Summary
Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.
Abstract
Yaygın in vivo sözlü biyofilm içinde tespit sayısız türler içeren çok tür biyofilm gelişimi kolaylaştırmak in vitro sistemlerde birkaç yüksek verimli vardır. Bundan başka, bunun yerine yapay ortam, besin kaynağı olarak, doğal insan tükürük kullanan bir sistem olup, in vivo toplulukları taklit hücresel ve biyofilm özgü özellikleri ekspresyonunu desteklemek için özellikle tercih edilir. İnsan ağız boşluğu benzer koşullar altında, diş plakları supragingival için, tür kompozisyonu ile ilgili olarak, karşılaştırılabilir çok türleri, oral biyofilm geliştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Özellikle, bu yöntemler makale piyasada mevcut mikroakışkan sistem türetilen çoklu türler sözlü biyofilm gelişimi kolaylaştırmak için uyarlanmış ve toplanmış tükürük içinde yetiştirilen nasıl anlatacağız. Ayrıca, ne sistemin bir açıklama confoca ile bağlantılı olarak da kullanılabilirl lazer tarama mikroskobu sunulacak mimari ve canlılık analizler için 3-D biyofilm yeniden inşa üretir. (Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella ve Porphyromonas dahil) mikroakışkan sistemde biyofilm içinde büyümek mikroorganizmaların geniş çeşitliliği dikkate alındığında, bir protokol ayrıca alt kültür veya DNA ekstraksiyon ve analiz için biyofilm hücreleri hasat nasıl açıklayan sunulacak. mikroakışkan biyofilm sistemi ve mevcut devlet-sanat veri analizleri, hem sınırları ele alınacaktır. Sonuçta, bu makalede, oral biyofilm çalışma artırmak ve mikroakışkan platformu ile entegre edilebilir ek teknolojilerin geliştirilmesine yardımcı olacak bir temel teknik sağlayacağı öngörülmektedir.
Introduction
Biyofilm mimari yüzeylerde 1 toplanır bakteri karmaşık topluluklar vardır. Bu topluluklar genellikle biyofilm 2 içinde birbirleriyle etkileşim sayısız türler içerirler. Sözlü biyofilm, görsel açıdan en göze çarpan olmak dental plak, bir insanlarda kalıcı bir sorun ve taksonomik çeşitli çoklu-tür toplulukların 3 nesil onların kontrolsüz gelişim sonuçları. Bu farklı toplulukların bileşeni bakteri serbest-yüzen (plankton) karşıtları 4-6 den antibiyotiklere daha dirençli 1.000 kata kadar olabilir. ABD'de yılda dişçi ofisine 500 milyon ziyaretleri ve yaklaşık 108.000.000.000 $ tedavi veya periodontal önlemek için: Diş çürüğü ve periodontal hastalığa neden olabilir bu oral biyofilm topluluklar, tedavi edilmemesi, önemli bir halk sağlığı yükü sonuçlandı Hastalık ve diş çürükleri 7.
zorlukları aşmak için kendi moral sürekli laboratuvar kültürleri ile çalışma çekici kolaylığı. "8 -Smith yıktığı çünkü içeriği"> "Birçok mikrobiyologlar, doğal koşullar altında mikrobiyal davranışı okuyan savunurken, bunların birkaç bunu. budur.Şu anda, sözlü biyofilm araştırma in vivo ve in vitro yaklaşımlar kullanarak çeşitli yapılır, kendi avantajları ve dezavantajları her 9,10. In vitro sık sık kurmak nispeten kolaydır ancak klinik olmayabilir modeli biyofilm sistemleri kullanmak yaklaşımlar / gerçek dünya alaka 10,11. in vivo yaklaşımlar genellikle insan ağız ortamında bazı yönlerini yeniden, ama yine sınırlamalar muzdarip nedeniyle hayvanlar arasındaki anatomi, fizyoloji, mikrobiyoloji ve immünoloji farklılıkları ve 12 insanlarda olabilir hayvan modeli sistemleri üzerine güveniyor, 13. Oral biyofilm unutulmamalıdırinsan gönüllülerin ağzından içinde stent düzenlenen emaye yüzeyler üzerinde geliştirilen, ancak bu yaklaşım halen nispeten pahalı ve emek-yoğun 14,15 olduğunu olabilir. Sonuçta, yeni ajanlar veya ağız sağlığı iyileştirmek için teknolojiler kontrollü klinik çalışma koşulları altında 11 insanlarda test edilir. Şu anda, yeni oral sağlık maddeleri tanımlamak ve değerlendirmek için sık sık kullanılan tarz operandi ilk laboratuvar çalışmaları, potansiyel etkinliği ayırt, ve sonra hayvan çalışmaları ve teknoloji 9 başarısını değerlendirmek için klinisyenlerin istihdam "alan denemeleri" gerçekleştirmek için gerçekleştirmek için, 16,17. Ne yazık ki, laboratuar çalışmaları büyük bir ayak izi işgal model sistemler güvenmek eğilimindedir, kullanmak için teknolojik zorlu ve genellikle 10,18 anlam potansiyeli gerçek dünyayı elde etmek için bir kaç türün biri ya da en toplulukları basitleştirilmiş içerir. Dental plak biyofilm bir compl birden türleri ve formu içerdiğini göz önüne alındığındaEski yapay ortam gerçek dünya senaryo 10,19 olanlara benzer bir şekilde davranan toplulukları oluşturmak için olası bir tane içeren biyofilm veya birkaç tür geliştirme, tükürük ortam dökülür. Zaman, maliyet, eğitim ihtiyaçlarını ve gerçek dünya ortamına göre laboratuar modeli biyofilm sistemlerinin zayıf temsilcisi doğasını ele almak için, biz son zamanlarda yüksek verim ve çevre germane biyofilm sistemi 20 (Şekil 1) geliştirdi. Bir aşı olarak orta ve muamele edilmemiş bir araya toplanmış insan bakteriyel hücre içeren tükürük (CCS) olarak hücre içermeyen havuzlanmış insan tükürük (CFS) kullanımı sistem yararlanır. Benzersiz, sistem aynı zamanda mikroakışkan teknoloji, bir konfokal lazer tarama mikroskobu ve kültür-bağımsız bakteriyel çeşitlilik analizi teknolojisini birleştiriyor. Böylece, model sistem bir inokulum 37 çoklu-tür biyofilm büyümeye olarak çevre germane (kullanarak tükürük olduğunu Filtre ve sterilize edilen akan C °tükürük) ve oral biyofilm erken supragingival plak 20 bulunanlara bolluğu temsilcisi Streptococcus, Neisseria, Veillonella ve Porphyromonas türler de dahil olmak üzere türler () içerirler.
