Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Användning av en hög kapacitet Published: December 1, 2014 doi: 10.3791/52467
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Epidemiology, School of Public Health, The University of Michigan, 2Centre for Oral Health Research, School of Dental Sciences, Newcastle University

Summary

Målet med detta metoder papper är att beskriva användningen av ett mikroflödessystem för utveckling av multi arter biofilmer som innehåller arter vanligtvis identifierats i human supragingival plack. Metoder för att beskriva biofilm arkitektur, biofilm livskraft och ett förhållningssätt till skörde biofilm för kulturberoende eller kulturoberoende analyser är markerade.

Abstract

Det finns få hög genomströmning in vitro-system som underlättar utvecklingen av flerarts biofilmer som innehåller många arter som vanligen upptäcks inom in vivo orala biofilmer. Vidare är det särskilt önskvärt ett system som använder naturlig mänsklig saliv som näringskälla, istället för artificiell medier, i syfte att stödja uttrycket av cellulära och biofilmspecifika egenskaper som efterliknar in vivo samhällen. Vi beskriver en metod för utveckling av flera arter orala biofilmer som är jämförbara med avseende på artsammansättning, för att supragingival plack, enligt villkor som liknar människans munhålan. Konkret kommer detta metoder artikeln beskriver hur ett kommersiellt tillgängligt mikroflödessystem kan anpassas för att underlätta utvecklingen av flera arter orala biofilmer som härrör från och odlas inom poolade saliv. Dessutom kan en beskrivning av hur systemet ska användas tillsammans med en confocal laserskanning mikroskop för att generera 3D-biofilm rekonstruktioner för arkitektoniska och lönsamhetsanalyser kommer att presenteras. Med tanke på den breda mångfalden av mikroorganismer som växer inom biofilmer i mikroflödessystem (inklusive Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, och Porphyromonas), kommer ett protokoll också att presenteras som beskriver hur man skörda biofilmcellerna för ytterligare subkultur eller DNA-extraktion och analys. Gränserna för både mikroflödes biofilm systemet och de nuvarande state-of-the-art dataanalyser kommer att tas upp. Ytterst är det tänkt att denna artikel kommer att ge en baslinje teknik som kommer att förbättra studiet av orala biofilmer och stöd i utvecklingen av ytterligare tekniker som kan integreras med mikroflödes plattformen.

Introduction

Biofilmer är arkitektoniskt komplexa samhällen av bakterier som är aggregerade på ytor 1. Dessa samhällen innehåller vanligtvis många arter som interagerar med varandra inom biofilmen 2. Muntliga biofilmer, den mest visuellt iögonfallande är dental plack, är ett ständigt problem i människor och deras okontrollerade utvecklingsresultat i generering av taxonomiskt olika samhällen 3 flera arter. Komponent bakterier av dessa olika samhällen kan vara upp till 1000 gånger mer resistenta mot antibiotika än deras fritt flytande (plankton) motsvarigheter 4-6. Underlåtenhet att behandla dessa muntliga biofilm samhällen, vilket kan orsaka karies och tandlossning, har lett till en betydande folkhälsobörda: över 500 miljoner besök hos tandläkaren kontor per år i USA, och en ungefär $ 108.000.000.000 att behandla eller förebygga parodontal sjukdom och karies 7.

innehåll ">" Medan många mikrobiologer språkar studera mikrobiell beteende under naturliga förhållanden, några av dem göra det. Det beror på att deras moral för att övervinna de svårigheter ständigt tär av attraktiva enkel att arbeta med laboratoriekulturer. "-Smith 8.

