrevet her ble anmeldt av University of Michigan Institutional Review Board for human person Research.
MERK: Med hensyn til institusjonelle anmeldelser for menneske arbeid av denne typen, bør tidligere ordninger og tillatelser være fått fra vertsinstitusjonen. Spesielt avhengig av institusjonen, kan IRB eller etikk godkjenning må søkes og godkjennes før spytt samling fra frivillige kan fortsette. Som et hjelpemiddel til å forberede en søknad, kan en nyttig NIH algoritme / kart finnes her: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
1. Utarbeidelse av Pooled Spytt for bruk som et miljøvennlig Germane vekstmedium
- Rekruttere> 5 individer for spytt donasjon. Ikke ta noen identifiserende informasjon, sikre at ingen enkeltmennesketals vil donere spytt hvis de er syke, eller har tatt antibiotika de siste tre månedene, eller har konsumert mat eller væske, med unntak av vann, i forrige 2 timer før donasjon.
- Samle spytt i 50 ml plastrør. Pool innsamlet spytt i et plastbeger, holde den på is. Ikke bruk glass som polymerer i spytt vil følge de interne glassflater.
- Legg Dithiothreitol (DTT) til en endelig konsentrasjon på 2,5 mM fra en 100X stamløsning. (Stock er frosset i engangs delmengder ved -20 ° C). Omrør i 10 min i et plastbegerglass på is.
- For å fjerne partikler, sentrifuger sammenslåtte spytt i 30 minutter ved 17.500 x g.
- Fortynn spytt med 3 volumer av dH 2 O for å gi en fjerdedel konsentrert spytt.
- Filter-sterilisere spytt bruker 0,22 mikrometer polyetersulfon (PES), lav proteinbinding filter. Bruk filter med stor overflate, eller bruke flere små området filtre. Hold spytt i enplastbeholder på is mens filtrering.
- Fryse den sammenslåtte spytt ved -80 ° C i 50 ml plastrør inntil nødvendig for å dyrke bakterier. Hver plastrøret er for en bruker, og bør ikke inneholde mer enn 35 ml som hver mikrofluid tillegg inneholder et maksimum på 1,2 ml (1,2 ml x 24 brønner = 28,8 ml) og plass som er nødvendig i hvert rør som spytt utvider seg ved frysing.
- For bruk, tine den sammenslåtte spytt ved romtemperatur. Tint, filter-sterilisere gang (0,22 mikrometer polyetersulfon, lav proteinbinding filter for å fjerne bunnfall).
2. Utarbeidelse av Pooled Spytt for bruk som en Inokulum
- Rekruttere> 5 individer for spytt donasjon. Ikke ta noen identifiserende informasjon, sikre at ingen enkeltpersoner vil donere spytt hvis de er syke, har tatt antibiotika de siste tre månedene, eller har konsumert mat eller væske, med unntak av vann, i forrige 2 timer før donasjon. Samle samples over 30 min.
- Samle spytt i 50 ml plast-reagensrør ved romtemperatur og samle det oppsamlede spytt i et plastbegerglass ved romtemperatur.
- Fortynn samle spytt med Autoclaved generelle reagenskvalitet glyserol for å gi et papir med et sluttforhold på 25% glycerol, 75% celle-inneholdende spytt [CCS].
- Fryse spytt ved -80 ° C i 3 ml engangs alikvoter inntil nødvendig.
- Når det er nødvendig å inokulere den mikrofluidsystem, blir aliquoter tint ved romtemperatur, og omrørt forsiktig i en vortex i 5 sekunder før den ble pipettert over i mikrofluidsystem som beskrevet i trinn 3 i protokollen nedenfor.
3. Vekst av Oral Multi-arter Biofilm
- CFS forbehandling
- Første strøk de Bioflux microfluidic kanaler med CFS. Tilsett 100 mL av CFS til hvert uttak også. Bruke Bioflux kontroll programvare, velg "manuell" og sette flyt fra kanaler "B1-B24" that skal brukes.
- Deretter setter skjær til 1,0 dyn / cm og starte strømningen i 2 minutter ved romtemperatur for å sikre homogen fordeling av CFS gjennom kanalen. Sørg for at det er væske i hver innløpskanal for å kontrollere at CFS strømmet gjennom alle kanaler jevnt.
- Inkuber platen ved romtemperatur i 20 min.