Bu çalışma, yeni geliştirilen model sisteminin kullanımını açıklayan dikkate alındığında, özellikle dikkat konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) Mikroakiskan birleşmesi ve kültür-bağımsız çeşitlilik analizi teknolojileri verilmelidir. Bizim araştırma grubu tarafından bu teknolojilerin sendika kasıtlı ve sadece yeni geliştirilen model sistem için yüksek verimli yeteneği ekler, ama aynı zamanda sorular kolayca diğer sistemlerle daha önce ele olamazdı sordu sağlar. Bu biyofilm üç boyutlu analiz için izin verir İlk olarak, CLSM geleneksel mikroskobu üzerinde belirgin avantajları vardır. Biyofilm heterojen zekâ gibi Genellikle hesaba katılmayan, bu son derece önemlidirh tür kompozisyonu ve mekansal konumuna saygı yanı sıra fizyolojik koşullar biyofilm 6,21 içinde farklı mekansal yerlerde empoze ediliyor. Üç-boyutlu render yazılım ve görüntü analiz yazılımı, biyofilm mimarisi, bileşen türler arasındaki mekansal ilişkiler ve antimikrobiyal öldürme ölçüde uyum içinde 22-24 analiz edilebilir. Bu tür özellikler standart iletilen ışık veya Epifloresans mikroskopi kullanılarak mümkün değildir. Dikkatle kontrollü koşullar (akış, sıcaklık, pH, vb) kapsamında biyofilm çalışma sağlar ve sadece sıvı 25-27 küçük hacimlerde gerektirir Sonraki, Mikroakiskan mikrobiyoloji alanında özellikle dikkat çekmiştir. Bu elde edildiği gibi bir karşılaştırma noktası olarak, benzer bir akış hızı ve kesme kuvveti ile, 20 saat için bir akış hücresi modeli sistemi (muhtemelen bir çok ağız biyofilm çalışmaları için dayanak modeli olarak kabul edilir bir sistem) içinde, insan tükürük bir oral biyofilm büyüyenmikroakışkan cihaz 28-31 800 ul karşı bir mikro-akışkan sisteminde, en az 200 ml gerektirir. Böylece, bir mikroakışkan bir model biyofilm sistemi tanımlanmış koşullar altında miktarı sınırlı malzemenin çalışma sağlar. Son olarak, Pyrosequencing teknoloji bir topluluk analizi gerçekleştirmek için malzeme sadece küçük miktarlarda ihtiyaç için son on yılda optimize ve hatta nadir biyofilm türlerinin kimliğini elde etmek için dizilim derinliğini kontrol etmek yeterince çok yönlü olmuştur. Bu tür bakteri etiket kodlanmış FLX amplikonu Pyrosequencing (bTEFAP) olarak bu teknolojinin kullanımı, biyofilm ekolojisi ile ilgili ilgili sorular için izin verdi 32,33 ele alınması. Bu tür sorular Pyrosequencing çünkü zaman ve plazmid kütüphaneleri ve veri 33,34 türetmek için gerekli olan karmaşık teknolojik ve analitik adımları oluşturmak için gerekli maliyetlerin mevcut değildi geçmişte zorluklar aşılanmış. Kültür bağımsız ap ile Tabii ki, büyük bir avantajörneğin, piro sıralamadır gibi yaklaşımlar çok, geleneksel laboratuar ortamı (örneğin, canlı fakat sınırlayıcı olmayan bir ekilebilir türler) içinde ayrı olarak büyüyemez bakteri türleri büyütüldü ve tanımlanan model sistem camia içinde göreli bolluk, 36 35 sayısal edilebilmesidir . Gibi erken 1963 olarak perspektif eklemek için, merhum Sigmund Socransky insan oral dişeti çatlak izole malzeme bakterilerin yaklaşık% 50 laboratuvar büyüme koşulları 37 kullanılarak kültür olamazdı tahmin.
