Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Protocol

NOT: Bu çalışma, uygun Etik Komiteleri tarafından onaylandı.

İnsan Akciğer Fibroblastları 1. İlköğretim Kültürü

1. Akciğer dokusunun Koleksiyon:
   1. Doğrudan cerrahi ameliyathane insan akciğer doku örnekleri edinin. Olabildiğince uzak olarak tümör toplanan kanserli olmayan numune ile, kanserli ve kanserli olmayan akciğer dokusundan yaklaşık 1 cm ³ blok toplayın.
   2. Dulbecco değiştirilmiş Eagle ortamı, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 0.25 ug / ml amfoterisin B (serumsuz ortam) ile takviye edilmiş (DMEM) içinde örnekleri askıya alındı. Steril 50 ml tüpler içinde asılı örnekleri koruyun ve laboratuvara transfer.
      Not: Fibroblastlar yüksek göçmen ve epitel, endotel ve düz kas hücreleri gibi diğer hücre tipleri ile karşılaştırıldığında, proliferatif. sonucudur yöntemi fibroblastların bu özelliklerinden yararlanmak ve outgro alırdoku kesitlerinden kanat hücreleri fibroblastlar bol miktarda bulunmaktadır. Çeşitli hücre geçiş sonrası, diğer hücre tipleri saflaştırılmış fibroblast hücre kültürlerinde elde edilen hayatta ve% 10 cenin sığır serumu (FBS) ile birlikte DMEM yaymak için başarısız olur. hücrelerin, birincil kültür, aşağıdaki 3-7 geçişleri kullanılabilir.
2. Hücre akıbet için eksplant kültürü ve iklimlendirme:
   1. Modifikasyonlar ⁵ ile önceden bildirilen protokolü kullanarak fibroblast primer kültürünü gerçekleştirin.
   2. Laboratuarda, kültür ortamında 10 cm uzunluğunda bir doku kültür tabağına, doku numuneyi ve küçük bölümler halinde kesilir ~ steril forseps ve bir neşter kullanılarak boyut olarak 2-3 mm arasındadır. Bu süreçte, aksi halde hücre akıbet verimliliği bozulur, bölüm kuru yapmamak.
3. Epitel hücre tabakası ve bağ dokusu Ayrılması:
   1. 4 ° C 'de 16 saat süre ile kültür 2000 poliüretan / ml dispaz I içeren ortamda ve kültür kesme doku bölümleri bekletin. </ Li>
   2. Bir çanak için doku bölümleri transfer ve bitişik bağ dokusundan epitel hücre katmanı ayırınız. Mikroorganizmaların kirlenmesini önlemek için temiz bir tezgah bölümleri işleyin.
      Not: epitel hücrelerinin ana bir kültürü gerekirse, adım 1.3 gerçekleştirin. Sadece fibroblastlar izole edilmesi ise daha sonra eksplant kültürü ve hücre geçişleri saflaştırılmış fibroblast popülasyonları elde epitel hücreleri için elverişsiz olması nedeniyle, adım 1.3 sayın.
4. Doku kesitlerinin Ek:
   1. İki neşter kullanılarak 1 mm'lik parçalar halinde dokuları kıyma. Adet kadar küçük değilse, bunlar çanak daha kolay ayırmak ve hücreler çanak yüzeyinde büyümek için başarısız olur.
   2. Her parça çevreleyen boş bir alana korumak için birbirinden küçük akciğer dokusu bölümleri yerleştirin. Doku bölümlerinin bağlanmasını kolaylaştırmak için bir bisturi bıçağını kullanarak doku kültürü çanağı yüzeyinde çizikler yapın.
      NOT: TaraklıAyrıca hücrelerin göç hangi boyunca kesitler sunmak, hücre büyümesini kolaylaştırmak için görünür.
      1. Seçenek olarak ise, ayrı ayrı, bir 6-yuvalı plakanın her oyuğuna kıyılmış doku parçaları yerleştirmek ve bir kayar kapak ile kapak. Silikon gres kullanılarak plaka yüzeyine kapak kayma takın.
      2. Her iyi steril bir iğne kullanarak 1.5 cm arayla iki noktada silikon gres yerleştirin. Doku parçaları Kapsama çeşitli pasajlar aşağıdaki hücre akıbet ve hücre yayılımı etkinliğini artırır.
5. Müteakip eksplant kültürü:
   1. Numuneler kurumaya eğer etkin hücre akıbet çoğunlukla kaybolur gibi doku bölümleri, kurumasına önce hafifçe çanak kültür ortamı ekleyin. Çok hızlı doku bölümleri ayırmak gibi orta dökmeyin.
   2. % 10 FBS'li DMEM içinde kültür hücreleri. Ek yüzdürme gelen dekolmanı teşvik gibi, yüzen sağlar ki çok sadece doku karşılamak için yeterli ortamı kullanın, ancakçanak.
6. Hücre geçişi:
   1. Kültür çanağı tekrar hareket doku bölümlerinin ayrılması yol gibi her zaman dikkatli bir kültür ortamı kullanın.
   2. 5-7 gün boyunca 37 ° C'de bir kuluçka makinesi içinde kültür kaplarına yerleştirin. Her gün orta Refresh, orta değişiklikleri sırasında minimal kültür yemekleri anlaştım. Fibroblastlar önümüzdeki birkaç hafta içinde doku kesitlerinin kenarından büyümek.
      Not: ~ 2-3 hafta sonra, üzerinde büyüme fibroblastlar neredeyse yüzey alanının miktarına bağlı olarak, kaynaşmaya eriştikten.
   3. 1x hücrelerin PBS ile yıkayın ve plakasına tripsin 1 ml.
   4. Tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM 9 ml kullanarak hücreleri ayırmak. Doku kesitleri ile birlikte bir 10 ml tüp içinde ortam içinde süspansiyon haline getirilmiş hücreler toplanır. Hücre topakları oluşturmak üzere santrifüjden sonra, yeni bir ortam içinde elde edilen pelet yeniden süspanse edin.
   5. Yeni bir cul üzerine hücreleri ve doku bölümleri TohumTure çanak, hangi noktada doku hücreleri yapışır ve büyürken çanak eklemek başarısız. Ertesi gün, aspirasyon ile yüzen doku parçaları kaldırmak ve orta değiştirin. Ekli fibroblastlar sonraki kültürlerle yaymak.

İnsan akciğer fibroblastlan ve Kanser Hücreleri 2. Üç boyutlu Co-kültür

1. Hücre ve reaktiflerin hazırlanması:
   1. Yaklaşık 2 x 10 ⁵ epitel hücreleri ve kuyu başına 2.5 x 10 ⁵ fibroblastlar kullanın. (3 mg / ml, pH 3) FBS (% 100), yeniden oluşturma tamponu (50 mM NaOH, 260 mM NaHCO _3, 200 mM HEPES), 5x DMEM DMEM fibroblast kültürü için% 10 FBS ile takviye edilmiş kolajen tip IA hazırlanması ve 3D ko-kültür ortamı (1: kanser hücreleri fibroblast kültür ortamı ve kültür ortamına 1 karışımı).
   2. Kültür A549 akciğer adenokarsinoma hücreleri, fibroblastlar ve DMEM A549 3D ko-kültür,% 10 FBS ile takviye edilmiştir.
2. Kollajen jel formation:
   1. 1x PBS ile 10 cm çanak kültüre fibroblast yıkayın, ve ben plakasına tripsin 1 ml ekleyin. 37 ° C'de ~ 5 dakika boyunca tripsinizasyondan sonra,% 10 FBS ile takviye edilmiş, 9 ml DMEM kullanılarak hücreleri ayırmak. 10 ml'lik bir tüp içinde bir ortam içinde süspansiyon haline hücreleri toplamak, ve hücre topakları oluşturmak üzere 200-300 xg'de santrifüj.
   2. ⁵ x 10 5 / ml'lik bir yoğunlukta% 100 FBS içinde elde edilen pelet yeniden süspanse.
   3. Buz üzerinde kolajen jel hazırlayın. Aşağıdaki prosedüre önce bir soğutucuda reaktifler, pipet ve tüpler soğutun. Hatta, buz üzerinde, karışım bir ölçüde katılaştığı ve toplam hacim, tüm bileşenlerin toplamından daha azdır.
   4. Her bir oyuğa olarak, FBS fibroblast süspansiyonu (2.5 x 10 ⁵ hücre), 0.5 mi, 2.3 mi türü IA kollajen, 670 ul 5x DMEM ve 330 ul sulandırma tamponu karıştırılarak kollajen jel hazırlamak. Jeller oda sıcaklığında kolayca ayarlamanıza olanak verir.
      1. Şiddetle homojen bir mil sağlamak için pipetsoğutun. Pipetleme işlemi sırasında hava kabarcıkları oluşturarak kaçının.
   5. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna karışım (3 mi) ilave edilir ve 30-60 dakika boyunca bozukluğu olmadan 37 ° C'de inkübatör içinde jelatinleştirilmesi için izin verir.
3. Kollajen jel üzerinde Kanser hücre kültürü:
   1. ⁶ değişiklikler ile daha önce rapor protokol kullanılarak, üç boyutlu bir ko-kültür yapın.
   2. 1 x 10 ⁵ / ml'lik bir yoğunlukta 3D ko-kültür ortamı içinde (ya da A549 hücrelerinin durumunda,% 10 FBS'li DMEM içinde) yeniden süspanse edin, kanser hücreleri.
   3. Her jel yüzeyi üzerine yeniden süspanse hücre çözeltisi (2 x 10 ⁵ hücre) 2 ml dökün. Deney koşullarına bağlı olarak ko-kültür kanser hücreleri ya da fibroblastlarının hücre sayısını değiştirir.
4. Jel daralma:
   1. Kanser hücreleri kolajen jel ile uygun böylece 37 ° C'de gece boyunca jeller inkübe edin. Her jel ayırın ve o her iyi bir 'yüzen kültürü' oluşturmak6-çukurlu plaka f.
      NOT: Bir yüzen kültürü kullanarak, jelin, boyutu çeşitli değişiklikler birlikte kültüre kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki hücresel etkileşim aracılık eder mekanik gerilim ve kolajen degradasyonu ile uyarılmaktadır.
   2. Kuyunun kenarına her jel ayırmak için açılı 21 G iğne veya küçük spatula kullanın. Her 2-3 günde bir, 3 boyutlu ortak-kültür ortamı içinde 2 ml ile kuyu yenileyin. 5 gün boyunca her gün, her jelin boyutu ölçülür.
5. Kolajen jellerin analiz:
   1. Böyle Sircol tahlili gibi kollajen kantitasyon yöntemleri kullanarak her jel kollajen içeriğini ölçün. Jeller ⁵ RNA topladıktan sonra Transkriptomik analiz veya kantitatif RT-PCR gerçekleştirin.

3. Hava-sıvı Arayüz Kültür ve Invasion Testi

1. 5 gün boyunca 37 ° C 'de, kolajen jel kültürlendikten sonra yeni 6- bir ağ örgü üzerinde (70 um gözenek boyutu) yerleştirerek hava almasına jeller maruzhavuzlu plakalar hazırlanmıştır. Akış sitometrisi için kullanılan ticari olarak temin edilebilen hücre süzgeçler mesh olun.
2. Yavaşça 3D ko-kültür ortamı 11 ml her bir doldurun.
3. Steril bir kaşık kullanarak örgü üzerine jeller yerleştirin ve jeller kalan orta kaldırmak. Havaya jel üst yüzeyini açığa ederken bu durum üzerinde, orta jeller daldırın. Hava-sıvı arayüzü olarak bu kültürün durumu tanımlayın.
   Not: kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de hava-sıvı arayüzü kültür muhafaza 5-7 gün sonra, invazif kanser hücrelerinin jel içine göç ederler. Hücre tipine ve hücresel etkileşimler sonucu olarak, kanser hücrelerinde hücre morfolojik değişim değişik derecelerde hava-sıvı arayüzü kültürü ile uyarılmaktadır.
4. Histolojik değerlendirme için, oda sıcaklığında bir gece boyunca formalin jel saptamak ve parafin içine gömmek. Hematoksilen ve eosin (H & E) ile dikey bölümleri (4 mikron) Leke. Immünohistokimyasal analiz o gerçekleştirinn bölümler ^4.

Representative Results

Bu ko-kültür yöntemi, tümör mikro taklit, kollajen jeller gömülü kanser hücreleri ve fibroblastlar arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir araçtır. Kolajen jel kasılması, kanser hücresi yayılımını tamamen ve morfolojik değişim önceki çalışmada, üç parametre, bu deneysel modelinde değerlendirildi. Kanser hücre çoğalması da Ki67 immün ⁴ kullanılarak tahmin edilmiştir. Akciğer doku örnekleri bir rezeksiyon akciğer lobu (Şekil 1A) kanserli ve kanserli olmayan bölümlerde toplanmıştır. Örnekler, küçük parçalar halinde doğrandı ve DMEM,% 10 FBS (Şekil 1B) ile takviye edilmiştir. Doku bölümünde dışarı büyüyen fibroblastlar mikroskop (Şekil 1C) altında gözlendi. Primer kültürlenmiş akciğer fibroblast, bir kolajen jel içine gömülü (Şekil 2A, a) ve A549 akciğer kanseri hücreleri jeli üzerinde eş-kültürlenmiştir (Şekil 2A, B). Yüzer soğutulduktan sonraortam içinde ulture (Şekil 2A, c) jel hava-sıvı arayüzü koşulu altında daha da kültürlenmiştir (Şekil 2A, d). Jel formalin içinde sabitlenmiş ve immünohistokimyasal analizler (Şekil 2A, e) dönüştürülmesi için kullanılmıştır. Hava-sıvı arayüzü kültürü için, jel, 6-çukurlu plaka içinde bir kuyu (Şekil 2B), bir kafes içine yerleştirildi. Jel histolojik analizler akciğer kanseri ile ilişkili fibroblastlar (Şekil 3) gömülü kollajen jel içine A549 hücrelerinin istilasını tespit edildi.

Şekil 1: cerrahi rezeksiyon insan akciğer dokusundan fibroblastların akıbet. (A) Örnekler rezeke lobun kanserli ve kanserli olmayan bölümler toplandı. (B) numuneleri küçük parçalar halinde dilimlenir ve% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM içinde kültüre edildi.(C) Fibroblastlar doku bölümünde (ok) büyümüştür. Hücreler kültür çanak neşter bıçakları tarafından yapılan çizikler boyunca göç unutmayın. Ölçek çubuğu, 200 mikron.

Şekil 2:. Kollajen jel hava-sıvı arayüzü kültür A549 hücreleri, fibroblastlar ile gömülü bir kollajen jel ile birlikte kültürlendi ve A549 hücrelerinin katmanı ortamında örgü üzerine jel yerleştirerek havaya maruz (A. ) ko-kültür ve hava-sıvı arayüzü üç boyutlu deneysel prosedürler., (a) Kolajen jel akciğer fibroblast gömülebilir., (b) kollajen jel üzerinde birlikte kültürlenmiş A549 hücreleri. (c) Yüzer kültürü. (d) 'Hava- Sıvı arayüzü (ALI). Formalin jel (e) Fiksasyon. (B) th Temsilcisi resim6-çukurlu plaka içinde bir kuyu içinde ağı üzerine yerleştirilir e jeli. O / N: gecede.

Şekil 3. hematoksilin ve A549 hücreleri, insan akciğer fibroblastlarında oluşan bir üç-boyutlu kültürlenmiş jel kesitlerinin eozin boyama. Kolajen jeli üzerinde bu A549 hücreleri, kültürlenmiş Not fibroblastlar (oklar) ile yerleştirilmiştir jel işgal. Ölçek çubuğu, 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Cafs kanser hücrelerini çevreleyen ECM'nin bir bileşenini oluşturmaktadır ve tek tümör için bir iskele sağlar, ancak aynı zamanda aktif tümör gelişiminde ⁷ katılmaz. Biriken deliller CAF-aracılı tümör ilerlemesi ⁸ kritik rolleri vurgulayarak, nihai prognozu cafs veya ilgili moleküllerin etkisini unravels.

Bir önceki çalışmada, akciğer cafs ⁴ izole etmek sonucudur yöntem kullandı. Bu deneyde, bulaşık yüzeyi üzerine doku kesiti yapışma bakım kritiktir. Hücreler, kültür ortamı içinde yüzen doku kesitlerinden üzerinden geçirmek mümkün değildir, ve doku kesitleri yüzeyinden yerinden çıkıp sonra, artık aynı kültür tabağına, hücre büyümesi için kullanılabilir. Doku kesme, bulaşık yüzeyi ile bağlanması için bir yapıştırıcı olarak hizmet dışkıların, elde edilir. Bir kayar kapak ile birlikte doku bölümü sabitleme, kullanılan yağ miktarı da criti olancal. Gres Küçük miktarlarda aşırı yağ hücre kültürü alanı gizler ise, ekli kapak kayma tutmak için başarısız. Bir kapak kayma ve uygun basınç kullanarak doku kesitlerinin Ek hücre büyümesini kolaylaştırmak için bir anahtardır.

Kanser hücre çoğalması ve işgali için deneysel modeller çoğunlukla iki boyutlu tek tabakalı doku kültürleri veya Boyden odası deneyleri yararlanmıştır. Daha hücrelerarası iletişimi ve kanser hücresi davranış ECM-bağımlı modülasyon anlamak için, üç-boyutlu ortak kültürler güçlü araçlardır. Daha yüksek teknik beceri mi ve deney koşulları sınırlı olsa Organotipik kültürler, ayrıca çok-etkileşimlerinin araştırılması için de yararlıdır.

Bizim co-kültür modeli tümör mikro taklit koşullar altında tümör stromal etkileşimlerini değerlendirmek için bir platform olarak hizmet vermektedir. Belirli gen aşırı ekspresyonu veya demonte ile hücreler bizim kültürlerdeki kolaylıkla uygulanabilirOrganotipik kültürü üzerinde bir avantaj olan sistemin yeniden. Özellikle, önceki gözlemler eş-kültür fibroblastlar aktif kanser hücre farklılaşması ve işgali ⁴ modüle önerdi. Bu, endotel hücreleri, iltihaplı hücreleri ve kanserli olmayan epitel hücreleri gibi deneysel ortamda olası çok-etkileşimleri test etmek için ilginç olacaktır.

Cafs farklı özellikleri birincil CAF kültürleri ve bunların normal emsallerine ⁹ kullanarak, ko-kültür çalışmaları ya da gen ekspresyon profili ile gösterilmiştir. Öte yandan, bu çalışmalar da ¹¹ ya da transkripsiyon faktörü aktivasyonunu ¹² Büyüme faktörü sinyal farklı düzeylerde olmasıyla açıklanabilir parçası olan cafs ¹⁰ arasında intra-tümöral ve bireyler arası heterojenite göstermiştir. Bu nedenle, daha fazla kanser hastalarında ¹³ türetilmiş heterojen cafs karakterize etmek için gereklidir. Tekrarlanan hücre geçişleri ardından,primer kulturlenmiş cafs özellikleri değiştirilebilir. Bu nedenle, erken geçişleri de cafs karakterize etmek daha iyi olurdu.

Cafs da, gerilim tetiklenen hücre sinyal aracılığıyla cafs aktive edebilir ECM birikimi ve yeniden, katkıda bulunur. CAF aktivasyon Böyle bir mechanotransduction-aracılı ileri beslemeli döngü ¹⁴ öne sürülmüştür, ve bizim kollajen jel daralma modeli bu mekanizmaların içgörüler sağlayabilir. kollajen jel daralma mekanizmaları, hücre kasılmasını, çoğalmasını, göç, farklılaşma ve kollajen remodeling ¹⁵ içermektedir. Ligandlar kullanılarak detaylı histolojik çalışmalar ve deneyler, inhibitörleri, veya RNAi tümör-stroma etkileşimler içine mekanik fikir edinmek için yararlı olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Collagen type IA	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
Reconstitution buffer	Nitta gelatin Inc.
Cover slip	NUNC	174934
Silicone grease	Dow Corning Toray	High vacuum grease
Dispase I	WAKO	386-02271
6-well plate	BD Falcon	353046
Cell strainer (70 μm)	BD Falcon	352350