Summary
Цель этого методы работы является описать использование микрофлюидном системы для развития биопленок многовидовых, которые содержат виды, как правило, выявленных в человеческой наддесневого зубного налета. Методы описания биопленки архитектуры, биопленки жизнеспособность, и подход к уборочной биопленки для культурно-зависимой или культурно-независимые анализы будут выделены.
Abstract
Есть несколько высокой пропускной в пробирке систем, которые способствуют развитию биопленки многовидовых, которые содержат многочисленные виды обычно обнаруженные в в естественных условиях устных биопленок. Кроме того, система, которая использует природный человеческой слюны в качестве питательной источника, вместо искусственных средах, особенно желательно, чтобы поддержать экспрессию клеточных и биопленки конкретных свойств, которые имитируют в естественных сообществ. Мы опишем метод для развития многопрофильных видов устных биопленок, которые сопоставимы по отношению к видовому составу, в наддесневые зубной налет, в условиях, аналогичных полости рта человека. В частности, это методы статья будет описывать, как в продаже Микрожидкостных система может быть адаптирована для облегчения разработки многовидовых устных биопленок, полученных из и вырос в объединенной слюны. Кроме того, описание того, как система может быть использована в сочетании с confocaл лазерный сканирующий микроскоп для получения 3-D биопленки реконструкции для архитектурных и жизнеспособности анализа будут представлены. Учитывая широкое разнообразие микроорганизмов, которые растут в пределах биопленки в микрожидкостных системы (в том числе стрептококков, Neisseria, Veillonella, Gemella и Porphyromonas), протокол также будут представлены описания того, как собрать биопленки клеток для дальнейшего субкультуры или экстракции ДНК и анализа. Пределы как микрожидкостных системы биопленки и текущее состояние в самых современных анализов данных будут устранены. В конечном счете, предполагается, что эта статья даст базовый метод, который позволит улучшить изучение устных биопленок и помочь в разработке дополнительных технологий, которые могут быть интегрированы с микрожидкостных платформы.
Introduction
Биопленки архитектурно сложные сообщества бактерий, которые агрегируются на поверхности 1. Эти общины, как правило, содержат многочисленные виды, которые взаимодействуют друг с другом в рамках биопленки 2. Устные биопленки, наиболее визуально заметным является зубной налет, являются постоянной проблемой в людях и их бесконтрольное результаты развития в поколение таксономически различных общин многовидовых 3. Компонент бактерии этих различных групп может быть до 1000 раз более устойчивы к противомикробным препаратам, чем их свободно плавающих (планктонных) экземплярах 4-6. Отказ от лечения эти устные биопленки сообщества, которые могут вызвать кариес и пародонтоз, привело к значительному бремени государственного медицинского: более 500 миллионов посещений в офисе дантиста годовых в США, и примерно 108 000 000 000 $ для лечения или профилактики пародонта болезни и кариес 7.
Содержание ">" В то время как многие микробиологи выступают изучения микробного поведения в естественных условиях, лишь немногие из них сделать. Это потому, что их боевой дух для преодоления трудностей постоянно подрывается в привлекательной простоты работы с лабораторными культурами ». -Smith 8.В настоящее время, оральный исследования биопленки проводится с использованием различных, в естественных условиях и в пробирке подходов, каждый со своими преимуществами и недостатками 9,10. В пробирке подходы часто используют модельные системы биопленки, которые являются относительно легко создать, но может не хватать клинические / в реальном мире актуальность 10,11. В естественных условиях подходы, как правило, полагаются на животных моделях, которые могут воспроизводить определенные аспекты среды полости рта человека, но опять же страдают от ограничений в связи с различиями в анатомии, физиологии, микробиологии и иммунологии между людьми и животными 12, 13. Следует отметить, что оральные биопленкитакже могут быть разработаны на поверхности эмали, проводимых в стента в устьях добровольцах, но этот подход в настоящее время относительно дорогостоящим и трудоемким 14,15. В конечном счете, новые препараты или технологии, чтобы улучшить полостью рта являются испытания на людях в контролируемых клинических условиях судебного разбирательства 11. В настоящее время часто используются методы работы по выявлению и оценке новых пероральных препаратов Здравоохранение сначала выполнить лабораторные исследования, чтобы выявить потенциальную эффективность, а затем выполните исследований на животных и "полевые испытания", которые используют врачам оценить успешность технологии 9, 16,17. К сожалению, лабораторные исследования, как правило, зависят от модельных систем, которые занимают большой след, технологически