Protocol
NOTA: Questo studio è stato approvato dai comitati etici appropriati.
1. Cultura primario umano Polmone fibroblasti
- Raccolta di tessuto polmonare:
- Ottenere campioni di tessuto polmonare umano dalla sala operatoria chirurgica direttamente. Raccogliere circa 1 cm 3 isolati da tessuto polmonare cancerose e non cancerose, con il campione non cancerose raccolto più lontano dal tumore possibile.
- Sospendere i campioni in terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supplementato con 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 0,25 ug / ml di amfotericina B (terreno privo di siero). Mantenere i campioni sospesi in sterili provette da 50 ml e trasferire al laboratorio.
NOTA: I fibroblasti sono altamente migratori e proliferative rispetto ad altri tipi di cellule, come le epiteliali, endoteliali e cellule muscolari lisce. Il metodo conseguenza sfrutta queste caratteristiche di fibroblasti, e outgrocellule ala da sezioni di tessuto sono abbondanti in fibroblasti. Dopo diversi passaggi in coltura, altri tipi di cellule non riescono a sopravvivere e propagarsi in DMEM con siero fetale bovino 10% (FBS), risultando in colture cellulari di fibroblasti purificate. Le cellule potrebbero essere usate 3-7 passaggi seguenti colture primarie.
- Espianto e condizionamento per escrescenza cellulare:
- Eseguire colture primarie di fibroblasti con un protocollo precedentemente riportato con modifiche 5.
- In laboratorio, posizionare il campione di tessuto su un piatto di 10 centimetri di coltura tissutale senza terreno di coltura e tagliato in piccole sezioni ~ 2-3 mm di dimensioni con pinza sterile e un bisturi. Durante questo processo, evitare di fare parte asciutta, altrimenti l'efficienza della cella escrescenza è compromessa.
- Separazione dello strato di cellule epiteliali e tessuto connettivo:
- Immergere le sezioni di tessuto tagliato in mezzo di coltura contenente 2.000 PU / ml dispasi I e cultura per 16 ore a 4 ° C. </ Li>
- Trasferire le sezioni di tessuto ad un piatto, e separare lo strato di cellule epiteliali dal tessuto connettivo adiacente. Elaborare le sezioni di un banco pulito per evitare la contaminazione di microrganismi.
NOTA: Se è necessaria colture primarie di cellule epiteliali, eseguire il passaggio 1.3. Se solo fibroblasti devono essere isolati, omettere il passo 1.3, perché le successive Espianto e cellulari passaggi sono sfavorevoli per le cellule epiteliali, che danno le popolazioni di fibroblasti purificate.
- Montaggio di sezioni di tessuto:
- Tritare i tessuti a pezzi 1 millimetro con due bisturi. Se i pezzi non sono sufficientemente piccoli, spiccano più facilmente dal piatto, e le cellule non riuscirà a superare sulla superficie del piatto.
- Inserire piccole sezioni di tessuto polmonare uno dall'altro per mantenere un'area vuota circostante ogni pezzo. Effettuare graffi sulla superficie del piatto di coltura tissutale con una lama di bisturi per facilitare il fissaggio di sezioni di tessuto.
NOTA: Graffioappare anche per facilitare escrescenza cellulare, fornendo piste lungo le quali le cellule possono migrare.- In alternativa, inserire pezzi di tessuto tritate individualmente in ogni pozzetto di un 6-pozzetti, e coprire con un vetrino. Fissare il vetrino alla superficie della piastra con grasso al silicone.
- Mettere grasso al silicone in due punti 1,5 centimetri a parte in ogni pozzetto usando un pin sterile. La copertura di pezzi di tessuto migliora l'efficacia di escrescenza cellulare e la propagazione delle cellule dopo diversi passaggi.
- Successivamente Espianto:
- Aggiungere delicatamente mezzo di coltura al piatto prima che le sezioni di tessuto asciugano, come conseguenza cella efficiente è perso in gran parte, se i campioni asciugare. Non versare il medium troppo rapidamente come le sezioni di tessuto sarebbe staccare.
- Cellule culturali in DMEM con 10% FBS. Utilizzare abbastanza medio coprire appena il tessuto, ma non troppo che permette galleggiante, come galleggiabilità supplementare promuove distacco dalpiatto.
