Protocol
참고 :이 연구는 적절한 윤리위원회에 의해 승인되었다.
인간의 폐 섬유 아 세포의 1 차 문화
- 폐 조직의 컬렉션 :
- 직접 수술 수술실에서 인간의 폐 조직 샘플을 얻습니다. 최대한 멀리 종양에서 수집 비 암성 샘플, 암성 및 비 암성 폐 조직으로부터 약 1cm 3 블록 모아서.
- 둘 베코 변형 이글 배지 100 단위 / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신 및 0.25 ㎍ / ml의 암포 테리 신 B (무 혈청 배지)로 보충 (DMEM)에서 샘플을 중단. 멸균 50 ㎖ 튜브에 일시 중단 된 샘플을 유지하고 실험실로 전송합니다.
주 : 섬유 아세포는 높은 이동성이며 예컨대 상피, 내피 및 평활근 세포 등의 다른 종류의 세포에 비하여 증식. 가지 방법은 섬유 아세포의 이러한 기능을 이용하고, outgro 소요조직 섹션에서 날개 세포는 섬유 아 세포에 풍부하다. 여러 셀 통로 후, 다른 종류의 세포가 정제 된 섬유 아세포 세포 배양 결과, 생존 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 DMEM으로 전파하지 못한다. 초대 배양 세포는 다음 3-7 통로를 사용할 수있다.
- 세포 생장에 대한 절편 문화와 조화 :
- 수정 5 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 섬유 아세포의 차 문화를 수행합니다.
- 실험실에있어서, 배양 배지가없는 10cm 조직 배양 접시에 조직 샘플을 배치하고 작은 섹션으로 잘라 ~ 멸균 겸자 메스를 사용하여 크기가 2 ~ 3 mm이다. 이 과정에서 다른 세포 생장의 효율이 손상 섹션 건조하게하지 마십시오.
- 상피 세포층과 결합 조직의 분리 :
- 4 ° C에서 16 시간 동안 배양 2,000 PU / ㎖ 디스 파제 I를 포함하는 매체와 문화에 절단 된 조직 절편을 만끽 해보세요. </ 리>
- 접시에 조직 절편을 전송하고, 인접한 결합 조직에서 상피 세포층을 분리합니다. 미생물의 오염을 방지하기 위해 클린 벤치의 섹션을 처리.
주 : 상피 세포의 초대 배양이 필요한 경우, 단계 130을 수행한다. 단 섬유 아세포가 고립 될 경우 후속 절편 배양 및 세포 통로 정제 된 섬유 아세포 인구를 산출 상피 세포에 대한 불리한 때문에, 1.3 단계를 생략합니다.
- 조직 절편의 첨부 :
- 두 메스를 사용하여 1mm 조각으로 조직을 말하다. 충분히 작은 조각이 아닌 경우에는 접시으로부터보다 쉽게 분리하고, 세포는 접시 표면에 빨리 성장하지 못할 것이다.
- 각 부분을 둘러싸는 빈 영역을 유지하기 위해 서로 떨어져 작은 폐 조직 섹션을 배치. 조직 절편의 부착을 용이하게하기 위해 메스 블레이드를 사용하여 조직 배양 접시의 표면에 흠집을 확인.
참고 : 긁는또한 세포 마이그레이션 할 수있는 함께 트랙을 제공, 세포 생장을 촉진하기 위해 나타납니다.- 대안 적으로, 개별적 6- 웰 플레이트의 각 웰에 다진 조직편을 배치하고, 커버 슬립으로 그들을 커버. 실리콘 그리스를 사용하여 플레이트의 표면에 커버 슬립을 부착.
- 각 웰 멸균 핀을 사용하여 1.5 cm 떨어진 두 지점에서 실리콘 그리스를 놓습니다. 조직편 커버리지 여러 통로 다음 세포 생장 및 세포 증식의 효과를 향상시킨다.
- 이후 이식편 문화 :
- 샘플이 건조하면 효율적으로 세포 부산물은 대부분 손실로 조직 섹션은, 건조하기 전에 조심스럽게 접시에 배지를 추가합니다. 너무 빨리 조직 섹션은 분리하는 것처럼 매체를 붓지 마십시오.
- 10 % FBS와 DMEM에서 배양 세포. 추가 부력에서 분리를 촉진대로, 부동 수 있다는 너무 많은 단지 조직을 충당하기에 충분한 매체를 사용하지만요리.
- 셀 통로 :
- 배양 접시의 반복 운동이 조직 절편의 이탈로 이어질 수 있으므로 항상주의 문화 매체를 처리합니다.