- Ta av CFS / forbehandling løsning som gjenstår i uttaket brønner og overføre til innløps brønner. Denne totalvolum på 100 ul vil tjene til å balansere mot trykket påføres inokulum fra utløpet brønnen.
- Inoculation
- Til hvert uttak godt, tilsett 100 mL av CCS pode. Plasser microfluidic plate på varmeplaten (temperatur satt til 37 ° C), velger manuell innenfor styringsprogramvaren, og sette flyt fra outlet brønner til inntaksbrønner (dvs. omvendt) ved 1,0 dyne / cm² for nøyaktig 6 sek.
- Inkuber mikrofluid plate ved 37 ° C i 40 min for å tillatefor første tilslutning og vekst av bakterier i inokulum.
- Overnatter Vekst
- For de inokulerte kanaler som brukes, aspirere avfallet inokulum fra hver av utløpsbrønnene. Legg opp til en ml totale volumet av CFS i hver av inntaksbrønner (kan gjøres på toppen av eksisterende CFS).
- Inkuber microfluidic plate ved 37 ° C, velge manuell og sette programmet til å kjøre på 0,2 dyne / cm² 20 timer.
- Stain forvask
- Aspirer all væske fra innløps- og utløpsbrønner og tilsett 100 ul av PBS (pH 7,4) til hver av innløps brønner. Flyte i 20 min ved 0,2 dyne / cm².
- Stain blanding tillegg
- For celleviabilitet farging gjør 100 ul av flekken blanding for hver kanal å bli farget. Spesifikt, tilsett 3 pl SYTO 9 og 3 pl propidiumjodid per ml PBS bruker det kommersielle celle levedyktighet flekker kit som LIVE / DEAD. Dette generereren farging blanding som inneholder 10 mikrometer SYTO 9 og 60 mikrometer propidiumjodid.
- Aspirere den gjenværende PBS fra innløpet brønner og tilsett 100 ul av cellelevedyktighet flekken blandingen til hvert innløp godt. Satt til å flyte på 0,2 dyn / cm2 og drives løsningen fra innløpet til utløpet i 45 minutter ved romtemperatur.
- Post-farging vask
- Aspirere den gjenværende flekk i hvert av innløps brønner og tilsett 100 ul PBS til hver innløps godt. Satt til å flyte på 0,2 dyn / cm og kjøre PBS-løsning fra innløpet til utløpet i 20 minutter ved romtemperatur for å fjerne eventuelt overskudd av flekk.
4. bildesamlingen, 3D-gjengivelse, og bildeanalyse
- Bruk en invertert konfokal laser scanning mikroskop (CLSM) til å samle biofilm bildedata fra microfluidic system. Kontroller at CLSM er i stand til å tåle vekten av Bioflux plate, som kan nå 150 g.
MERK: Gitt kronensions av microfluidic kanaler, behovet for sensitivitet til å skjelne biofilmstrukturen, og kravene for å detektere fluorescens-signal med varierende intensitet, passer CLSM med en 40X 1.25 NA objektiv eller en med tilsvarende optisk kvalitet, forstørrelse og numerisk apertur. - Standardisere de utslipps fange porter med gain og offset målinger holdes konstant. Sørg for at laseren effekten ikke overstiger 25%, da dette kan resultere i foto-bleking.
- Konvertere CLSM filer fra L EICA jeg mage F ile type (LIF) til OME (O penn M icroscopy E nvironment) filtype. Dette gir større enkel tilgang og kompatibilitet mellom programmer. Bruk kommersielt tilgjengelig programvare som, IMARIS å konvertere filer til denne typen.
3D Rendering for Images / Tall
- Når konvertert til OME format, kan du bruke kommersielt tilgjengelig programvare som IMARIS å gjengi bildenei 3D. Utfør dette ved hjelp av en kombinasjon av "Easy3D" og "overgå" alternativer.
MERK: Oppmerksomhet til bakgrunnssignal og thresholding bør gjøres. Histogrammet funksjon i IMARIS kan brukes for å oppnå samling området, og dette bør holdes konstant mellom bilder som analyseres. - Lagre bilder ved bruk av "snapshot" -funksjonen og gjør nøye overveielse til bildeoppløsning før du lagrer filtyper.
- Montere bilder til figurer med hjelp av programvare som Coreldraw eller Adobe Illustrator.