сложным в использовании, и часто содержат упрощена сообщества один или самое большее несколько видов, чтобы получить потенциальную реального мира означает 10,18. Учитывая, что зубной налет биопленки содержать несколько видов и формы в комплэкс течет слюны среду, развитие биопленки, которые содержат один или несколько видов в искусственных средах вряд ли генерировать общин, которые ведут себя подобным образом, как и в реальной ситуации 10,19. Для решения время, стоимость, требования к профессиональной подготовке, а бедные представительный характер лаборатория модельных систем биопленки по сравнению с реальной среде, мы недавно разработали высокую пропускную способность и экологически уместны систему биопленки 20 (рисунок 1). Система выгоды от использования бесклеточной объединенной человеческой слюны (КПБ) как средний и лечить объединяются человек бактериальная клетка, содержащие слюны (CCS) в качестве посевного материала. Уникально, система также объединяет микрофлюидальный технологии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и культуры независимой технологии анализа бактериальной разнообразия. Таким образом, модель системы является экологически уместны (с помощью слюны, как посевной расти биопленки Многовидовые на 37 ° С в фильтр-стерилизовать течетслюна) и устные биопленки содержат виды (включая Streptococcus, Neisseria, Veillonella и видов Porphyromonas) в численности, представитель те, что в начале наддесневого налета 20.
Если учесть, что эта работа описывает использование недавно разработанной модельной системы, особое внимание должно быть уделено объединения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) микрофлюидики и технологий анализа разнообразие культурно-независимыми. Объединение этих технологий нашей исследовательской группы было преднамеренным, а не только добавляет возможность с высокой пропускной во вновь разработанной модельной системы, но также позволяет задаваемых вопросов, которые не могут быть легко решены до с другими системами. Во-первых, CLSM имеет явные преимущества по сравнению с традиционными микроскопии, так как позволяет для трехмерного анализа биопленок. Часто недооценивают, это очень важно, так как биопленки являются гетерогенными остроумиеч относительно видового состава и пространственного положения, а также физиологические условия быть введены в различных пространственных местах в пределах биопленки 6,21. В концерте с трехмерной программного обеспечения визуализации и программного обеспечения для анализа изображений, архитектуры биопленки, пространственных отношений между составляющих его видов и степени антибактериальной убийства могут быть проанализированы 22-24. Такие способности невозможно с использованием стандартного проходящего света или эпифлуоресцентной микроскопии. Далее, микрофлюидики собрал особое внимание в области микробиологии, так как позволяет изучение биопленок в тщательно контролируемых условиях (расход, температура, рН и т.д.) и требует только небольших объемов жидкости 25-27. В качестве отправной точки для сравнения, рост устный биопленки в слюне человека в рамках модели проточной ячейки системы (система, которая, возможно, считается основой образцом для многих оральных исследований биопленки) в течение 20 ч при аналогичной скорости потока и сдвига, как достичьв микрожидкостных системы требует, по крайней мере, 200 мл, в противоположность 800 мкл в микрожидкостных устройств 28-31. Таким образом, Микрожидкостных модель системы биопленки позволяет исследовать количество ограниченных материала при определенных условиях. Наконец, пиросеквенирования технология была оптимизирована в последнее десятилетие требуют лишь небольшое количество материала для выполнения анализа сообщество и достаточно универсален, чтобы контролировать глубину последовательности, чтобы получить идентичность даже редких видов биопленки. Использование этой технологии, такие как бактериальный тегом в кодировке FLX ампликон пиросеквенирования (bTEFAP), позволило актуальных вопросов, касающихся экологии биопленок решать 32,33. Такие вопросы проникнуты трудности в прошлом, когда пиросеквенирования не были доступны из-за времени и затрат, необходимых для создания плазмиды библиотеки и сложные технологические и аналитические шаги, необходимые для получения данных 33,34. Конечно, большое преимущество с культурно-независимый APжается, такие как Пиросеквенирование, является то, что виды бактерий, которые не могут быть выращены в изоляции в обычных лабораторных средах (т.е. жизнеспособные, но не культивируемой видов) могут быть выращены и определены в модельной системе, и их относительное содержание в сообществе количественно 35, 36 , Чтобы добавить перспективу, а уже в 1963 году, в конце Зигмунд Socransky, что приблизительно 50% бактерий в материале, выделенных из полости рта человека десны щель не может быть культивировать, используя условия роста лаборатория 37.