Bu yöntemler makalenin amacı altında piyasada mevcut mikroakışkan (Bioflux) sistemde oral çok tür biyofilm geliştirmek yaklaşımı tanımlamak için: (i) koşullar, insan oral kavite temsilcisi ve (ii) tür kompozisyonu ve bolluğu ile bu supragingival plak karşılaştırılabilir. Ayrıca, hem ücretsiz ve ticari yazılım kullanarak, biz nasıl temel biyofilm vurgulamakmimari önlemler biyofilm biyokütle, pürüzleri ve canlılığı ölçmek için yaklaşımlar odaklanarak, CLSM verilerinden elde edilebilir (Canlı / Ölü boyama dayalı). Son olarak, bTEFAP tarafından çeşitlilik analizi için biyofilm malzeme hasat için gerekli adımlar anlatılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada tarif edilen tükürük toplama protokolü İnsan Konu Araştırma Michigan Kurumsal Değerlendirme Kurulu Üniversitesi tarafından gözden geçirilmiştir.
NOT: Bu tip insan konu iş için kurumsal değerlendirmeleri ile ilgili, önceki düzenlemeler ve izinler ev sahibi kurumdan topladı edilmelidir. Özellikle, kuruma bağlı, IRB veya etik onay insan gönüllülerden tükürük toplama devam etmeden önce aranan ve onaylanması gerekebilir. Bir uygulamayı hazırlamak için bir yardım olarak, yararlı bir NIH algoritması / grafik burada bulabilirsiniz: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
Çevresel Germane Büyüme Ortamı Olarak Kullanımı için Toplanmış Salyasından 1. Hazırlık
- Tükürük bağışı için> 5 bireyleri. Hiçbir individu sağlamak, herhangi bir tanımlayıcı bilgileri almayınOnlar hasta, ya da son 3 ay içinde ağızdan antibiyotik almış, ya da yiyecek veya sıvı tüketilmesi varsa als bağış önce önceki 2 saat içinde, su dışında, tükürük bağışlayacak.
- 50 ml'lik plastik tüplere tükürük toplayın. Buz üzerinde tutarak, bir plastik bardağa toplanan tükürük havuzda toplayın. Tükürük polimerler iç cam yüzeylerine yapışır gibi cam kullanmayın.
- Bir 100x stoktan 2.5 mM nihai bir konsantrasyona kadar dithiothreitol (DTT) ekleyin. (Stok tek kullanımlık alikotları dondurulur -20 ° C). Buz üzerinde bir plastik kap içinde 10 dakika için karıştırın.
- Partikül madde ortadan kaldırmak için, santrifüj, 17.500 x g'de 30 dakika süre ile bir araya getirilmiş, tükürük.
- Dörtte biri konsantre tükürük vermek için dH 2 O 3 hacmi ile tükürük seyreltin.
- Filtre-sterilize 0.22 mikron polietersülfon (PES), düşük protein bağlayıcı filtre kullanarak tükürük. Geniş yüzey alanına sahip filtre kullanın, ya da birkaç küçük alan filtreleri kullanın. Bir de tükürük tutunbuz üzerinde plastik kap filtreleme süre.
- Toplanmış tükürük donma -80 50 ml'lik plastik tüplerde ° C bakteri büyümesi için gerekli olana kadar. Her bir plastik tüp tek kullanım içindir ve her bir mikroakışkan de 1.2 ml 'lik bir maksimum (1.2 mi x 24 kuyu = 28.8 mi) tutan ve tükürük dondurma sırasında genişlerken alanının her bir tüp içinde gerektiği gibi en fazla 35 ml içermelidir.
- Kullanım için, oda sıcaklığında bir araya toplanmış tükürük eritin. Bir kez çözülmüş, (herhangi bir çökeltilerin kaldırmak için 0.22 mikron polietersülfon, düşük protein bağlayıcı filtre) bir kez daha filtre sterilize.
Bir İnokulum olarak kullanım için Toplanmış Salyasından 2. Hazırlık
- Tükürük bağışı için> 5 bireyleri. Bağış önce önceki 2 saat içinde, su dışında, son 3 ay içinde ağızdan antibiyotik almış, ya da yiyecek veya sıvı tüketilen, herhangi bir tanımlayıcı bilgiler almak onlar hasta ise hiçbir bireyler tükürük bağışlayacak garanti etmeyin. Sa toplayın30 dakika içinde örnek olarak şunlar verilebilir.
- Oda sıcaklığında 50 ml plastik tüpler içinde tükürük toplamak ve oda sıcaklığında plastik bir çanak içinde toplanan tükürük havuz.
- % 25 gliserol, nihai oranı,% 75 hücre içeren tükürük [CCS] ile bir stok vermek üzere otoklava genel reaktif dereceli gliserol ile havuzlanmış tükürük seyreltin.
- Gerekli olana kadar 3 mi tek kullanımlık parçalar halinde -80 ° C'de tükürük dondurun.
- Mikroakışkan sistemi aşılamak için gerekli olan zaman, tümbölenler aşağıdaki protokol aşama 3'te tarif edildiği gibi mikro-akışkan sistemi pipetle edilmeden önce oda sıcaklığında çözülmüş ve 5 saniye boyunca bir vortexer hafifçe çalkalanır.