- Brano Cell:
- Maneggiare il terreno di coltura con cura in ogni momento, come ripetuti movimenti del piatto cultura può portare al distacco delle sezioni di tessuto.
- Porre le capsule di coltura in un incubatore a 37 ° C per 5-7 giorni. Aggiornare il mezzo di ogni altro giorno, e gestire i piatti della cultura minimamente durante le medie modifiche. I fibroblasti troppo grande dal bordo delle sezioni di tessuto nelle prossime settimane.
NOTA: Dopo ~ 2-3 settimane, fibroblasti diventano troppo grandi raggiungono quasi confluenza, a seconda della quantità di superficie. - Lavare le cellule con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra.
- Dopo tripsinizzazione, staccare le cellule utilizzando 9 ml di DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, insieme alle sezioni di tessuto. Dopo la centrifugazione per formare pellet cellulari, risospendere il pellet con conseguente nuovo mezzo.
- Seed le celle e sezioni di tessuto su un nuovo culpiatto ture, al punto che i tessuti non riescono a collegare al piatto, mentre le cellule aderiscono e crescono. Il giorno seguente, rimuovere i pezzi di tessuto galleggianti per aspirazione, e cambiare il mezzo. Fibroblasti Attached propagano con culture successive.
2. tridimensionale Co-cultura umano Polmone fibroblasti e cellule tumorali
- Preparazione delle cellule e reagenti:
- Circa utilizzare 2 x 10 5 cellule epiteliali e 2,5 x 10 5 fibroblasti per pozzetto. Preparare collagene di tipo IA (3 mg / ml, pH 3), FBS (100%), tampone di ricostituzione (NaOH 50 mm, 260 NaHCO mM 3, HEPES 200 mm), 5x DMEM, DMEM integrato con il 10% FBS per la cultura di fibroblasti, e un mezzo di co-coltura 3D (una miscela 1: 1 di coltura di fibroblasti medie e terreno di coltura per le cellule tumorali).
- Cultura A549 cellule di adenocarcinoma del polmone, i fibroblasti e la co-coltura A549 3D in DMEM supplementato con 10% FBS.
- Collagene gel formazione:
- Lavare fibroblasti coltivati su 10 centimetri piatto con 1x PBS, e aggiungere 1 ml di tripsina I alla piastra. Dopo tripsinizzazione per ~ 5 min a 37 ° C, staccare le cellule utilizzando 9 ml DMEM supplementato con 10% FBS. Raccogliere cellule sospese nel mezzo in una provetta da 10 ml, e centrifugare a 200-300 xg per formare pellet cellulari.
- Risospendere il pellet risultanti a 100% FBS ad una densità di 5 x 10 5 / ml.
- Preparare il gel di collagene su ghiaccio. Raffreddare i reagenti, pipette e tubi in frigorifero prima della seguente procedura. Anche su ghiaccio, la miscela solidifica in una certa misura, ed il volume totale è inferiore alla somma di tutti i componenti.
- In ogni pozzetto, preparare il gel di collagene miscelando 0,5 ml di sospensione fibroblasti (2,5 x 10 5 cellule) in FBS, 2.3 ml di collagene tipo IA, 670 microlitri DMEM 5x, e 330 microlitri tampone di ricostituzione. Lasciare i gel di impostare facilmente a temperatura ambiente.
- Vigorosamente pipetta per garantire a mi omogeneaxture. Evitare di creare bolle durante il processo di pipettaggio.
- Aggiungere la miscela (3 ml) a ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e lasciare gelatinizzare in incubatore a 37 ° C senza disturbo per 30-60 min.
- Coltura cellulare Cancer sul gel di collagene:
- Eseguire co-coltura tridimensionale utilizzando un protocollo precedentemente riportato con modifiche 6.
- Risospendere le cellule tumorali nel medio 3D co-coltura (o in DMEM con 10% FBS in caso di cellule A549) ad una densità di 1 x 10 5 / ml.
- Versare 2 ml della soluzione di cellule risospeso (2 x 10 5 cellule) sulla superficie di ciascun gel. Modifica numero di cellule delle cellule tumorali o fibroblasti in co-coltura a seconda delle condizioni sperimentali.