3D Image Analysis for grafer og tabeller
- Bruke fritt tilgjengelig ImageJ 23 og COMSTAT / COMSTAT2 38 for bildeanalyse. Laste ned pakkene fra http://rsb.info.nih.gov/ij/ og http://comstat.dk/ hhv. Har den nyeste Java oppdateringen installert.
MERK: programvareplattform JAVA må være installert PRIOr til bruk av bildeanalyse-programvare.- Bruk ImageJ programvare med COMSTAT2 plugin for å importere OME filer for hver biofilm bilde i "hyperstack" -modus og utsikt med "delt kanaler".
- Individuelt analysere de to kanalene (rød / propidium-iodide / dead vesen kanal 0, grønn / SYTO-9 / LIVE være kanal 1) i "histogram" funksjon av ImageJ. Denne funksjonen viser det totale antall piksler av 8-bits OME filer (vist som "teller") på hver farge intensitet fra 0 til 255 (vist som "verdi"), der 0 er piksler uten signaler (bakgrunn) og 255 vesen piksler med klar signal metning.
- Eksportere dataene inn i et regnearkprogram og standardisere alle signalverdier ved å vekte hver piksel av den tilsvarende signal intensitet. Dette blir utført ved å multiplisere den totale telling i en gitt signalintensitet ved den numeriske åtte-biters verdi (0-255) av det signalintensitet.
- Sum alle vektede verdier, 0-255, for begge kanaler for hver biofilm bilde tatt. Ta summen av de veide verdier for begge kanaler for å bestemme den prosentvise totale signalet fra enten kanal. Gjør dette for å bestemme den relative forholdet eller prosent rød og prosent grønt signal (dvs. prosent "DEAD" og prosent "LIVE" for hver behandling).
- Utføre statistiske analyser, for eksempel ved hjelp av to-tailed T-test modifisert for ulik varians. Verdier på p <0,05 anses som betydelig og disse verdier for p <0,01 anses som svært signifikant.
5. Høsting Biofilm Cells for Kultur-uavhengig analyse
- Fjern alle brukt og ubrukt spytt fra innløps- og utløps brønner. Vask brønnene med 1 ml sterilt destillert vann tre ganger.
- Tilsett 100 ul sterilt destillert vann til innløps brønner og, ved hjelp av programvaren kontrollgrensesnitt, passerersterilt destillert vann frem gjennom kanalene på> 8,0 dyn / cm 2 (strømningsrate> 745 ul / time, skjærkraft på 800 s-1) i minst 5 min. Gjenta i motsatt retning i minst 5 min og deretter gjenta forover og bakover vasketrinn prosess.
- Kontroller ved lys eller ved epifluorescens mikroskopi (hvis cellene ble farget / merket) for grundig fjerning av biofilm (figur 2). Samle 100 ul celle-suspensjon og oppbevares ved -80 ° C for kultur-uavhengige analyser. En kostnadseffektiv analyse av samfunnet sammensetning kan oppnås ved å bruke bakterie tag-kodet FLX amplikon Pyrosekvensering (bTEFAP) ved hjelp av fremgangsmåten som angitt i xXNanceXx et al. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-gjengivelse av Biofilm
Representative resultater er vist i figur 3. Et nyttig verktøy i IMARIS programvare er muligheten til å undersøke hver bit av det oppsamlede biofilm stabelen, og for å kombinere dem for å skape tredimensjonale rekonstruksjoner. I tillegg kan kunstige skyggeeffekter tilsettes for å hjelpe visuelt tolke tredimensjonale strukturer. De gjengitte biofilmer kan tiltes i alle retninger med forskjellige forstørrelser å utforske biofilm eller mikro-koloni struktur. Bildene presentert i fig. 3 viser resultatet av behandling av et oralt multi-art biofilm. Legg spesielt merke er at behandling med 70% etanol resulterte i betydelig fargeendring for det meste av biofilmen (fra grønt til rødt), noe som tyder på betydelig celle-celle-død eller skade. De store mikrokolonier viste seg å inneholde flere døde celler enn de underliggende (og nå synlige) mikro-koloni-celler. Such et utfall er tenkes grunn til å de-adhesjon av biofilmceller fordi etanol er en membran-aktiv antimikrobiell. Ved å konvertere filene til OME format og å analysere de gjengitte stabler i ImageJ, kan det sees ved å påføre histogram funksjoner at mengden av rødt og grønt signal er omvendt proporsjonal mellom de ubehandlede biofilmer og de som ble behandlet med etanol.