Цель этого методы работы является описать подход для разработки устные биопленки Многовидовые в коммерчески доступных микрожидкостных (Bioflux) системы: (I) условий представителя полости рта человека и (II) с видового состава и численности, что сравнима с наддесневого налета. Кроме того, как с помощью бесплатных и коммерческих программ мы выделяем как основной биопленкиархитектура меры могут быть получены из данных CLSM, с акцентом на подходы к количественной оценке биопленки биомассы, шероховатости и жизнеспособность (на основе Live / Dead окрашивания). Наконец, шаги, необходимые для сбора биопленки материал для анализа разнообразии bTEFAP описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол коллекция слюна описано здесь был рассмотрен Мичиганского университета, ведомственного комитета по исследованию человеческого субъекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отношении институциональных мнений человеческого субъекта работ на эту тему, предварительные договоренности и разрешения должны быть получил от принимающей организации. В частности, в зависимости от учреждения, IRB или утверждение этики, возможно, необходимо искать и утверждены до слюна коллекция из добровольцев может продолжиться. В помощь готовит заявку, полезно NIH алгоритм / график можно найти здесь: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
1. Подготовка объединенных слюне для использования в качестве экологически уместны ростовой среде
- Набирать> 5 лиц за слюны пожертвования. Не принимать какие-либо идентифицирующую информацию, убедиться в отсутствии individuALS будет пожертвовать слюну, если они больны или принимали пероральные антибиотики в течение последних 3 месяцев, или потребляли пищу или жидкости, за исключением воды, в предыдущем 2 ч до процедуры изъятия.
- Сбор слюны в 50 мл пластиковые пробирки. Бассейн собранную слюну в пластиковом стакане, сохраняя его на льду. Не используйте стакан полимеры в слюне будет придерживаться внутренних стеклянных поверхностей.
- Добавить дитиотреитола (DTT) до конечной концентрации 2,5 мМ с 100x наличии. (Фото заморожен в одноразовых аликвоты при -20 ° С). Перемешивают в течение 10 мин в пластиковом стакане на льду.
- Для того чтобы удалить твердые частицы, центрифуги объединены слюны в течение 30 мин при 17500 х г.
- Развести слюну с 3-х томах ЦТ 2 O, чтобы дать одной четвертой сосредоточены слюну.
- Фильтр-стерилизовать слюны, используя 0,22 мкм полиэфирсульфон (PES), низкий Связывание с белками фильтр. Используйте фильтр с большой площадью поверхности, или использовать несколько небольших фильтров по зоне. Держите слюны впластиковый контейнер на льду при фильтрации.
- Замораживание ходе исследований слюны при -80 ° С в 50 мл пластиковые пробирки, пока это необходимо выращивать бактерии. Каждый пластиковая трубка является одной только для использования и не должны содержать не более 35 мл в каждый Микрожидкостных хорошо держит максимум 1,2 мл (1,2 мл х 24 лунок = 28,8 мл) и пространство необходимо в каждой пробирке, как слюна расширяет процессе замораживания.
- Для использования, оттепель ходе исследований слюны при комнатной температуре. После оттаивания, фильтр-стерилизовать еще раз (0,22 мкм полиэфирсульфоновой, низкая степень связывания с белками фильтр для удаления любых осадков).
2. Подготовка объединенных слюне для использования в качестве инокулята
- Набирать> 5 лиц за слюны пожертвования. Не принимать какие-либо идентифицирующую информацию, убедиться в отсутствии лица, не пожертвует слюну, если они больны, взяли антибиотики в течение последних 3 месяцев, или потребляли пищу или жидкости, за исключением воды, в предыдущем 2 ч до процедуры изъятия. Сбор SAmples более 30 мин.
- Сбор слюны в 50 мл пластиковые пробирки при комнатной температуре и объединить собранную слюны в пластиковом химическом стакане при комнатной температуре.
- Развести объединенного слюны с автоклавного целом химически чистой глицерина с получением состава с конечной соотношении 25% глицерина, 75% клеток, содержащих слюны [CCS].
- Замораживание слюну при -80 ° С в 3 мл одноразовых аликвоты пока нет необходимости.