Ağız Çok türler Biyofilmler 3. Büyüme
- CFS ön arıtma
- İlk kat CFS ile Bioflux mikroakışkan kanallar. Her bir prize CFS 100 ul ekleyin. Bioflux kontrol yazılımı kullanarak, kanallardan "el" ve set akışını seçin "B1-B24" thakullanılmaması gerekmektedir.
- Daha sonra, 1.0 din / cm² kesme ayarlamak ve kanal boyunca CFS homojen dağılımını sağlamak için, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca akışını başlatmak. CFS eşit tüm kanallardan akan olduğunu doğrulamak için, her giriş kanalda sıvı olduğundan emin olun.
- 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir plaka inkübe edin.
- Çıkış kuyularda kalır CFS / ön işlem çözüm çıkarın ve giriş kuyuları transfer. 100 ul bu toplam hacim de çıkışından aşı uygulanan basınca karşı dengelemek için hizmet edecektir.
- Aşılama
- Her bir çıkışa, CCS inokulum 100 ul ekleyin. Tam 6 saniye boyunca 1.0 din / cm² giriş kuyuları (yani, ters) için mikroakışkan ısı plaka üzerinde plaka (sıcaklık 37 ° C olarak belirlenmiştir), kontrol yazılımı içinde seçme kılavuzu ve çıkış kuyulardan set akışını yerleştirin.
- 40 dakika izin vermek için 37 ° C'de mikro-akışkan plaka inkübeilk yapışkanlık ve aşı bakteri büyümesi için.
- Gece Büyüme
- Aşılanmış kanallar kullanılmak üzere, çıkış kuyuların her atık inokulum aspire. (Mevcut CFS üzerine yapılabilir) giriş deliklerinin her birine CFS 1 ml toplam hacme kadar ekleyin.
- 37 ° C'de mikroakışkan plaka inkübe, manuel seçin ve 20 saat için 0.2 din / cm² çalıştırmak için programı ayarlayabilirsiniz.
- Leke ön yıkama
- Giriş ve çıkış kuyu sıvı aspire tüm ve giriş bölümlerinin her birine 100 ul PBS (pH 7.4) ilave edin. 0.2 din / cm² 20 dakika boyunca akış.
- Leke karışım ekleme
- Hücre canlılığı, boyama için boyanmış, her bir kanal için leke karışımı 100 ul yapmak. Özellikle, Syto 9 3 ul ve DEAD / CANLI gibi ticari hücre canlılığı boyama kiti kullanılarak PBS ml başına propidium iyodür 3 ul ekleyin. Bu üretir10 uM Syto 9 ve 60 uM propidyum iyodür içeren bir boyama karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
- Giriş kuyulardan kalan PBS aspire ve sonra her bir girişine hücre canlılığı leke karışımı 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika için girişten çıkışa çözeltisi 0.2 din / cm2'de akış ve çalıştırmak için ayarlayın.
- Post-boyama yıkama
- Giriş oyuğunun her birinde geri kalan leke aspire ve her bir giriş için PBS içinde 100 ul ilave edin. Herhangi bir Boya fazlasını uzaklaştırmak için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca girişten çıkışa PBS çözeltisi 0.2 din / cm² akış ve çalıştırmak için ayarlar.
4. Resim Koleksiyonu, 3D Rendering ve Görüntü Analizi
- Mikroakışkan sistemden biyofilm görüntü verilerini toplamak için bir ters konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanın. CLSM 150 gr ulaşabilirsiniz Bioflux plaka, ağırlığını dayanabilecek olduğundan emin olun.
NOT: dime göz önüne alındığındamikroakışkan kanalları, biyofilm yapısını ayırt duyarlılık ihtiyacı ve gereksinimleri nsions, değişen yoğunluk floresan sinyali tespit 40X 1.25 NA objektif lens veya benzeri optik kalitesi, büyütme ve sayısal diyafram ile biri ile CLSM sığdırmak için. - Kazanç ile emisyon yakalama kapıları standardize ve ofset ölçümleri sabit tutulması. Bu fotoğraf beyazlatma neden olabilir lazer gücü% 25 geçmemesi emin olun.
- Ben F Ile tipi EOM'lu için (LIF) (Ey kalem M icroscopy E bütünlüklü) dosya türü mage L Eica gelen CLSM dosyalarını dönüştürün. Bu yazılım programları arasında erişim ve uyumluluk daha kolaylık sağlar. Bu tip dosyaları dönüştürmek için böyle Imaris, ticari olarak satılan yazılım kullanın.
Görüntüler / Şekiller 3D Rendering
- Bir kez OME biçimine dönüştürülür, bu tür görüntüleri işlemek için Imaris ticari olarak satılan yazılım kullanın3D. "Easy3D" ve "Aşmak" seçenekleri bir arada kullanarak bu gerçekleştirin.
NOT: Arka plan sinyali ve eşikleme dikkat yapılmalıdır. IMARIS histogram fonksiyonu toplama aralığı elde etmek için kullanılabilir ve resim analiz edilen arasındaki sabit tutulmalıdır. - "Anlık" fonksiyonunu kullanarak görüntüleri kaydetme ve dosya türlerini kaydetmeden önce görüntü çözünürlüğü dikkatli bir değerlendirme yapmak.