Kvantifisering av Biofilm Properties
Tabell 1 viser gjennomsnitt og standardavvik av viktige strukturelle parametere. En viktig fordel ved å bruke IMARIS, ImageJ og COMSTAT, er at hvis IMARIS brukes først, kan OME filer genereres slik at filer som skal pipeline gjennom ImageJ og COMSTAT. Eksempel data som er presentert i tabell 1 viser at behandling av de orale biofilmer med 70% etanol, resulterte i en meget betydelig reduksjon i levedyktighet fra 80,8% til 28,3%. Etanol kan føre til at noen celleskader og strukturell cHanges i biofilmer men dette er ofte ganger ikke målbart signifikant forskjellig. Her ble ingen forskjeller i mål på gjennomsnittlig biovolume, gjennomsnittlig tykkelse og gjennomsnittlig ruhet registrert (tabell 1).
Figur 1. Bioflux mikrofluid oral biofilmsystem. (A) Et diagram som viser et vertikalt tverrsnitt av den Bioflux system som samtidig er montert på en invertert SPE CLSM. (B) En annotert (svarte linjer) fotografi fremheve to microfluidic kanaler og innløps- og utløps brønner. (C) Et eksempel på bruk av to-dimensjonale Levende / døde flekker oral biofilm som har blitt behandlet med en 0,01% CPC oppløsning resulterer i heterogene dreping, delvis på grunn av reaksjons diffusjonsbegrensning. Grønn farge indikerer levende celler, fargetmed Syto 9; rødfargede cellene er døde eller skadet og farget med propidiumjodid Fig. 1A og 1B fra Nance et al. 20 med tillatelse. Bar i fig. 1C representerer 30 mikrometer.
Figur 2. Bruk av konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) for å generere to dimensjonale og tre-dimensjonale visninger av utførte 20 timers biofilmer. Disse biofilmer ble utviklet i sammenslått cellefritt spytt (CFS) fra et inokulum av sammenslått celle-inneholdende spytt (CCS). En ubehandlet biofilm samfunnet (venstre kolonne på bildene) er sammenlignet mot en 70% etanol behandlet biofilm samfunnet og en representant biofilm er vist i forskjellige plan syn (XY, XZ, og ZYZ). Histogrammer som viser forskjellene i rødt (døde / skadede celler) og grønn (levende celler) enre for hver bildestakk (logget data vist i svart og ikke-registrerte data vist i grått). Alle data er avledet fra 8 bits bilder, og dermed på en skala fra (i trinn 256) 0-255. Skala barer representerer 30 mikrometer.
Figur 3. Flytskjema som viser utfallet av utvinning / høsting på 20 timer oral multi-arter biofilm (utviklet fra en CCS inoculum i rennende CFS) fra Bioflux microfluidic enheten ved hjelp av forhøyet skjær / flyt teknikk. Stiplede linjer er anvendt til bildene for å hjelpe til å bestemme plasseringen av kanalveggene. Den fellesskap sammensetningen av høstet biofilm kan analyseres ved 454 Pyrosekvensering teknologier som bakteriell tag-kodet FLX amplikon Pyrosekvensering (bTEFAP) og uttrykkes på flere taksonomiske nivåer (Rekke gjennom arter) avhengig requirements. Det er vist et eksempel på samfunnet sammensetning, på rekken nivå av biofilmer høstet fra tre microfluidic kanaler. Stolper representerer skala i mikrometer.