- При необходимости сделать прививку микрожидкостных систему аликвоты, оттаивают при комнатной температуре и осторожно перемешивают на вихревом смесителе в течение 5 сек, прежде чем пипеткой в микрожидкостных системы, как описано в шаге 3 протокола, ниже.
3. Рост Устные биопленки Многовидовые
- CFS предварительной обработки
- Первый слой микрожидкостных каналы Bioflux с CFS. Добавить 100 мкл CFS к каждому выходу также. Использование программного обеспечения управления Bioflux, выберите "ручной" и установить поток от каналов "B1-B24" Thaт должны быть использованы.
- Далее, набор сдвига до 1,0 дин / см и начать подачу в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы обеспечить равномерное распределение по всей CFS канала. Убедитесь в наличии жидкости в каждой впускной канал, чтобы убедиться, что CFS текла через все каналы равномерно.
- Инкубируют планшет при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Снимите CFS / Обрабатывайте решение, которое остается в выпускных скважин и передать впускных скважин. Это общий объем 100 мкл будет служить, чтобы сбалансировать в отношении используемого давления для инокулята из розетки также.
- Прививка
- Для каждой торговой точке, добавьте 100 мкл CCS посева. Поместите микрожидкостных пластину на нагревательной пластине (температуры, установленной на 37 ° C), выберите инструкцию в программном обеспечении управления, а также настроить поток от розетки скважин на впускных скважин (т.е. назад) на 1,0 дин / см ровно 6 сек.
- Инкубируйте микрожидкостных пластину при 37 ° С в течение 40 мин, чтобы позволитьдля начального присоединения и роста бактерий в инокулята.
- Ночь роста
- Для используемого инокулированные каналов, аспирации посевной отходов от каждого из выпускных скважин. Добавить до 1 мл общего объема CFS в каждый из впускных скважин (может быть сделано в верхней части существующей CFS).
- Выдержите микрожидкостных пластину на 37 ° C, выберите Вручную и установить программу, чтобы работать на 0,2 дин / см в течение 20 часов.
- Пятно предварительная стирка
- Аспирируйте все жидкости из впускных и выпускных скважин и добавить 100 мкл PBS (рН 7,4), к каждому из входных скважин. Поток в течение 20 мин в 0,2 дин / см.
- Пятно смесь дополнение
- Для окрашивания жизнеспособность клеток составляют 100 мкл пятен смеси для каждого канала, быть окрашены. В частности, добавить 3 мкл SYTO 9 и 3 мкл пропидийиодидом на мл PBS с использованием коммерческой жизнеспособности клеток окрашиванием набора, такого как LIVE / DEAD. Это создаетОкрашивание смесь, содержащую 10 мкМ SYTO 9 и 60 мкМ пропидийиодидом.
- Аспирируйте оставшегося PBS из впускных скважин, а затем добавить 100 мкл жизнеспособности клеток пятен смеси к каждому входе также. Набор течь в 0,2 дин / см 2 и запустить решение от входа к выходу в течение 45 мин при комнатной температуре.
- После окрашивания мыть
- Аспирируйте оставшееся пятно в каждом из впускных скважин и добавить 100 мкл PBS к каждой входе также. Набор течь в 0,2 дин / см и запустить решение PBS от входа к выходу в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы удалить любой избыток пятно.
4. Сбор Image, 3D-рендеринг и анализ изображений
- Используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для сбора данных биопленки изображения из микрожидкостных системы. Убедитесь, что CLSM способен выдержать вес Bioflux пластины, которая может достигать 150 г.
Примечание: данное копейкиnsions микрожидкостных каналов, потребность в чувствительности различать структуру биопленки, а также требования для обнаружения сигнала флуоресценции различной интенсивности, установите CLSM с 40X 1,25 NA объектива или один с аналогичным оптического качества, увеличении и числовой апертурой. - Стандартизировать захвата выбросов ворота с усиления и смещения причем измерения постоянной. Убедитесь, что мощность лазера не превышает 25%, так как это может привести к фото-отбеливание.
- Преобразование CLSM файлы из L EICA я маг F типа Иль (LIF), чтобы OME (O ручка M icroscopy E nvironment) Тип файла. Это обеспечивает большую простоту доступа и совместимости программного обеспечения. Используйте имеющийся в продаже программного обеспечения, таких как, Imaris конвертировать файлы этого типа.