För närvarande är orala biofilmen forskningen med hjälp av olika in vivo och in vitro metoder, missgynnar alla med sina egna fördelar och 9,10. In vitro närmar ofta använda modellbiofilmsystem som är relativt lätt att ställa upp, men kan sakna klinisk / verkliga relevans 10,11. In vivo metoder grundar sig oftast på djurmodellsystem som kan återge vissa aspekter av människans orala miljön, men återigen drabbas av begränsningar på grund av skillnader i anatomi, fysiologi, mikrobiologi och immunologi mellan djur och människor 12, 13. Det bör noteras att orala biofilmerkan också utvecklas på emaljytor som hölls i en stent inom munnen på frivilliga försökspersoner, men detta tillvägagångssätt är för närvarande relativt dyrt och arbetskrävande 14,15. Ytterst är nya medel eller tekniker för att förbättra oral sjukvård testas på människor under kontrollerade kliniska prövningsförhållanden 11. För närvarande är ett ofta använt arbetssätt för att identifiera och utvärdera nya orala vårdmedel för att först utföra laboratoriestudier att urskilja potentiella effekt, och sedan utföra djurstudier och "fältförsök" som sysselsätter kliniker att utvärdera framgången med tekniken 9, 16,17. Tyvärr, laboratoriestudier tenderar att förlita sig på modellsystem som upptar en stor fotavtryck, är tekniskt utmanande att använda, och ofta innehåller förenklade samhällen av en eller högst ett fåtal arter att härleda potentiella verkliga mening 10,18. Med tanke på att tand plack biofilmer innehåller flera arter och form i ett komplex flyter spott miljö, utveckla biofilmer som innehåller en eller ett fåtal arter i är osannolikt att generera samhällen som beter sig på ett liknande sätt som de i en verklighetstrogen scenario 10,19 artificiell medier. För att ta itu med tid, kostnad, utbildningskrav, och den dåliga representativitet av laboratoriemodellbiofilmsystem jämfört med verklighetstrogen miljö, nyligen utvecklat vi en hög genomströmning och miljö german biofilm systemet 20 (Figur 1). Systemet fördelarna med användning av cellfria sammanslagen human saliv (CFS) som medium och obehandlade poolat humant bakteriecell-innehållande saliv (CCS) som ett inokulum. Unikt, systemet kombinerar också mikroflödesteknik, en konfokala laserskanning mikroskop, och kultur oberoende bakteriell mångfald analysteknik. Således är modellsystemet miljö förbunden (med saliv som inokulat att växa biofilmer flera arter vid 37 ° C i filtersteriliserade flytersaliv) och de muntliga biofilmer innehåller arter (inklusive Streptococcus, Neisseria, Veillonella och Porphyromonas arter) i abundances representativa för de som finns i början av supragingival plack 20.

När man överväger att detta arbete beskriver användningen av det nyutvecklade modellsystem, måste särskild uppmärksamhet ägnas åt sammanslagningen av en konfokala laserskanning mikroskop (CLSM) mikrofluidik och kulturoberoende teknik mångfaldsanalys. Unionen av dessa tekniker genom vår forskargrupp var avsiktlig och inte bara lägger till en hög genomströmning förmåga att nyutvecklade modellsystem, men också tillåter frågor som ska ställas, som inte kunde vara lätt åtgärdas innan med andra system. För det första har CLSM distinkta fördelar gentemot traditionell mikroskopi eftersom det möjliggör för tre-dimensionell analys av biofilmer. Ofta föga uppskattad, detta är oerhört viktigt som biofilmer är heterogena with gäller artsammansättning och rumslig position samt de fysiologiska villkor ställs på olika rumsliga platser inom biofilmen 6,21. I samförstånd med tredimensionell rendering programvara och bildanalys programvara, biofilmen arkitektur, rumsliga relationer mellan arter komponent, och omfattningen av antimikrobiell dödande kan analyseras 22-24. Sådana förmågor är inte möjligt att använda standardfallande ljus eller epifluorescensmikroskopi. Därefter har mikrofluidik rönt särskild uppmärksamhet inom mikrobiologi, eftersom det möjliggör studier av biofilmer under noggrant kontrollerade förhållanden (flöde, temperatur, pH, etc.) och kräver endast små volymer av vätska 25-27. Som en jämförelse kan nämnas att växa en oral biofilm i mänsklig saliv i en flödescell modellsystem (ett system som utan tvekan anses stöttepelaren modell för många orala biofilm studier) under 20 timmar vid en liknande flöde och skjuvning som uppnåttsi ett mikrofluidsystem kräver minst 200 ml, i motsats till 800 ul i mikrofluidanordningen 28-31. Således möjliggör en mikroflödesmodell biofilm systemet studiet av kvantiteten begränsade materialet under definierade förhållanden. Slutligen har teknologin Pyrosequencing optimerats under det senaste decenniet för att kräva endast små mängder av material att utföra en gemenskap analys och är tillräckligt mångsidig för att styra djup av sekvense att få identiteten på ens sällsynta biofilm arter. Användningen av denna teknik, såsom bakteriell tagg-kodad FLX amplikon Pyrosequencing (bTEFAP), har gjort för relevanta frågor som rör ekologi biofilmer åtgärdas 32,33. Sådana frågor genomsyras svårigheter i det förflutna när Pyrosequencing inte var tillgängliga på grund av den tid och de kostnader som krävs för att skapa bibliotek plasmid och de komplexa tekniska och analytiska steg som krävs för att härleda uppgifter 33,34. Naturligtvis en stor fördel med kultur oberoende apvinklar, såsom pyrosekvensering, är att de bakteriearter som inte kan odlas isolerat inom konventionell laboratoriemedier (dvs. livskraftiga men icke odlingsbara arter) kan odlas och identifieras inom modellsystemet och deras utbredning i samhället kvantifieras 35, 36 . För att lägga till perspektiv, så tidigt som 1963, beräknade den sena Sigmund Socransky att cirka 50% av bakterierna i material som isolerats från människo orala tandköttsfickan inte kunde odlas med hjälp av laboratorietillväxtbetingelser 37.