| Parameter / Behandling | Ubehandlet | 70% EtOH |
| Gjennomsnittlig Livskraftig (%) | 80.8 (0.9) | 28.3 (5.8) ** |
| Gjennomsnittlig Biovolume (mikrometer 3 / mikrometer 2) | 17.7 (8.4) | 16.1 (3.0) |
| Gjennomsnittlig Tykkelse (mikrometer 2) | 23.3 (11.3) | 15.6 (6.4) |
| Gjennomsnittlig Roughness | 0,4 (0,3) | 0.50 (0.2) |
Tabell 1. Kvantifisering av biofilm egenskaper av ubehandlet og 70% etanol behandlet 20 timers biofilmer utviklet i sammenslått celle-fri spytt (CFS) fra en pode celle holdig spytt (CCS). Fet verdiene er gjennomsnitt og ikke-fet verdier i parentes er standardavvikene. Dataene er fra at-minst fem bilder fra tre microfluidic kanaler. Signifikante forskjeller til ubehandlet kontroll er markert med en stjerne (** P <0,01%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette metoder papiret fremhever de grunnleggende trinnene som kreves for å installere og kjøre en microfluidic system på en måte å gi rom for utvikling av muntlige flerbestands biofilmer avledet fra sammenslått humant spytt og dyrket i filter-sterilisert 25% samlet menneskelig spytt. Tilnærminger for å karakterisere biofilm er gitt, men det bør bli husket at disse beskrives tilnærminger er modifiserbare og flere teknologier som, for eksempel, kan flekker eller etiketter bli innført. Som en sak av et eksempel, kan man tenkes å bruke merkede antistoffer eller innføre et fluoriserende belastning for å visualisere og undersøke den romlige posisjon av visse arter innen den orale multiarts biofilm. Videre, avhengig av modellen av mikrofluidsystem som benyttes, er det mulig å utvikle biofilmer under anaerobe forhold (i tilfelle av Bioflux systemet, er en teknisk notat tilgjengelig på Fluxion.com om dette).
Et viktig aspekt til Bioflux microfluidic system er kompatibilitet med flere teknologier, og dette er uthevet her ved evnen til å utføre kulturuavhengig mangfold analyser (figur 3). Mens de indre overflater av mikrofluidsystem enkelt ikke er tilgjengelig, under kraftig forover og revers strømning er gjør det mulig vesentlig biofilm biomasse som skal fjernes. Mens alle biofilmen ikke lett kan fjernes, og dette kan betraktes som en svakhet i systemet, er det relevant å merke seg at mange modellbiofilmsystemer har også en lignende problem og kravene fra slike innsamlede data må bli herdet med denne kunnskapen . For eksempel er det mulig at den overflod av streptokokker kan være høyere i biofilm enn faktisk bestemt eksperimentelt fordi mange Streptococcus arter har svært gode evner til å binde til spytt-belagte overflater 39.
Som med alle modellbiofilmsystemer, må man være oppmerksom på de spørsmålene som stilles. Feller eksempel, vil dette systemet ikke være egnet for langtidslangsgående studier. Et modellsystem som for eksempel en konstant dybde filmreaktor, en Sorbarod system, eller en drypp reaktor kan være mer passende 40-42. Selv, blir problemet med begrensede mengder av spytt for et modellsystem et problem som disse er ikke microfluidic-basert design. På en tilsvarende lys selv, kunne Bioflux systemet som er beskrevet her også tilpasses for studier av biofilmer i andre miljøer hvor biologiske væsker bare er tilgjengelige i små mengder. For eksempel kan dette inkluderer urin og sårvæske.
I konklusjonen, som med alle in vitro modellsystem, må man være bevisst de sterke og svake sider ved microfluidic system for vekst av muntlige biofilm. Mens mikrofluidsystem er uten tvil miljømessig germane og gir mulighet for utvikling av biofilmer som er sammensetnings ligner in vivo-situasjonen, er det ikke the samme som in vivo-situasjonen, og vil sannsynligvis ikke være slik. Et laboratorium modellsystem er bare så god som sine forutsetninger og mens microfluidic systemet har mange overlappinger med forholdene i den menneskelige munnhulen, faktorer som for eksempel vertsbaserte effekter og ekstern biotiske og abiotiske utfordringer (for eksempel gjennom drikking og spising) ikke kan være lett replikert. Det er imidlertid klart at høy gjennomstrømning naturen så vel som miljø og mikrobiologiske lapper med den virkelige verden oral situasjon gjør dette til et forlokkende microfluidic system for å gjøre spådommer før han gikk i logistisk utfordrende kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker William Nance (University of Michigan) for å få hjelp i utforming av biofilm vekst protokoller og John Battista (Flyteteksturer, San Francisco, California) for å få råd om teknologiske problemstillinger knyttet til Bioflux system. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 til AHR) og University of Michigan oppstart midler til AHR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent | |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system | |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system | |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices | |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices | |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Ultra Low Temperature Freezer -80 °C | Multiple choices | Multiple choices | |
| Tips (20, 200, and 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Software | |||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | ||
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
- Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