3D-рендеринг для изображений / фигуры
- После преобразования в формат OME, использовать имеющиеся в продаже программного обеспечения, таких как Imaris чтобы сделать изображенияв 3D. Выполните это, используя комбинацию "Easy3D" и "превзойти" вариантов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внимание фонового сигнала и порога должно быть сделано. Гистограмма в Imaris может быть использован для получения спектра сбора и это должно быть постоянным между изображениями анализируются. - Сохранение изображений с помощью функции «моментальный снимок» и сделать тщательного рассмотрения в разрешении изображения перед сохранением типов файлов.
- Соберите изображений в цифры, используя программное обеспечение для редактирования изображений, такие как CorelDraw или Adobe Illustrator.
3D Анализ изображений для графики и таблицы
- Используйте свободно доступны ImageJ 23 и КОМСТАТ / COMSTAT2 38 для анализа изображений. Скачать пакеты с http://rsb.info.nih.gov/ij/ и http://comstat.dk/, соответственно. У самых последнее обновление Java установлена.
ПРИМЕЧАНИЕ: программная платформа JAVA будет необходимо установить Prioг с использованием программного обеспечения для анализа изображений.- Используйте программное обеспечение ImageJ с COMSTAT2 плагин для импорта файлов OME для каждого биопленки изображения в режиме "HyperStack" и видом с «расколом каналов".
- Индивидуально анализа двух каналов (красный / пропидий-йодид / мертвых существо канал 0, зеленый / SYTO-9 / живое существо 1 канал) с помощью функции «Гистограмма» в ImageJ. Эта функция перечисляет общее количество пикселей 8-битных файлов OME (показана как "кол") на каждой интенсивности цвета от 0 до 255 (показана как "ценность"), где 0 пикселей при отсутствии сигнала (фон) и 255 существа пикселей с полным насыщением сигнала.
- Экспорт данных в программу электронной таблицы и стандартизации всех значений сигнала, путем взвешивания каждого пикселя на соответствующий интенсивности сигнала. Это выполняется путем умножения на общее количество данной интенсивности сигнала путем численного 8-битное значение (0-255) этой интенсивности сигнала.
- Сложите все взвешенные ценности, 0-255, для обоих каналов для каждого биопленки изображения, захваченного. Возьмем сумма взвешенных значений для обоих каналов, чтобы определить процентное общее сигнал от каждой канала. Сделайте это, чтобы определить относительную соотношение или процент красный и процентов зеленого сигнала (т.е. процент "мертвых" и процентов "живого" для каждой обработки).
- Выполнить статистический анализ, например, с помощью Стьюдента-тест Стьюдента модифицированный неравного дисперсии. Значения р <0,05 считаются существенными и те значения р <0,01 считаются весьма значительными.
5. Сбор биопленки Клетки для культурно-независимый анализ
- Удалить все отработанное и неиспользуемые слюны впускных и выпускных скважин. Вымойте скважин с 1 мл стерильной дистиллированной воды три раза.
- Добавить 100 мкл стерильной дистиллированной воды к впускным скважин и, используя интерфейс управления программное обеспечение, пройтистерильной дистиллированной воды вперед через каналы в> 8,0 дин / см 2 (скорость потока> 745 мкл / час, сдвига 800 сек -1), по меньшей мере, 5 мин. Повторите в обратном направлении в течение по меньшей мере 5 мин, а затем повторить в прямом и обратном стадии промывки процесс.
- Проверьте светом или эпифлуоресцентной микроскопии (если клетки окрашивали / помечены) для тщательного удаления биопленки (рис 2). Соберите 100 мкл клеток-подвески и хранить при температуре -80 ° С в течение культурно-независимого анализа. Экономически эффективный анализ составе сообществ может быть достигнуто за счет использования бактерий тегов в кодировке FLX ампликона пиросеквенирования (bTEFAP), используя подход, описанный в Нэнса и др. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D-рендеринг биопленок
Представитель результаты показаны на рисунке 3. Полезный инструмент в Imaris программного обеспечения является возможность исследовать каждый кусочек собранного пакета биопленки и объединить их, чтобы создать трехмерные реконструкции. Кроме того, искусственные эффекты затенения могут быть добавлены, чтобы помочь визуально интерпретировать трехмерных структур. Оказанных биопленки могут быть ориентированы в любом направлении с различными увеличениями, чтобы исследовать биопленки или микро-колонии структуру. Изображения, представленные на рис. 3 показать результат лечения устного биопленки многовидового. Особо следует отметить, что лечение с 70% этанола привели к значительным изменениям цвета для большинства биопленки (от зеленого до красного), предполагая, значительное сотовый смерть или сотовый ущерб. Большие микро-колонии появились содержать более мертвых клеток, чем основных (и сейчас подвергаются) микро-колонии клеток. Sucч исход очевидно из-за де-адгезии клеток биопленки, так как этанол является мембрана-активное антимикробное. Путем преобразования файлов в формате OME и анализа оказываемых стеки в ImageJ, можно видеть, путем применения функции гистограммы, что количество красного и зеленого сигнала обратно пропорциональна между необработанными биопленки и тем обрабатывают этанолом.