Syftet med denna metoder papper är att beskriva det tillvägagångssätt att utveckla muntliga flerarts biofilmer i en kommersiellt tillgänglig mikroflödes (Bioflux) systemet under: (i) Villkor representativa för den mänskliga munhålan och (ii) med en artsammansättning och förekomst som är jämförbar med supragingival plack. Dessutom använder både freeware och kommersiell programvara, markerar vi hur grundläggande biofilmarkitektur åtgärder kan härledas från CLSM uppgifter, med fokus på metoder för att kvantifiera biofilm biomassa, råhet, och lönsamheten (baserat på Live / Dead färgning). Slutligen de steg som krävs för att skörda biofilms material för mångfald analys av bTEFAP beskrivs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Saliven samling protokoll som beskrivs häri granskades av University of Michigan Institutional Review Board för Försöksperson.
OBS: När det gäller institutionella recensioner för mänskliga subjektet arbete av denna typ bör tidigare arrangemang och tillstånd åter samlat från värdinstitutionen. I synnerhet beroende på institutet, IRB eller etik godkännande kan behöva sökas och godkännas innan saliv samling från frivilliga människor kan gå vidare. Som ett stöd för att förbereda en ansökan, kan en användbar NIH algoritm / sjökort finns här: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

1. Beredning av poolade Saliv för användning som en miljö Germane Growth Medium

  1. Rekrytera> 5 personer för saliv donation. Ta inte någon identifierande information, se någon individuals kommer att donera saliv om de är sjuka, eller har tagit orala antibiotika under de senaste 3 månaderna, eller har ätit mat eller vätska, med undantag för vatten, i den tidigare 2 tim före donationen.
  2. Samla saliv i 50 ml plaströr. Pool den insamlade saliv i en plastbägare, hålla den på is. Använd inte glas som polymerer i saliven kommer att följa de inre glasytor.
  3. Lägg ditiotreitol (DTT) till en slutkoncentration av 2,5 mM från en 100x lager. (Lager fryses i engångs portioner vid -20 ° C). Rör om under 10 min i en plastbägare på is.
  4. För att ta bort partiklar, centrifugera poolade saliv under 30 minuter vid 17.500 x g.
  5. Späd saliv med 3 volymer dH 2 O för att ge en fjärdedel koncentrerad saliv.
  6. Filter-sterilisera saliv använder 0,22 um polyetersulfon (PES), låg proteinbindning filter. Använd filter med stor yta, eller använd flera små area filter. Håll saliv i enplastbehållare på is medan filtrering.
  7. Frys den poolade saliv vid -80   ° C i 50 ml plaströr tills det behövs för att odla bakterier. Varje plaströr är endast en användning och bör inte innehålla mer än 35 ml som varje mikroflödes samt innehar högst 1,2 ml (1,2 ml x 24 brunnar = 28.8 ml) och utrymme behövs i varje rör som saliv expanderar under frysning.
  8. För användning, tina den poolade saliv vid rumstemperatur. När tinats, filter-sterilisera gång (0,22 um polyetersulfon, låg proteinbindning filter för att avlägsna eventuella fällningar).