- Böyle CorelDraw veya Adobe Illustrator gibi bir görüntü düzenleme yazılımını kullanarak rakamlara içine görüntüleri birleştirin.
Grafikler ve Tablolar 3D Görüntü Analizi
- Görüntü analizi için ImageJ 23 ve COMSTAT / COMSTAT2 38 serbestçe kullanılabilir kullanın. Sırasıyla, http://rsb.info.nih.gov/ij/ ve http://comstat.dk/ paketleri indirin. En son Java güncellemesi yüklü var.
NOT: Yazılım platformu JAVA Prio yüklü olması gerekmektedirGörüntü analiz yazılımı kullanımı r.- "Bölünmüş kanalları" ile "hyperstack" modunda ve görünümünde her biyofilm görüntü için OME dosyaları almak için COMSTAT2 eklentisi ile ImageJ yazılımını kullanın.
- Bireysel iki kanal ImageJ "histogram" fonksiyonunu kullanarak (kırmızı / propidyum-iyodür / ölü olmak kanalı 0, yeşil / Syto-9 / CANLI olmak kanalı 1) analiz. Bu fonksiyon, herhangi bir sinyal (arka plan) ile 0 olan piksel ve 255 varlığıyla, ("değer" olarak gösterilen) 0-255 her renk yoğunluğunda ("sayısı" olarak gösterilen) 8-bitlik OME dosyalarının toplam piksel sayısını listeler tam sinyal doygunluğu ile piksel.
- Bir elektronik tablo programı içine veri ihracat ve ilgili sinyal yoğunluğu her pikseli ağırlıklandırılarak tüm sinyal değerleri standardize. Bu durum, sinyal yoğunluğu sayısal 8-bit değeri (0-255), belirli bir sinyal yoğunluğu toplam sayısı ile çarpılarak gerçekleştirilir.
- Yakalanan her biyofilm görüntü için her iki kanal için, tüm ağırlıklı değerler, 0-255 toplamı. Her iki kanaldan yüzde toplam sinyalini belirlemek için her iki kanal için ağırlıklı değerlerin toplamını alın. Kırmızı ve yeşil yüzde sinyali (yüzde "ÖLÜ" ve yüzde her tedavi için "CANLI" yani) göreceli oranı veya yüzde belirlemek için bunu yapın.
- Eşitsiz varyans için modifiye iki-kuyruklu Student T-testi kullanılarak, örneğin, istatistiksel analizler gerçekleştirin. P <0.05 değerleri anlamlı kabul edilir ve p <0.01, bu değerler son derece önemli olarak kabul edilir.
Kültür-bağımsız Analizi 5. Hasat Biyofilm Hücreler
- Giriş ve çıkış kuyulardan tüm geçirdi ve kullanılmayan tükürük çıkarın. 1 ml steril damıtılmış su ile üç kez kuyu yıkayın.
- Yazılım kontrol arayüzünü kullanarak, giriş çukurlara steril damıtılmış su, 100 ul ilave edin ve pass> 8.0 din / cm2'de kanallardan ileri steril damıtılmış su (800 sn arasında, kesme hızı> 745 ul / saat akış -1), en azından 5 dakika boyunca. En az 5 dakika ters yönde tekrarlayın ve sonra ileri tekrarlayın ve yıkama aşaması süreci tersine.
- Kapsamlı biyofilm kaldırılması (Şekil 2) için (hücreler boyandı eğer / etiketli) ışıkla veya Epifloresans mikroskobu ile kontrol edin. Kültür bağımsız analiz için -80 ° C'de, 100 ul hücre süspansiyonu ve mağaza toplayın. Yorumu bileşimin maliyetli bir analiz Nance et al yaklaşım kullanılarak bakteriyel etiket kodlanmış FLX amplikon, piro sıralamadır (bTEFAP) kullanarak yoluyla elde edilebilir. 20
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biyofilmler 3D Rendering
Temsilcisi sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. IMARIS yazılım yararlı bir araç toplanan biyofilm yığının her dilim incelemek ve onları üç boyutlu rekonstrüksiyon oluşturmak için birleştirmek için bir seçenektir. Buna ek olarak, yapay gölgeleme etkisi görsel olarak yardımcı üç-boyutlu yapılara yorumlamak için ilave edilebilir. işlenen biyofilm biyofilm ya da mikro-koloni yapısı keşfetmek için farklı büyütme ile herhangi bir yönde yönlendirilmiş olabilir. görüntüleri Şekil sundu. 3 oral çok tür biyofilm tedavi sonucunu gösterir. Özellikle dikkate% 70 etanol ile muamele önemli hücre ölümünü ya da hücre-hasarı göstermektedir (yeşilden kırmızıya) biyofilm çoğu için bir ciddi renk değişikliği neden olmasıdır. Büyük mikro-koloniler yatan (ve şimdi maruz) mikro-koloni hücreleri daha ölü hücreleri ihtiva ortaya çıktı. Such bir sonuç etanol zara antimikrobik aktif madde, çünkü biyofilm hücrelerinin yapışmanın de makul koşullarda kaynaklanmaktadır. OME formata dosyalarını dönüştürme ve ImageJ işlenen yığınlarını analiz ederek, kırmızı ve yeşil sinyal miktarı işlenmemiş biyofilm ve etanol ile tedavi olanlar arasında ters orantılı bir histogram fonksiyonları uygulayarak görülebilir.