Количественное биопленки Недвижимость
В таблице 1 приведены средние и стандартные отклонения ключевых структурных параметров. Ключевым преимуществом использования Imaris, ImageJ и КОМСТАТ, что если Imaris используется во-первых, OME файлы могут быть получены того, чтобы файлы, которые будут конвейерными через ImageJ и КОМСТАТ. Данные образцы, представленные в таблице 1 показано, что лечение устные биопленки с 70% этанола в результате весьма значительного падения в жизнеспособности от 80,8% до 28,3%. Этанол может вызвать некоторые повреждения клеток и структурную Changes в биопленки, но это часто раз не заметно, существенно различаются. Здесь нет различия в средней мер biovolume, средней толщины и средней шероховатостью не было обнаружено (Таблица 1).
Рисунок 1. Bioflux Микрожидкостных оральный система биопленки. (А) показана схема, представляющая вертикальное поперечное сечение системы Bioflux, будучи установлен на перевернутой SPE CLSM. (B) аннотированный (черные линии) фотография выделяя два микроканалов и впускные и выпускные колодцы. (С) Пример выводимого двумерной LIVE / мертвых цветного перорального биопленки, обработанной с 0,01% -ным раствором КПК в результате гетерогенной гибели, частично из-за реакции диффузии ограничений. Зеленый цвет указывает живые клетки, окрашенныес SYTO 9; красного цвета клетки мертвы или поврежден, и окрашивали пропидийиодидом. рис 1А и 1В из Нэнса и др. 20 с разрешения. Бар на рис. 1C представляет 30 мкм.
Рисунок 2. Использование конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) для создания двухмерных и трехмерных вид оказываемых 20 ч биопленки. Эти биопленки были разработаны в объединенной бесклеточной слюны (CFS) от посевного материала объединенных клеток, содержащих слюны (CCS). Лечить биопленки сообщества (левый столбец изображений) сравнивается с 70% этанола обрабатывают биопленки сообщества и представитель биопленки показано в разных плоскостях зрения (XY, XZ и Zyz). Гистограммы, показывающие различия в красный цвет (мертвых / поврежденные клетки) и зеленый (живые клетки), а,Re показано для каждого стека изображений (регистрируемые данные, указанные в черных и неправительственных организаций, вошли данных, приведенных в серый). Все данные получены из 8-битовых изображений и, таким образом, по шкале от 0-255 (256 шагом). Шкала бары представляют 30 мкм.
Рисунок 3. Блок-схема демонстрирует результат извлечения / уборки 20 ч устной биопленки многовидового (разработан с CCS посевного в потоке CFS) от микрожидкостных устройства Bioflux с использованием техники сдвига / потока повышенные. Пунктирные линии были применены к изображениям, чтобы помочь в определении местоположения стенок канала. Сообщество состав собранного биопленки могут быть проанализированы с помощью 454 Пиросеквенирование технологий, таких как бактериальный тега в кодировке FLX ампликона Пиросеквенирование (bTEFAP) и выражены в нескольких таксономических уровнях (Тип посредством видов) в зависимости от REQuirements. Показанный пример композиции сообщества, на уровне типу, биопленок, собранного из трех микроканалов. Полосы представляют шкалу в микронах.