2. beredning av poolade Saliv för användning som en Inokulum

  1. Rekrytera> 5 personer för saliv donation. Ta inte någon identifierande information, se några individer kommer att donera saliv om de är sjuka, har tagit orala antibiotika under de senaste 3 månaderna, eller har ätit mat eller vätska, med undantag för vatten, i den tidigare 2 tim före donationen. Samla samples över 30 min.
  2. Samla saliv i 50 ml plaströr vid rumstemperatur och förena den uppsamlade saliven i en plastbägare vid rumstemperatur.
  3. Späd poolade saliv med autoklaveras allmänna reagenskvalitet glycerol för att ge en lager med en slutlig förhållande på 25% glycerol, 75% cellhaltiga saliv [CCS].
  4. Freeze saliv vid -80 ° C i 3 ml engångs alikvoter tills det behövs.
  5. När så erfordras för att inokulera mikroflödessystem, alikvoter tinades vid rumstemperatur och omrördes försiktigt på en vortexer för 5 sek innan den pipetteras i mikroflödessystemet såsom beskrivs i steg 3 i protokollet, nedan.

3. Tillväxt av Oral Biofilmer Multi-arter

  1. CFS förbehandling
    1. Första belägga Bioflux mikroflödessystem kanaler med CFS. Lägg 100 fil CFS till varje uttag väl. Använda Bioflux styrprogram, välj "manuellt" och ställ flöde från kanalerna "B1-B24" that skall användas.
    2. Därefter ställer skjuvning till 1,0 dyn / cm ^ och starta flöde under 2 min vid rumstemperatur för att säkerställa homogen fördelning av CFS i hela kanalen. Se till att det finns vätska i varje inloppskanalen för att verifiera att CFS strömmade genom alla kanaler jämnt.
    3. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 20 min.
    4. Avlägsna CFS / förbehandla lösning som finns kvar i utloppsbrunnar och överföra till inloppsbrunnar. Denna total volym av 100 | il kommer att tjäna för att balansera mot det tryck som appliceras inokulatet från utloppet väl.
  2. Inokulering
    1. Till varje uttag väl, tillsätt 100 pl CCS inokulat. Placera mikroflödesplattan på värmeplattan (temperatur inställd på 37 ° C), väljer manuell inom styrprogram, och ställ flöde från utloppsbrunnar till inloppsbrunnar (dvs bakåt) vid 1,0 dyn / cm för exakt 6 sek.
    2. Inkubera mikroflödes plattan vid 37 ° C under 40 min för att tillåtaför initial vidhäftning och tillväxt av bakterierna i inokulumet.
  3. Tillväxt över natten
    1. För de inokulerade distributionskanaler används, aspirera avfall inokulat från var och en av utlopps brunnarna. Lägg till upp till 1 ml totala volymen av CFS i var och en av inloppsbrunnar (kan göras ovanpå befintlig CFS).
    2. Inkubera mikroflödesplatta vid 37 ° C, väljer manuell och ställa in programmet ska köras vid 0,2 dyn / cm under 20 timmar.
  4. Fläck förtvätt
    1. Aspirera all vätska från inlopps- och utlopps brunnarna och tillsätt 100 | il av PBS (pH 7,4) till var och en av inloppsbrunnar. Flöde för 20 min vid 0,2 dyn / cm ^.
  5. Fläck blandning tillsats
    1. För cell viabilitetsfärgning göra 100 | il fläckblandning för varje kanal som ska färgas. Specifikt till 3 pl SYTO 9 och 3 pl propidiumjodid per ml PBS använder kommersiella cellviabiliteten färgning kit såsom Live / Dead. Detta genereraren färgningsblandning innehållande 10 | iM SYTO 9 och 60 uM propidiumjodid.
    2. Aspirera återstående PBS från inlopps brunnarna och tillsätt sedan 100 | il av cellviabiliteten fläcken blandningen till varje inlopp väl. Ställ att flöda vid 0,2 dyn / cm 2 och kör lösningen från inlopp till utlopp för 45 min vid rumstemperatur.
  6. Post-färgning tvätt
    1. Aspirera återstående fläck i var och en av inlopps brunnarna och tillsätt 100 ul PBS till varje inlopp väl. Ställ att flöda vid 0,2 dyn / cm ^ och kör PBS-lösning från inlopp till utlopp för 20 min vid rumstemperatur för att avlägsna eventuellt överflödig färg.