- Gel contrazione:
- Incubare gel notte a 37 ° C in modo che le cellule tumorali possono aderire al gel di collagene. Staccare ogni gel, e generare una 'cultura fluttuante' in ogni pozzetto of la piastra da 6 pozzetti.
NOTA: utilizzando una cultura galleggiante, vari cambiamenti nella dimensione gel sono indotti dalla tensione meccanica e la degradazione del collagene, che sono mediati da interazioni cellulari tra cellule e fibroblasti tumorali co-coltura. - Utilizzare un angolato 21 ago G o spatola per separare ciascun gel dal bordo del pozzo. Ogni 2-3 giorni, aggiornare i pozzetti con 2 ml di 3D medio co-coltura. Misurare la dimensione di ciascun gel ogni giorno per 5 giorni.
- Incubare gel notte a 37 ° C in modo che le cellule tumorali possono aderire al gel di collagene. Staccare ogni gel, e generare una 'cultura fluttuante' in ogni pozzetto of la piastra da 6 pozzetti.
- Analisi di gel di collagene:
- Misurare il contenuto di collagene di ogni gel con metodi di quantificazione di collagene, come ad esempio il test Sircol. Eseguire l'analisi trascrittomica o RT-PCR dopo aver raccolto RNA da gel 5.
3. Aria liquida Cultura Interfaccia e Invasion Assay
- Dopo coltura i gel di collagene a 37 ° C per 5 giorni, esporre i gel contratte all'aria ponendoli su una maglia (70 micron dimensione dei pori) in una nuova 6-pozzetti. Effettuare la maglia da filtri cellulari disponibili in commercio utilizzati per citometria a flusso.
- Riempire delicatamente ogni pozzetto con 11 ml di 3D medio co-coltura.
- Posizionare il gel sulla rete utilizzando un cucchiaio sterile e rimuovere qualsiasi supporto rimanente dal gel. In questa condizione, immergere gel nel mezzo, mentre esporre la superficie superiore del gel all'aria. Definire questa condizione cultura come interfaccia aria-liquido.
NOTA: Dopo 5-7 giorni di mantenimento della coltura interfaccia aria-liquido a 37 ° C in incubatore, le cellule tumorali invasive migrano nel gel. A seconda del tipo di cellula e come risultato di interazioni cellulari, gradi variabili di cellule variazione morfologica nelle cellule tumorali sono indotte dalla cultura all'interfaccia aria-liquido. - Per la valutazione istologica, fissare il gel in soluzione di formalina notte a temperatura ambiente e incorporare in paraffina. Macchia sezioni verticali (4 micron) con ematossilina eosina (H & E). Eseguire l'analisi immunoistochimica on sezioni 4.
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Representative Results
Questo metodo di co-coltura, imitando il microambiente tumorale, è uno strumento utile per studiare le interazioni tra cellule tumorali e fibroblasti incorporati in gel di collagene. Nello studio precedente, tre parametri sono stati valutati in questo modello sperimentale: collagene contrazione gel, l'invasione delle cellule tumorali e cambiamento morfologico. La proliferazione delle cellule del cancro è stato stimato utilizzando anche Ki67 immunostaining 4. Campioni di tessuto polmonare sono stati raccolti da sezioni cancerose e non cancerose di un lobo polmonare resecato (Figura 1A). I campioni sono stati sminuzzati in piccoli pezzi e coltivate in DMEM supplementato con 10% FBS (Figura 1B). Fibroblasti sempre fuori dalla sezione di tessuto sono stati osservati al microscopio (Figura 1C). Fibroblasti primari in coltura sono stati incorporati in un gel di collagene (figura 2A, a) e le cellule tumorali A549 polmonari sono stati co-coltivati su gel (Figura 2A, b). Dopo c galleggianteulture nel mezzo (Figura 2A, c), il gel è stato ulteriormente coltivato sotto la condizione di interfaccia aria-liquido (Figura 2A, d). Il gel è stato fissato in formalina ed utilizzato per le analisi immunoistochimica (Figura 2A, e). Per la cultura interfaccia aria-liquido, il gel è stato collocato su una maglia in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti (Figura 2B). Analisi istologiche del gel rivelato invasione delle cellule A549 nel gel di collagene embedded con fibroblasti del polmone cancro-associata (Figura 3).