Biyofilm Özelliklerinin Ölçülmesi
Tablo 1 ortalamaları ve anahtar yapısal parametrelerin standart sapmaları göstermektedir. IMARIS ImageJ ve COMSTAT kullanarak önemli bir avantajı, IMARIS ilk olarak kullanıldığı takdirde, OMe dosyaların, ImageJ ve COMSTAT boyunca ardışık izin vermek için oluşturulmuş olmasıdır. Tablo 1'de sunulan örnek verileri% 70 etanol ile sözlü biyofilm tedavisi 28.3% 80.8 den% kadar canlılığı son derece önemli bir düşüşe neden olduğunu göstermektedir. Etanol, bazı hücre hasarına ve yapısal c neden olabilirBiyofilmlererde Hanges ama bu ölçülebilir belirgin farklı genellikle kat değil. Burada, ortalama biyohacim ortalama kalınlık ve ortalama pürüzlülük önlemler bir fark (Tablo 1) tespit edilmiştir.
Şekil 1. Bioflux mikroakışkan sözlü biyofilm sistemi. (A) ters çevrilmiş bir SPE CLSM üzerine monte edilirken Bioflux sisteminin bir dikey çapraz kesitini gösteren bir şemadır. (B) iki mikroakışkan kanalları ve giriş ve çıkış kuyularının vurgulayarak bir açıklamalı (siyah çizgiler) fotoğraf. (C), bağlı Reaksiyon difüzyon sınırlama kısmen heterojen öldürme ile sonuçlanan% 0.01 TBM solüsyonu ile muamele edilmiş olan bir işlenmiş, iki boyutlu bir canlı / ölü lekeli diş biyofilm örneği. Yeşil renk lekeli canlı hücreleri gösterirSyto 9; kırmızı renkli hücreler Nance ve ark. izni ile 20 ölü ya da hasar görmüş ve propidyum iyodürle boyanan. Şekil 1A ve 1B. Şekil Bar. 1C 30 um temsil eder.
Render 20 saat biyofilm iki boyutlu ve üç boyutlu görüntüler elde konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) Şekil 2.. Kullanımı. Bu biyofilm toplanmış hücre içeren tükürük (CCS) bir inokulumu ile ilgili Toplanmış hücre içermeyen tükürük (CFS) geliştirilmiştir. Bir işlenmemiş biyofilm toplum (görüntülerin sol sütun)% 70 etanol tedavi biyofilm toplum karşılaştırılır ve bir temsilci biyofilm görünümü farklı düzlemlerde (XY, XZ ve Zyz) gösterilir. Kırmızı farklılıkları (ölü / hasarlı hücreler) ve yeşil (canlı hücreler) a gösteren HistogramlarHer resim yığını için gösterilen yeniden (gri gösterilen siyah ve dışı oturum verileri gösterilen veri giriş). Tüm veriler 8 bitlik görüntüleri ve böylece 0-255 (256 artışlarla) bir ölçekte elde edilir. Ölçek çubukları 30 um temsil eder.
20 saat Oral çok tür biyofilm çıkarma / hasat sonucunu gösteren Şekil 3. Akış şeması yüksek kesme / akış tekniği kullanılarak Bioflux mikroakışkan cihazdan (CFS akan bir CCS inokulum geliştirilen). Noktalı çizgiler, kanal duvarları konumunu belirlemede yardımcı görsele uygulanmıştır. hasat biyofilm toplum kompozisyonu req bağlı bakteriyel etiket kodlanmış FLX amplikonu Pyrosequencing (bTEFAP) olarak 454 piro sıralamadır teknolojileri ile analiz ve çoklu taksonomik düzeylerde (türler aracılığıyla filumunu) olarak ifade edilebilirgereksinimleri,. Yorumu bileşimin bir örneği, üç mikroakışkan kanal hasat biyofilm, filum düzeyinde olduğu gösterilmiştir. Barlar mikrometre ölçeği temsil eder.
| Parametre / Tedavi | Tedavi edilmeyen | % 70 EtOH |
| Ortalama Canlılık (%) | 80.8 (0.9) | 28.3 (5.8) ** |
| Ortalama biyohacim (mikron / um 2 3) | 17.7 (8.4) | 16.1 (3.0) |
| Ortalama Kalınlığı (mikron 2) | 23.3 (11.3) | 15.6 (6.4) |
| Ortalama Pürüzlülük | 0.4 (0.3) | 0.50 (0.2) |
Muamele edilmemiş ve% 70 etanol biyofilm özellikleri Tablo 1. miktarının belirlenmesi, bir inokulum hücre ihtiva eden tükürük (CCS) havuzlanmış hücresiz tükürük (CFS) gelişti 20 saat biyofilm işlemden geçirildi. Kalın değerler parantez içinde ortalamaları ve dışı kalın harflerle değerleri standart sapmaları are. Veriler, üç mikroakışkan kanallar en az beş-görüntülerden olduğunu. Tedavi edilmeyen kontrole önemli farklılıklar bir yıldız (** p <0.01%) tarafından vurgulanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, kağıt kurulumu için gerekli olan temel adımları vurgular ve toplanmış insan tükürük elde edilir ve filtre ile sterilize edilmiş% 25 toplanmış insan tükürük yetiştirilen ağızdan çok tür biyofilm geliştirilmesine olanak sağlayacak şekilde, bir mikro-akışkan sistemi çalıştırmak. Biyofilm karakterize Yaklaşımlar verilir ama bu tarif yaklaşımlar, örneğin, lekeler veya etiket sokulabilir, gibi değiştirilebilir ve ek teknolojiler olduğu unutulmamalıdır. Örneğin bir mesele olarak, bir makul etiketli antikorlar kullanabilir veya görselleştirmek ve sözlü çok tür biyofilm içindeki bazı türlerin mekansal konumunu incelemek için bir floresan gerginlik getirebilir. Ayrıca, kullanılan mikroakışkan sistemi modeline bağlı olarak, anaerobik koşullar altında biyofilm geliştirmek mümkündür (Bioflux sistemi durumunda, bir teknik not, bu konuda Fluxion.com mevcuttur).