4. Bildsamling, 3D-rendering, och bildanalys

  1. Använd en inverterad konfokala laserskanning mikroskop (CLSM) för att samla in biofilm bilddata från mikroflödessystem. Kontrollera att CLSM kan motstå vikten av Bioflux plattan, som kan nå 150 g.
    OBS: Med tanke på dimensions av mikroflödessystem kanaler, behovet av känsligheten att urskilja biofilm struktur, och kraven för att upptäcka fluorescenssignal av varierande intensitet, passa CLSM med en 40X 1,25 NA objektiv eller en med liknande optisk kvalitet, förstoring, och numerisk apertur.
  2. Standardisera capture utsläpps grindar med förstärkning och offset mätningar hålls konstant. Se till att lasereffekt inte överstiger 25% eftersom detta kan resultera i fotoblekning.
  3. Konvertera CLSM filer från L EICA jag Mage F ile typ (LIF) till ÖK (O penna M icroscopy M ILJÖ) filtyp. Detta möjliggör större lättillgänglighet och kompatibilitet mellan program. Använd separat inköpt programvara såsom Imaris att konvertera filer till den här typen.

3D-rendering för bilder / Siffror

  1. När konverteras till OME-format, använda kommersiellt tillgängliga program som Imaris att rendera bildernai 3D. Utför denna med hjälp av en kombination av "Easy3D" och "överträffar" alternativ.
    OBS: Uppmärksamhet på bakgrundssignalen och tröskel bör göras. Histogrammet funktion i Imaris kan användas för att erhålla uppsamlingsområde och detta bör hållas konstant mellan bilderna analyseras.
  2. Spara bilder med "ögonblicksbild" -funktionen och göra noga överväga bildupplösning innan du sparar filtyper.
  3. Montera bilder till siffror med bildbehandlingsprogram såsom Coreldraw eller Adobe Illustrator.

3D bildanalys för grafer och tabeller

  1. Använd fritt tillgängliga ImageJ 23 och COMSTAT / COMSTAT2 38 för bildanalys. Ladda paketen från http://rsb.info.nih.gov/ij/ och http://comstat.dk/, respektive. Har den senaste Java uppdatering installerad.
    OBS: Den mjukvaruplattform JAVA kommer behöva installeras prior till användning av den bildanalysmjukvara.
    1. Använd ImageJ programvara med COMSTAT2 plugin för att importera ÖK filer för varje biofilm bild i "Hypers" läge och utsikt med "delade kanaler".
    2. Individuellt analysera de två kanalerna (röd / propidium-jodid / dead varelse kanal 0, grön / SYTO-9 / LIVE vara kanal 1) med hjälp av "histogram" funktion ImageJ. Denna funktion listar det totala antalet pixlar i 8-bitars OME-filer (visas som "count") vid varje färgintensitet från 0 till 255 (visas som "värde"), där 0 är pixlar med ingen signal (bakgrunden) och 255 varelse pixlar med fullständig signalmättnad.
    3. Exportera data i ett kalkylprogram och standardisera alla signalvärden genom att vikta varje pixel med motsvarande signalintensitet. Detta utförs genom att multiplicera det totala antalet bakterier vid en given signalintensitet av den numeriska 8-bit-värdet (0-255) i nämnda signalintensitet.
    4. Summera alla viktade värden, 0-255, för båda kanalerna för varje biofilm bild som tagits. Ta summan av de viktade värdena för båda kanalerna för att bestämma den totala signal procent från endera kanalen. Gör detta för att bestämma den relativa förhållandet eller procent röd och procent grön signal (dvs. den procent "död" och procent "LIVE" för varje behandling).
    5. Utför statistiska analyser, exempelvis med användning av två-tailed T-test modifierats för olika varians. Värden på p <0,05 anses signifikanta och dessa värden på p <0,01 anses mycket signifikant.