Figura 1: conseguenza di fibroblasti di tessuto polmonare umano chirurgicamente asportato. (A) I campioni sono stati raccolti da sezioni cancerose e non cancerose di un lobo polmonare resecato. (B) I campioni sono stati sminuzzati in piccoli pezzi e coltivate in DMEM supplementato con 10% FBS.(C) I fibroblasti cresciuto fuori dalla sezione di tessuto (freccia). Si noti che le cellule migrate lungo i graffi compiuti dalle lame di bisturi sul piatto di coltura. Bar Scala, 200 micron.
Figura 2:. Cultura interfaccia aria-liquido del gel di collagene cellule A549 sono state co-coltivate su un gel di collagene embedded con i fibroblasti, e lo strato di cellule A549 è stato esposto all'aria ponendo il gel su una maglia in mezzo (A. ) procedure sperimentali di tridimensionale co-coltura e l'interfaccia aria-liquido. (a) il gel collagene integrato con fibroblasti polmonari. (b) le cellule A549 co-coltura sul gel di collagene. (c) cultura galleggiante. (d) Air- interfaccia liquido (ALI). (E) Fissazione del gel in formalina. (B) immagine Rappresentante di the gel posto sulla maglia in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti. O / N: durante la notte.
Figura 3. ematossilina ed eosina di sezioni trasversali di un gel tridimensionale coltura composto da cellule A549 e fibroblasti polmonari umani. Si noti che le cellule A549 coltivate sul gel di collagene invaso il gel embedded con fibroblasti (frecce). Bar Scala, 200 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
CAF formano una componente importante della ECM circostante le cellule tumorali e non solo forniscono una impalcatura per il tumore, ma anche partecipare attivamente nello sviluppo del tumore 7. Accumulando prove dipana l'impatto dei CAF o loro molecole correlate alla eventuale previsione, mettendo in evidenza il ruolo critico della progressione tumorale CAF-mediata 8.
Nello studio precedente, abbiamo utilizzato il metodo conseguenza di isolare CAF polmonari 4. In questo esperimento, il mantenimento della sezione di tessuto aderenza sulla superficie del piatto è critica. Le cellule sono in grado di migrare da sezioni di tessuto galleggianti nel mezzo di coltura, e una volta che le sezioni di tessuto si distaccano dalla superficie, non possono più essere utilizzati per escrescenza cellulare sullo stesso piatto di coltura. Taglio del tessuto produce essudati, che servono come collante per il fissaggio alla superficie piatto. Nel fissare la sezione di tessuto con un vetrino, la quantità di grasso usato è anche Critical. Piccole quantità di grasso non riescono a mantenere la polizza di copertura allegata, mentre grasso eccessivo oscura zona di coltura cellulare. Montaggio di sezioni di tessuto con un vetrino e la pressione appropriata è anche una chiave per facilitare escrescenza cellulare.
I modelli sperimentali per la proliferazione delle cellule tumorali e l'invasione si sono per lo più affidamento su colture di tessuti monostrato bidimensionali o Boyden saggi camera. Per capire meglio la comunicazione intercellulare e modulazione ECM-dipendente del comportamento delle cellule del cancro, co-colture tridimensionali sono strumenti potenti. Colture organotipiche sono utili anche per lo studio delle interazioni multicellulari, anche se hanno bisogno di competenze tecniche elevate e condizioni sperimentali sono limitate.
Il nostro modello di co-coltura funge da piattaforma per valutare le interazioni tumore-stroma in condizioni che mimano il microambiente tumorale. Le cellule con specifici sovraespressione del gene o atterramento sono facilmente applicabili nella nostra culture sistema, che è un vantaggio rispetto cultura organotipica. In particolare, le nostre osservazioni precedenti hanno suggerito che i fibroblasti co-coltura modulano attivamente la differenziazione delle cellule tumorali e l'invasione 4. Sarebbe interessante verificare le possibili interazioni pluricellulari nel nostro ambiente sperimentale, come le cellule endoteliali, cellule infiammatorie e le cellule epiteliali non cancerose.