- 5-7일 37 ° C에서 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다. 매일 매체를 새로 고침하고 매체 변경하는 동안 최소한의 배양 접시를 처리합니다. 섬유 아세포는 다음 몇 주 동안 조직 절편의 가장자리에서 자라다.
주 : ~ 2-3주 후 벗어나지 아세포 거의 표면적의 양에 따라, 합류에 도달한다. - 1X PBS로 세포를 씻으십시오, 그리고 나는 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다.
- 트립신 처리 한 후, 10 % FBS가 보충 된 DMEM 9 ml의 세포를 사용하여 분리. 조직 절편과 함께 10 ㎖ 튜브 내의 매질에 현탁하고 세포를 모은다. 세포 펠렛을 형성하는 원심 분리 후, 새로운 배지에서 얻어진 펠릿을 재현 탁.
- 새로운 막힌에 세포와 조직 섹션을 시드진짜야 요리, 어느 시점에서 조직 세포가 부착하고 성장하는 동안 요리에 연결하는 데 실패. 다음 날, 흡인에 의해 떠있는 조직 조각을 제거하고, 매체를 변경합니다. 첨부 섬유 아세포 이후 문화와 함께 전파.
인간 폐 섬유 아세포 암세포 2. 입체 공동 문화
- 세포 및 시약의 제조 :
- 약 2 × 10 5 상피 세포와 잘 당 2.5 × 10 5 섬유 아세포를 사용합니다. (3 ㎎ / ㎖, pH를 3), FBS (100 %), 재구성 완충액 (50 mM의 NaOH 등, 260 mM의 NaHCO3을 200 mM의 HEPES)가, 5X DMEM는, DMEM은 섬유 아세포 배양 용 10 % FBS가 보충 된 콜라겐 형 IA 준비 3D 및 공동 배양 배지 (1 : 암세포 섬유 아세포 배양 배지 및 배지 1 혼합물).
- 문화 A549 폐 선암 세포, 섬유 아세포 및 DMEM에서 A549 차원 공동 배양은 10 % FBS로 보충.
- 콜라겐 겔 Formation :
- 1X PBS와 10cm 접시에서 배양 섬유 아세포를 씻고 난 판에 트립신 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 ~ 5 분 동안 트립신 처리 후, 10 % FBS가 보충 된 9 ㎖의 DMEM을 사용하여 세포를 분리. 10 ㎖ 튜브에 세포를 배지를 수집하고, 세포 펠렛을 형성하도록 200-300 XG에이를 원심 분리기.
- 5 × 105 / ml의 밀도로 100 % FBS에서 얻어진 펠렛을 재현 탁.
- 얼음에 콜라겐 젤을 준비합니다. 다음 절차에 앞서 냉장고 시약 피펫 및 튜브 쿨. 심지어 얼음에, 혼합물을 어느 정도 고화하고, 총 부피는 모든 성분의 합보다 작다.
- 각 웰에서, FBS에서 섬유 아세포 서스펜션 (2.5 × 10 5 세포)의 0.5 ml의 2.3 ml의 유형 IA 콜라겐, 670 ㎕의 5 배 DMEM, 330 ㎕를 재구성 버퍼를 혼합하여 콜라겐 젤을 준비합니다. 젤은 실온에서 쉽게 설정할 수 있습니다.
- 적극적으로 균질 마일을 보장하기 위해 피펫xture. 피펫 팅 과정에서 거품을 만들지 마십시오.
- 6- 웰 플레이트의 각 웰에 혼합물 (3 ㎖)를 첨가하고, 30-60 분 동안 방해없이 37 ℃ 배양기에서 허용 아교질로 만들다.
- 콜라겐 겔 암 세포 배양 :
- 6 수정을 이전에보고 된 프로토콜을 사용하여 입체 공동 문화를 수행합니다.
- 1 × 105 / ㎖의 밀도로 3D 공동 - 배양 배지 (또는 A549 세포의 경우에는 10 % FBS를 가진 DMEM)에 재현 탁 암세포.
- 각 겔의 표면에 재현 탁 된 세포 용액 (2 × 105 세포) 2 ㎖를 붓는다. 실험 조건에 따라 공동 배양 암 세포 또는 섬유 아세포의 세포 수를 수정한다.
- 젤의 수축 :
- 암 세포는 콜라겐 겔에 부착 할 수 있도록 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 젤. 각 젤을 분리하고 O를 잘 각각 '부동 문화'를 생성6 잘 판 바.
주 : 부유 배양을 사용하여 겔 크기에 다양한 변경이 공 배양 암세포와 섬유 아세포 세포 간의 상호 작용에 의해 매개되는 기계적 장력 및 콜라겐 분해에 의해 발생된다. - 우물의 가장자리에서 각 젤을 분리 각도 21 G 바늘이나 작은 주걱을 사용합니다. 2-3 일마다이 3D 공동 배양 배지 2 ㎖로 웰을 새로. 5 일간 매일 각 겔의 크기를 측정한다.
- 암 세포는 콜라겐 겔에 부착 할 수 있도록 37 ℃에서 밤새 인큐베이션 젤. 각 젤을 분리하고 O를 잘 각각 '부동 문화'를 생성6 잘 판 바.
- 콜라겐 젤의 분석 :
- 이러한 분석 Sircol 콜라겐 정량 방법을 사용하여 각각의 콜라겐 겔 함량을 측정. 젤 5에서 RNA를 수집 한 후 transcriptomic 분석 또는 정량 RT-PCR을 수행합니다.
3. 공기 - 액체 인터페이스 문화 침략 분석
- 오일, 37 ° C에서 콜라겐 젤을 배양 한 후, 새로운 6-에 메쉬 (70 ㎛의 공극 크기)을 배치하여 공기 수축 겔을 노출잘 접시. 유동 세포 계측법에 사용되는 시판 셀 스트레이너의 메쉬를 확인합니다.
- 부드럽게 3D 공동 배양 배지 11 ml로 각각의 웰을 채운다.
- 멸균 스푼을 사용하여 메쉬에 젤을 놓고 젤에 남아있는 모든 매체를 제거합니다. 공기가 겔의 상부 표면을 노출 동안이 상태에서, 중간 젤에서 잠수함. 공기 - 액체 인터페이스 등이 문화 조건을 정의합니다.
주 : 인큐베이터에서 37 ℃에서 공기 - 액체 계면을 유지 배양 5-7 일 후, 경부암 세포 겔로 이동한다. 세포 유형 및 셀룰러 상호 작용의 결과로서 따라, 암세포에서 세포의 형태 학적 변화의 가변 정도는 공기 - 액체 계면 배양에 의해 유도된다. - 조직 학적 평가를 위해 실온에서 밤새 포르말린 용액에서 겔을 고정하고 파라핀에 포함. 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E)와 수직 섹션 (4 μm의) 얼룩. 면역 조직 화학 분석 O를 수행n은 섹션 4.
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Representative Results
이 공동 배양법, 종양 미세 환경을 흉내 낸 콜라겐 젤에 포함 된 암 세포와 섬유 아세포와의 상호 작용을 연구하기위한 유용한 도구이다. 콜라겐 겔 수축, 암세포의 침윤 및 형태 변화 : 이전의 연구에서, 세 개의 파라미터가이 실험 모델에서 평가 하였다. 암 세포의 증식은 또한 면역 염색 Ki67 4를 이용하여 추정 하였다. 폐 조직 샘플을 절제 폐 로브 (도 1A)의 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. 샘플을 잘게 다진시키고 DMEM에서 배양은 10 % FBS (도 1b)로 보충. 조직 절편의 섬유 아세포 성장 현미경 (도 1C)으로 관찰 하였다. 일차 배양 된 폐 섬유 아세포의 콜라겐 겔에 포함되었다 (도 2a, a) 및 A549 폐암 세포 겔상에서 공 배양 하였다 (도 2A, B). 부동 C 후배지 ulture (도 2A는, c), 겔, 공기 - 액체 계면의 조건 하에서 더 배양 하였다 (도 2A, d). 겔을 포르말린에 고정하고 면역 조직 화학 분석 (도 2A, E)를 사용 하였다. 공기 - 액체 계면 문화, 겔 6- 웰 플레이트의 웰 (도 2B)에 격자 위에 놓는다. 겔의 조직 학적 분석은 폐암 관련 섬유 아세포 (그림 3)에 포함 된 콜라겐 겔에 A549 세포의 침략을 밝혔다.
그림 1 : 외과 적 절제 인간의 폐 조직에서 섬유 아세포의 파생물. (A) 샘플 절제된 폐 로브 암 및 암이 아닌 부분에서 수집 하였다. (B) 시료를 작은 조각으로 잘게 썰어서 10 % FBS가 보충 된 DMEM에서 배양 하였다.(C) 섬유 아 세포는 조직 섹션 (화살표)에서 성장했다. 세포가 배양 접시에 메스 블레이드에 의해 만들어진 긁힌 자국을 따라 마이그레이션합니다. 스케일 바, 200 μm의.
도 2 :. 콜라겐 겔 기액 인터페이스 배양 A549 세포는 섬유 아세포 매립 콜라겐 겔상에서 공동 배양하고, A549 세포의 층이 중간에 격자 상 겔을 배치하여 공기에 노출된다 (A. ) 공 배양 및 공기 - 액체 계면 입체의 실험 절차. (a) 콜라겐 겔 폐 섬유 아세포 매립. (b) 콜라겐 겔상에서 공 배양 A549 세포. (c) 부동 배양. (d) 공기 - 액체 계면 (ALI). 포르말린 겔 (E) 고정술. (B) 번째의 대표 화면6- 웰 플레이트의 웰에 배치 메쉬 E 겔. O / N : 하룻밤.
도 3은 Hematoxylin A549 세포 및 인간 폐 섬유 아세포 이루어지는 삼차원 배양 겔의 횡단면 에오신 염색. 콜라겐 겔 해당 A549 세포 배양 주 섬유 아세포 (화살표)으로 매립 겔 침입. 스케일 바, 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
CAFS 암세포 주변 ECM의 주요 구성 요소를 형성하고, 종양 만 골격을 제공 할뿐만 아니라 적극적으로 종양 발생에 관여하지 7. 축적 된 증거 CAF 매개 종양 진행 (8)의 중요한 역할을 강조 최종 예후에 CAFS 또는 관련 분자의 영향을 풀어 낸다.
이전 연구에서는 폐 CAFS (4)를 분리하는 가지 방법을 사용. 이 실험에서는, 접시 표면에 조직 절편 밀착성의 유지가 매우 중요하다. 세포 배양 배지에 떠있는 조직 절편으로부터 이주 할 수없는 한 조직 절편 표면으로부터 분리되고 나면, 더 이상 같은 배양 접시에 세포의 생장에 사용될 수 없다. 조직의 절단은 접시 표면에 부착하기위한 접착제 역할을 삼출물을 얻을 수 있습니다. 커버 슬립으로 조직 절편을 고정 할 때 사용되는 그리스의 양도이다 critiCAL. 그리스 소량의 그리스가 과도한 세포 배양 영역을 가리는 반면, 부착 된 커버 슬립을 유지하지 못한다. 커버 슬립 및 적절한 압력을 사용하여 조직 섹션의 첨부 파일은 또한 세포 생장을 촉진하는 열쇠입니다.
암세포 증식 및 내습 실험 모델은 주로 이차원 단층 또는 조직 배양 된 Boyden 챔버 분석에 의존 해왔다. 더 간 통신 및 암세포의 동작 ECM 의존 변조를 이해하기 위해서는, 입체 공동 배양 강력한 도구이다. 그들은 높은 기술 능력이 필요하고 실험 조건이 제한되어 있지만의 Organotypic 문화도 다세포 상호 작용을 조사하는 데 유용합니다.
더불어 문화 모델은 종양 미세 환경을 흉내 낸 조건 하에서 종양 간질 상호 작용을 평가하는 플랫폼 역할. 특정 유전자의 과발현 또는 최저와 세포는 우리의 cultu에 쉽게 적용 할 수있다의 Organotypic 문화를 통해 장점 인 시스템, 다시. 특히, 우리의 이전 관측은 공동 배양 된 섬유 아세포가 적극적으로 암 세포 분화 및 침략 사를 조절하는 것이 좋습니다. 이는 내피 세포, 염증성 세포 및 비 - 암성 상피 세포로서의 실험 환경에서 상호 작용을 가능 다세포 테스트가 관심을 가질 것이다.
CAFS의 고유 특성은 일차 배양 CAF 및 정상 대조 구를 사용하는 공동 배양 연구 나 유전자 발현 프로파일 링에 의해 입증되었다. 한편, 이러한 연구는 또한 11 또는 전사 인자의 활성화 신호 (12) 성장 인자의 상이한 레벨에 기인 할 수있는 CAFS 부 (10)의 인트라 즉 종양 또는 개인간 얼룩이 보였다. 따라서, 상기 암 환자 (13)로부터 유래 된 이종 CAFS를 특성화하는 것이 필수적이다. 반복 세포 통로를 따라,차 배양 CAFS의 특성은 변경 될 수있다. 따라서 초기 구절에서 CAFS의 특성을 더 잘 될 것입니다.
CAFS 차례로, 긴장 트리거 세포 신호를 통해 CAFS를 활성화시킬 수있다 ECM 증착 및 리모델링에 기여한다. CAF 활성화의 이러한 mechanotransduction의 매개 피드 - 포워드 루프 (14)을 제안하고 있으며, 우리의 콜라겐 젤의 수축 모델은 이러한 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 수있다. 콜라겐 젤의 수축의 메커니즘은 세포의 수축, 증식, 이동, 분화, 콜라겐 리모델링 (15)를 포함한다. 리간드를 사용하여 세부 조직 학적 연구와 실험은, 억제제, 또는 RNAi의 종양 - 기질 상호 작용에 기계적인 통찰력을 얻을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
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