5. Skörd Biofilm Celler för kultur-oberoende analys

  1. Ta bort allt använt och oanvänt saliv från in- och utloppsbrunnar. Tvätta brunnarna med 1 ml sterilt destillerat vatten tre gånger.
  2. Tillsätt 100 l sterilt destillerat vatten till inloppsbrunnar och, med hjälp av programvarustyrgränssnittet, passerasterilt destillerat vatten framåt genom kanalerna på> 8,0 dyn / cm 2 (flöde> 745 l / h, skjuvning av 800 sek -1) i minst 5 minuter. Upprepa i motsatt riktning i minst 5 minuter och sedan upprepa framåt och bakåt tvättsteg process.
  3. Kontrollera genom ljus eller genom epifluorescensmikroskopi (om celler färgades / märkta) för grundlig biofilm borttagning (Figur 2). Samla 100 ^ cellsuspension och förvara vid -80 ° C för kultur-oberoende analys. En kostnadseffektiv analys av gemenskap sammansättning kan uppnås genom att använda bakterie tagg-kodad FLX amplikon Pyrosequencing (bTEFAP) använder den metod som beskrivs i Nance et al. 20

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

3D-rendering av Biofilmer

Representativa resultat visas i figur 3. Ett användbart verktyg i Imaris mjukvaran är möjligheten att undersöka varje bit av den insamlade biofilm stacken och kombinera dem för att skapa tredimensionella rekonstruktioner. Dessutom kan konstgjorda skuggeffekter tillsättas för att hjälpa visuellt tolka tre-dimensionella strukturer. De renderade biofilmer kan orienterade i någon riktning med olika förstoringar att utforska biofilm eller mikrokolonistruktur. Bilderna visas i fig. 3 visar resultatet av behandling av en oral flerarts biofilm. Av särskilt intresse är att behandling med 70% etanol resulterade i betydande färgförändring för de flesta av biofilmen (från grönt till rött), vilket tyder på betydande celldöd eller cellskada. De stora mikrokolonier tycktes innehålla mer döda celler än de underliggande (och nu exponerade) mikrokoloniceller. Such ett utfall är möjligen på grund av att de-vidhäftning av biofilmceller eftersom etanol är ett membran aktiv antimikrobiell. Genom att omvandla filerna till OME format och analysera utförda staplar i ImageJ, kan det ses genom att applicera histogram funktioner att mängden röda och gröna signalen är omvänt proportionell mellan de obehandlade biofilmer och de som behandlades med etanol.

Kvantifiering av Biofilm Egenskaper

Tabell 1 visar medelvärden och standardavvikelser av viktiga strukturella parametrar. En viktig fördel med att använda Imaris, ImageJ och COMSTAT, är att om Imaris används först, kan ÖK-filer genereras för att tillåta filer som ska pipeline genom ImageJ och COMSTAT. Uppgifterna exempel som presenteras i Tabell 1 visar att behandling av orala biofilmer med 70% etanol resulterade i en mycket signifikant nedgång i lönsamheten från 80,8% till 28,3%. Etanol kan orsaka vissa cellskador och strukturell cHanges i biofilmer, men det är ofta gånger inte mätbart betydligt annorlunda. Här, observerades inga skillnader i åtgärder av genomsnittlig biovolym, genomsnittlig tjocklek och medelytråhet detekteras (Tabell 1).

Figur 1
Figur 1. Bioflux mikroflödes orala biofilmen systemet. (A) Ett diagram som visar en vertikal tvärsektion av Bioflux systemet medan är monterad på en inverterad SPE CLSM. (B) En kommenterad (svarta linjer) fotografi belyser två mikroflödeskanaler och in- och utloppsbrunnar. (C) Ett exempel på en renderade tvådimensionell Live / Dead färgas oral biofilm som har behandlats med en CPC-lösning 0,01% vilket resulterar i heterogena dödande, delvis beroende på reaktions diffusionsbegränsning. Grön färg indikerar levande celler, färgademed Syto 9; rödfärgade celler är döda eller skadade och färgas med propidiumjodid. Fig 1A och 1B från Nance et al. 20 med tillstånd. Bar i Fig. 1C representerar 30 pm.