| Параметр / Лечение | Необработанный | 70% этанол |
| Средняя Жизнеспособность (%) | 80,8 (0,9) | 28,3 (5,8) ** |
| Средняя Biovolume (мкм 3 / мкм 2) | 17,7 (8,4) | 16,1 (3,0) |
| Средняя толщина (мкм 2) | 23,3 (11,3) | 15,6 (6,4) |
| Средняя шероховатость | 0,4 (0,3) | 0,50 (0,2) |
Таблица 1. Количественное определение биопленки свойств необработанной и 70% этанола обрабатывают 20 ч биопленки, разработанные в складочный бесклеточный слюны (CFS) от клеток, содержащих слюны посевной (CCS). Жирным шрифтом, являются средними и не-Bolded значения в скобках приведены стандартные отклонения. Данные, по крайней-мере пять изображений из трех микроканалов. Значительные различия в необработанном контроле выделены звездочкой (** P <0,01%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это методы документе освещаются основные шаги, необходимые для установки и запуска микрофлюидальный систему таким образом, чтобы обеспечить развитие устного биопленки многовидовых, полученных из пула человеческой слюны и выращенных в фильтр-стерилизовать 25% объединенной человеческой слюны. Подходы к характеризуют биопленки приведены, но следует помнить, что эти описанные подходы модифицируемые и дополнительные технологии, такие как, например, пятна или метки могут быть введены. В самом Например, можно предположительно использовать меченые антитела или ввести флуоресцентный напряжение визуализации и изучения пространственного положения отдельных видов в полости биопленки многовидового. Кроме того, в зависимости от модели микрожидкостных системы используется, можно разработать биопленки в анаэробных условиях (в случае системы Bioflux, техническое замечание можно получить на Fluxion.com по этому вопросу).
Ключевым аспектом в микрофлюидных BiofluxСистема IC является его совместимость с различными технологиями и оно будет выделено здесь способность выполнять культурно-независимый разнообразие анализа (рис 3). В то время как внутренние поверхности микрожидкостных системы не являются легкодоступными, энергичный вперед и обратного потока ли включить значительную биомассу биопленки быть удалены. Хотя все биопленки не могут быть легко удалены, и это можно было бы считать слабость к системе, это уместно отметить, что многие системы модель биопленки также аналогичный вопрос и претензий от любых таких собранных данных, должны быть закаленное с этим знанием , Например, вполне возможно, что обилие стрептококков может быть выше в биопленки, чем на самом деле экспериментально определена, так как многие виды Streptococcus имеют исключительно хорошие способности связываться с покрытием слюны поверхностей 39.
Как и во всех модельных систем биопленки, надо иметь в виду, что вопросы, которые спрашивают. Fили пример, эта система не подходит для долгосрочных продольных исследований. Модель системы, такие как постоянное реактора глубина пленки, системы Sorbarod, или в реакторе капельного может быть более подходящим 40-42. Хотя, проблема ограниченных количествах слюны для модельной системы становится вопрос, как это не дизайн Микрожидкостных основе. Подобным света, хотя, система Bioflux описано здесь, также могут быть адаптированы для изучения биопленки в других средах, где биологические жидкости только в небольших количествах. Например, это может включать мочи и раневого экссудата.
В заключение, как и с любым в пробирке модель системы, нужно быть осведомлены о сильных и слабых сторонах микрожидкостных системы для роста устных биопленок. В то время как Микрожидкостных система, возможно, экологически уместны и позволяет для развития биопленок, которые композиционно напоминает ситуацию в естественных условиях, не гое же, как и ситуации в естественных условиях и, вероятно, никогда бы так. Лабораторная модель системы такое же хорошее, как и его предположения и в то время Микрожидкостных система имеет много пересекается с условиями в полости рта человека, такие факторы, как хост приложениями и внешнего биотических и абиотических проблем (например, через питья и еды) не может быть легко репликации. Понятно, однако, что высокая пропускная способность природы, а также охраны окружающей среды и микробиологические пересекается с реальной устной ситуации сделать это заманчиво Микрожидкостных система для создания прогнозов, прежде чем вступать в материально-техническом сложных клинических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы благодарят Уильям ОБСЛУЖИВАНИЕ (Университет Мичигана) за помощью в разработке протоколов роста биопленки и Джон Баттиста (Прибоя, Сан-Франциско, Калифорния) за советом по поводу технологических вопросов, связанных с системой Bioflux. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья (NIH: R21DE018820 в AHR) и Мичиганского университета первоначальных средств на AHR
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent | |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system | |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system | |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices | |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices | |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Ultra Low Temperature Freezer -80 °C | Multiple choices | Multiple choices | |
| Tips (20, 200, and 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Software | |||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | ||
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
- Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