Caratteristiche distinte di CAF sono stati dimostrati in studi di co-coltura o con profilo di espressione genica, utilizzando colture CAF primarie e le loro controparti normali 9. D'altra parte, questi studi hanno anche dimostrato l'eterogeneità intra-tumorale o inter-individuale di CAF 10, parte dei quali potrebbero essere attribuibili a diversi livelli di fattore di crescita segnalazione 11 o fattore di trascrizione di attivazione 12. Pertanto, è essenziale per caratterizzare ulteriormente CAF eterogenei derivati da pazienti con cancro 13. A seguito di passaggi cellulari ripetuti,le caratteristiche di CAF colture primarie possono essere modificati. Pertanto, sarebbe meglio caratterizzare CAF alle brevi passaggi.
CAF contribuiscono alla ECM deposizione e rimodellamento, che a sua volta, può attivare CAF attraverso segnalazione cellulare tensione-triggered. Tale ciclo di feed-forward meccanotrasduzione mediata dell'attivazione CAF è stato suggerito il 14, e il nostro modello di contrazione gel di collagene può fornire intuizioni in questi meccanismi. I meccanismi di collagene gel contrazione includono la contrazione delle cellule, la proliferazione, la migrazione, la differenziazione, e collagene rimodellamento 15. Dettagliati studi istologici ed esperimenti utilizzando leganti, inibitori, o RNAi può essere utile per avere una visione meccanicistica in interazioni tumore-stroma.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| FBS | GIBCO | 10437 | |
| Collagen type IA | Nitta gelatin Inc. | CELL-1A | |
| Reconstitution buffer | Nitta gelatin Inc. | ||
| Cover slip | NUNC | 174934 | |
| Silicone grease | Dow Corning Toray | High vacuum grease | |
| Dispase I | WAKO | 386-02271 | |
| 6-well plate | BD Falcon | 353046 | |
| Cell strainer (70 μm) | BD Falcon | 352350 |
References
- Strell, C., Rundqvist, H., Ostman, A. Fibroblasts-a key host cell type in tumor initiation, progression, and metastasis. Ups. J. Med. Sci. 117 (2), 187-195 (2012).
- Augsten, M., Hägglöf, C., Peña, C., Ostman, A. A digest on the role of the tumor microenvironment in gastrointestinal cancers. Cancer Microenviron. 3 (1), 167-176 (2010).
- Augsten, M. Cancer-Associated Fibroblasts as Another Polarized Cell Type of the Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 4, 62 (2014).
- Horie, M., et al. Characterization of human lung cancer-associated fibroblasts in three-dimensional in vitro co-culture model. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Ohshima, M., et al. TGF-β signaling in gingival fibroblast-epithelial interaction. J. Dent. Res. 89 (11), 1315-1321 (2010).
- Ikebe, D., Wang, B., Suzuki, H., Kato, M. Suppression of keratinocyte stratification by a dominant negative JunB mutant without blocking cell proliferation. Genes Cells. 12 (2), 197-207 (2007).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Paulsson, J., Micke, P. Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer. Semin. Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).
- Navab, R., et al. Prognostic gene-expression signature of carcinoma-associated fibroblasts in non-small cell lung cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 108 (17), 7160-7165 (2011).
- Herrera, M., et al. Functional heterogeneity of cancer-associated fibroblasts from human colon tumors shows specific prognostic gene expression signature. Clin. Cancer Res. 19 (21), 5914-5926 (2013).
- Hägglöf, C., et al. Stromal PDGFRbeta expression in prostate tumors and non-malignant prostate tissue predicts prostate cancer survival. PLoS One. 5 (5), e10747 (2010).
- Saito, R. A., et al. Forkhead box F1 regulates tumor-promoting properties of cancer-associated fibroblasts in lung cancer. Cancer Res. 70 (7), 2644-2654 (2010).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6 (5), 392-401 (2006).
- Calvo, F., et al. Mechanotransduction and YAP-dependent matrix remodelling is required for the generation and maintenance of cancer-associated fibroblasts. Nat. Cell Biol. 15 (6), 637-646 (2013).
- Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Exp. Lung Res. 40 (5), 222-236 (2014).