Figur 2
Figur 2. Användning av konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) för att generera tvådimensionella och tredimensionella vyer av utförda 20 hr biofilmer. Dessa biofilmer utvecklades i poolade cellfria saliv (CFS) från ett inokulat av poolade cellinnehållande saliv (CCS). En obehandlad biofilm gemenskap (vänstra kolumnen av bilder) jämförs mot en 70% etanol behandlad biofilm gemenskap och en representativ biofilm visas i olika plan perspektiv (XY, XZ och Zyz). Histogram som visar skillnaderna i rött (döda / skadade celler) och grön (levande celler) are visas för varje bildstapel (loggade data som visas i svart och icke-inloggad data som visas i grått). All data kommer från 8 bitars bilder och därmed på en skala från (256 steg) 0-255. Skalstrecken representerar 30 | im.

Figur 3
Figur 3. Flödesschema som visar resultatet av utvinning / skörd av 20 timmar oralt flera arter biofilm (utvecklats från en CCS inokulat i strömmande CFS) från Bioflux mikroflödes enhet med förhöjda skjuvning / flödesteknik. Prickade linjer har tillämpats på bilderna för att hjälpa till att bestämma läget för kanalväggarna. Samhället sammansättning skördade biofilm kan analyseras med 454 Pyrosequencing teknik såsom bakteriell tagg-kodad FLX amplikon Pyrosequencing (bTEFAP) och uttryckte vid flera taxonomiska nivåer (fylum genom arter) beroende på requirements. Visas är ett exempel på samhällets sammansättning, på phylum nivå, av biofilmer skördas från tre mikrofluidikkanaler. Staplar representerar skala i mikrometer.

Parameter / Behandling Obehandlad 70% EtOH
Genomsnittlig Viabilitet (%) 80,8 (0,9) 28,3 (5,8) **
Genomsnittlig biovolym (xm 3 / xm 2) 17,7 (8,4) 16,1 (3,0)
Genomsnittlig Tjocklek (nm 2) 23,3 (11,3) 15,6 (6,4)
Medelytråhet 0,4 (0,3) 0,50 (0,2)

Tabell 1. Kvantifiering av biofilm egenskaper obehandlade och 70% etanol behandlade 20 hr biofilmer utvecklats i poolade cellfria saliv (CFS) från ett inokulat cellhaltiga saliv (CCS). Fet värden är medelvärden och icke-fetstil värden inom parentes är standardavvikelserna. Data är från at-minst fem bilder från tre mikrofluidikkanaler. Signifikanta skillnader i den obehandlade kontrollen är markerade med en asterisk (** P <0,01%).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta metoder papper belyser de grundläggande stegen som krävs för att installera och köra ett mikroflödessystem på ett sätt för att möjliggöra en utveckling av orala flerarts biofilmer som härrör från poolade mänsklig saliv och odlas i filtersteriliserad 25% poolade mänsklig saliv. Metoder för att karakterisera biofilmen ges men man bör komma ihåg att dessa beskrivna metoder är modifierbara och ytterligare tekniker som, till exempel, kan fläckar eller etiketter införas. I själva exempel kan man tänkas använda märkta antikroppar eller införa en fluorescerande stam att visualisera och undersöka den rumsliga positionen av vissa arter inom den orala flera arter biofilm. Dessutom beroende på modell av mikroflödessystem som används, är det möjligt att utveckla biofilmer under anaeroba förhållanden (i fallet med den Bioflux systemet, är en teknisk anmärkning finns på Fluxion.com om detta ämne).

En viktig aspekt till Bioflux mikrofluidIC-systemet är dess kompatibilitet med flera tekniker och detta markeras här av förmågan att utföra kultur oberoende mångfald analyser (Figur 3). Medan de inre ytorna av mikroflödessystem är inte lättillgänglig, kraftfull flödesriktningarna gör det möjligt betydande biofilm biomassa tas bort. Medan alla biofilmen inte lätt kan tas bort och detta kan ses som en svaghet i systemet, är det relevant att notera att många modellbiofilmsystem har också en liknande fråga och påståenden från sådana insamlade data måste dämpas med denna kunskap . Till exempel är det möjligt att det överflöd av streptokocker kan vara högre i biofilmen än att faktiskt experimentellt bestämd eftersom många Streptococcus arter har exceptionellt goda förmåga att binda till salivbelagda ytor 39.