Bioflux mikroakışkanlar için önemli bir yönüic sistemi birden teknolojileri ile uyumluluk ve bu kültür bağımsız çeşitliliği analizleri (Şekil 3) gerçekleştirmek için yeteneği ile burada vurgulanır. Mikroakışkan sisteminin iç yüzeyleri kolayca ileri dinç, erişilebilir değil ve önemli biyofilm biyokütle izin yok akışını tersine iken kaldırılacak. Biyofilm tüm kolayca kaldırılamaz ve bu sisteme bir zayıflık olarak kabul edilebilir olsa da, birçok model, biyofilm sistemleri de bu bilgi ile temperli edilmesi gerekir benzer bir sorunu ve bu tür toplanan verilerden iddiaları var unutmayın alakalı . Örneğin, streptokok bolluğu birçok Streptococcus türleri tükürük kaplı yüzeylerde 39 bağlamak için son derece iyi yetenekleri vardır, çünkü aslında deneysel olarak belirlenen daha biyofilm yüksek olabileceğini mümkündür.
Tüm model biyofilm sistemlerinde olduğu gibi, bir soru soruluyor dikkatli olmak zorundadır. Fya da örneğin, bu sistem, uzun süreli uzunlamasına çalışmalar için uygun olmaz. Böyle bir sabit derinlik film reaktöründe, bir Sorbarod sistemi ya da bir damlatma reaktör olarak bir model sistem 40-42 daha uygun olabilir. Bir model sistem için tükürük sınırlı miktarlarda sorun, bu gibi bir sorun haline rağmen mikroakışkan tabanlı tasarımlar değildir. Ama benzer bir ışığında, burada tarif edilen Bioflux sistemi, aynı zamanda, biyolojik sıvılar az miktarlarda bulunan diğer ortamlarda biyofilmlerin çalışmalar için adapte edilebilir. Örneğin, bu idrar ve yara eksudat olabilir.
Sonuç olarak, herhangi bir in vitro model sistem gibi, bir sözlü biyofilm büyümesi için güçlü ve mikroakışkan sisteminin zayıf vakıf olmak zorundadır. Mikroakışkan sistem tartışmasız çevre germane ve in vivo duruma içerik olarak benzer olan biyofilm gelişimi için izin verirken, bu th değile in vivo durum aynı ve muhtemelen bu yüzden asla. Bir laboratuvar model sistem kendi varsayımları olarak sadece iyi ve mikroakışkan sistemi, insan ağız boşluğu içinde koşullar, örneğin ana bilgisayar tabanlı efektler ve dış biyotik ve abiyotik zorluklar gibi faktörler birçok örtüşmelerin sahipken (örneğin içme ve yemek yeme yoluyla) kolayca olamaz çoğaltılır. Bu yüksek kapasiteli doğa yanı sıra, çevre ve mikrobiyolojik gerçek dünya ağız durumla örtüşür bu lojistik zorlu klinik çalışmalar yapmadan önce tahminler yapmak için bir çekici mikroakışkan sistem yapmak olduğunu, ancak, açıktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar biyofilm büyüme protokolleri ve John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) Bioflux sistemine ilişkin teknolojik konularla ilgili tavsiye formüle yardım William Nance (Michigan Üniversitesi) teşekkür ederim. Start-up fonları AHR için: (AHR için R21DE018820 NIH) ve Michigan Üniversitesi Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent | |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system | |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system | |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices | |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices | |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Ultra Low Temperature Freezer -80 °C | Multiple choices | Multiple choices | |
| Tips (20, 200, and 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Software | |||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | ||
References
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annual review of microbiology. 56, 187-209 (2002).
- Wimpenny, J. Microbial metropolis. Advances in microbial physiology. 56, 29-84 (2009).
- Jakubovics, N. S., Kolenbrander, P. E. The road to ruin: the formation of disease-associated oral biofilms. Oral diseases. 16 (8), 729-739 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
- Cate, J. M., Zaura, E. The numerous microbial species in oral biofilms: how could antibacterial therapy be effective. Advances in dental research. 24 (2), 108-111 (2012).
- Gilbert, P., Maira-Litran, T., McBain, A. J., Rickard, A. H., Whyte, F. W. The physiology and collective recalcitrance of microbial biofilm communities. Advances in microbial physiology. 46, 202-256 (2002).
- Anon, Centers for Disease Control and Prevention (CDC): Oral health: Preventing cavities, gum disease, tooth loss, and oral cancers. , http://www.cdc.gov/chronicdisease/resources/publications/AAG/doh.htm#aag (2011).
- Smith, H. Microbial behavior, 'in vivo' and 'in vitro. Smith, H., Taylor, J. , Cambridge University Press. 1-29 (1964).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Introduction to microbial aspects of periodontal biofilm communities, development and treatment. Periodontology. 42, 7-12 (2000).
- McBain, A. J. Chapter 4: In vitro biofilm models: an overview. Advances in applied microbiology. 69, 99-132 (2009).
- Baehni, P. C., Takeuchi, Y. Anti-plaque agents in the prevention of biofilm-associated oral diseases. Oral diseases. 9 Suppl 1, 23-29 (2003).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Frontiers of oral biology. 15, 117-132 (2012).
- Chun, J., Kim, K. Y., Lee, J. H., Choi, Y. The analysis of oral microbial communities of wild-type and toll-like receptor 2-deficient mice using a 454 GS FLX Titanium pyrosequencer. BMC microbiology. 10, 101 (2010).
- Diaz, P. I., et al. Molecular characterization of subject-specific oral microflora during initial colonization of enamel. Applied and environmental microbiology. 72 (4), 2837-2848 (2006).
- Auschill, T. M., et al. Effect of two antimicrobial agents on early in situ biofilm formation. Journal of clinical periodontology. 32 (2), 147-152 (2005).
- Coenye, T., Nelis, H. J. In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological. 83 (2), 89-105 (2010).
- Donlan, R. M. Role of biofilms in antimicrobial resistance. ASAIO journal. 46 (6), 47-52 (2000).
- Wimpenny, J. W. The validity of models. Advances in dental research. 11 (1), 150-159 (1997).
- Umland, T. C., et al. In vivo-validated essential genes identified in Acinetobacter baumannii by using human ascites overlap poorly with essential genes detected on laboratory media. 3 (4), (2012).
- Nance, W. C., et al. A high-throughput microfluidic dental plaque biofilm system to visualize and quantify the effect of antimicrobials. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 68 (11), 2550-2560 (2013).
- Werner, E., et al. Stratified growth in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Applied and environmental microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
- Rueden, C. T., Eliceiri, K. W. Visualization approaches for multidimensional biological image data. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 33-36 (2007).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Rao, D., Arvanitidou, E., Du-Thumm, L., Rickard, A. H. Efficacy of an alcohol-free CPC-containing mouthwash against oral multispecies biofilms. The Journal of clinical dentistry. 22 (6), 187-194 (2011).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual review of biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Kim, J., Park, H. D., Chung, S. Microfluidic approaches to bacterial biofilm formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
- Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science progress. 94 (4), 431-450 (2011).
- Foster, J. S., Kolenbrander, P. E. Development of a multispecies oral bacterial community in a saliva-conditioned flow cell. Applied and environmental microbiology. 70 (7), 4340-4348 (2004).
- Cuadra-Saenz, G., et al. Autoinducer-2 influences interactions amongst pioneer colonizing streptococci in oral biofilms. Microbiology. 158 (7), 1783-1795 (2012).
- Rickard, A. H., et al. Autoinducer 2: a concentration-dependent signal for mutualistic bacterial biofilm growth). Molecular microbiology. 60 (6), 1446-1456 (2006).
- Corbin, A., Pitts, B., Parker, A., Stewart, P. S. Antimicrobial penetration and efficacy in an in vitro oral biofilm model. Antimicrobial agents and chemotherapy. 55 (7), 3338-3344 (2011).
- Diggle, M. A., Clarke, S. C. Pyrosequencing: sequence typing at the speed of light. Molecular biotechnology. 28 (2), 129-137 (2004).
- Hiyari, S., Bennett, K. M. Dental diagnostics: molecular analysis of oral biofilms. Journal of dental hygiene : JDH / American Dental Hygienists' Association. 85 (4), 256-263 (2011).
- Filoche, S., Wong, L., Sissons, C. H. Oral biofilms: emerging concepts in microbial ecology. Journal of dental research. 89 (1), 8-18 (2010).
- Xu, J. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics: concepts, tools, and recent advances. Molecular ecology. 15 (7), 1713-1731 (2006).
- Rogers, G. B., Carroll, M. P., Bruce, K. D. Studying bacterial infections through culture-independent approaches. Journal of medical microbiology. 58 (11), 1401-1418 (2009).
- Socransky, S. S., et al. The microbiota of the gingival crevice area of man. I. Total microscopic and viable counts and counts of specific organisms. Archives of oral biology. 8, 275-280 (1963).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus adherence and colonization. Microbiology and molecular biology reviews). MMBR. 73 (3), 407-450 (2009).
- Hope, C. K., Clements, D., Wilson, M. Determining the spatial distribution of viable and nonviable bacteria in hydrated microcosm dental plaques by viability profiling. Journal of applied microbiology. 93 (3), 448-455 (2002).
- Adams, H., et al. Development of a laboratory model to assess the removal of biofilm from interproximal spaces by powered tooth brushing. American journal of dentistry Spec No 12B-17B. 15, 12-17 (2002).
- Ledder, R. G., McBain, A. J. An in vitro comparison of dentifrice formulations in three distinct oral microbiotas. Archives of oral biology. 57 (2), 139-147 (2012).