Som med alla modell biofilmsystem, måste man vara uppmärksam på de frågor som ställs. Feller exempel skulle detta system inte vara lämplig för långtids longitudinella studier. Ett modellsystem, såsom en konstant djup filmreaktor, ett Sorbarod system eller en dropp reaktor kan vara lämpligare 40-42. Även blir problemet med begränsade mängder saliv för ett modellsystem en fråga som dessa inte mikroflödesbaserade konstruktioner. På ett liknande ljus men kunde Bioflux system som beskrivs här även anpassas för studier av biofilmer i andra miljöer där biologiska vätskor endast finns i små mängder. Exempelvis skulle detta innefatta urin och sårexsudat.

Sammanfattningsvis som med alla in vitro modellsystem, måste man vara medveten om styrkor och svagheter i mikroflödessystem för tillväxten av orala biofilmer. Medan mikroflödessystem är utan tvekan miljömässigt förbunden och möjliggör utveckling av biofilmer som är sammansättnings liknar situationen in vivo, är det inte the samma som situationen in vivo och kommer troligen aldrig att bli så. Ett laboratoriemodellsystem är bara så bra som dess antaganden och medan mikroflödessystem har många överlappningar med villkor inom den mänskliga munhålan, faktorer såsom värdbaserade effekter och externa biotiska och abiotiska utmaningar (t.ex. genom att dricka och äta) inte kan vara lätt replikeras. Det är dock klart att den höga genomströmningen natur samt miljö- och mikrobiologiska lappar med det verkliga orala situationen gör detta en lockande mikroflödessystem för att göra förutsägelser innan de vidtar logistiskt utmanande kliniska studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna tackar William Nance (University of Michigan) för att få hjälp med att formulera de biofilmtillväxtprotokoll och John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) för råd om tekniska frågor som rör Bioflux systemet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 till AHR) och University of Michigan startpeng till AHR

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-49D
Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP172-5
Sorval ultracentrifuge  (SS-34 compatible) Thermoscientific Unit-dependent
Thermo Scientific SS-34 Rotor  Thermoscientific 28-020
Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water Thermo  Scientific Inc 23-290-065
Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. VWR 73520-986 
Glycerol Thermo Fisher Scientific Inc NC0542269
BioFlux microfluidic system Fluxion Bioflux 200 system
Bioflux 24-channel plate Fluxion 910-0004
PBS (Gibco) Thermo Fisher Scientific Inc 10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)  Invitrogen L7012
Confocal Laser Scanning Microscope Lecia SPE or eqivalent system
Epifluorescence Microscope Multiple choices Multiple choices
Pyrosequencing facilities Multiple choices Multiple choices
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution Fisher Scientific 04-355-122
Ultra Low Temperature Freezer -80 °C Multiple choices Multiple choices
Tips (20, 200, and 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) Multiple choices Multiple choices
Software
Bioflux dedicated software Bioflux
Imaris Bitplane
Leica SPE Leica
ImageJ Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2 Freeware (http://www.comstat.dk/)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
  2. Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
  3. Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
  4. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  5. Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
  6. Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
  7. Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
  8. Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
  9. Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
  10. McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
  11. Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
  12. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
  13. Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
  14. Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
  15. Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
  16. Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
  17. Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
  18. Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
  19. Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
  20. Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
  21. Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  22. Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
  23. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  24. Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
  25. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
  26. Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  27. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  28. Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
  29. Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
  30. Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
  31. Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
  32. Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
  33. Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
  34. Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
  35. Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
  36. Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
  37. Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
  38. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  39. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
  40. Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
  41. Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
  42. Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).

Tags

Bioteknik Plack biofilm konfokal laserskanning mikroskopi tredimensionell struktur Pyrosequencing bildanalys bildrekonstruktion saliv modellering COMSTAT Imaris ImageJ flera arter biofilm samhällen.
Användning av en hög kapacitet<em&gt; In Vitro</em&gt; Mikrofluidumanordning System för att utveckla muntliga Biofilmer Multi-arter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S.,… More

Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. J. Vis. Exp. (94), e52467, doi:10.3791/52467 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter