Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все протоколы эксперимента были утверждены французской экспериментов на животных и этике комитетом и утверждены на "Службы по защите и др Санте Animales, Environnement" с номером А-75-2065. Примеры размеры выбраны так, чтобы обеспечить воспроизводимость экспериментов, и в соответствии с 3R регулирования животных этической.
1. Подготовка мыши
- Анестезия
- За короткий период томографии (менее 1 ч), анестезию мыши путем внутрибрюшинной инъекции 200 мкл физиологического раствора, содержащего кетамином (100 мг / кг) и ксилазина (10 мг / кг).
- Кроме того, в течение более длительного периода визуализации (до 4 ч), анестезию мыши с вдыхании изофлуран 2,5% испаренного в 70/30 смеси O 2 / N 2 O, через адаптированной маски.
- ПРИМЕЧАНИЕ: Этот способ обеспечивает более стабильную потерю сознания и избегает серийный внутрибрюшинного введения препаратов. После того, как мышь под наркозом, проверьте бессознательного через стимуляцию подушечку лапы с щипцами.
- Сосудистая окрашивание / дополнительная окрашивание
- Для сосудов окрашивания: Вводят внутривенно в хвостовую вену, 200 мкл родамина-декстрана (2 МДА, 10 мг / мл в солевом буфере).
- Для окрашивания нейтрофилов: вводят 2 мкг Ly6G-РЕ (клон 1A8) в 100 мкл физиологического раствора внутривенно в хвостовую вену.
- Иммобилизация
- Для иммобилизации, используйте на заказ стереотаксической держатель, выполненный с возможностью микроскопом и обезболивающий газа ингалятора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Sterotactic держатель металлическая опора с двумя металлической пластиной скобках, один из которых фиксируется и другие сменные и адаптации, ужесточить голову животного. - Установите головку мыши между удерживающими пластинами для обеспечения изоляции от дыхательные движения. Затянуть уши между пластины крепления и головы, чтобы растянуть СК. Проверьте стабильность и дыхание благосостояния животного.
- Для иммобилизации, используйте на заказ стереотаксической держатель, выполненный с возможностью микроскопом и обезболивающий газа ингалятора.
- Снимите кожу головы
- Осторожно использовать этанол 70% для увлажнения волос в кожу головы с помощью стерильного аппликатора, избегая контакта с глазами.
- Разрежьте кожу стерильными ножницами и щипцами, чтобы полностью удалить кожу головы от назад теменной кости лобной кости. Беречь до 3 мм от глаз и ушей, чтобы предотвратить обширный кровотечение. Снимите рыхлой соединительной ткани, покрывающей череп (надкостницы). Промойте оставшиеся волосы теплой PBS-пропитанной бумажной салфеткой.
- Система погружения настроить
- Вставить резиновое кольцо диаметром 18 мм с хирургическим клеем непосредственно на черепе с помощью небольшой иглы, чтобы контролировать распределение. Клей всей периферии резинового кольца, чтобы предотвратить утечку (30 мкл, должно быть достаточным).
- Очистите череп под кольцом в последний раз с PBS-пропитанной бумажной салфеткой, а затем добавить 37 ° C PBS для полного погруженияЧереп. Добавить каплю NaCl 0,9% раствора или специального глазной мази на каждый глаз мыши, чтобы избежать сухость глаза. Перетащите стереотаксической держатель под цели.
- Примерно расположить поле с помощью микроскопа окуляра через прямой передачи.
2. Двухфотонное Приобретение изображений
- Используйте многофотонную микроскопа в сочетании с Ti: кристаллического лазера Sapphire, которая обеспечивает 140fs импульсы NIR света, избирательно настраиваемый от 680 до 1080 нм, а акустооптического модулятора для управления мощности лазерного излучения. Используйте конфигурацию, включающую 3 внешних, не являющихся descanned детекторов (NDD) (которые позволяют одновременную запись 3 флуоресцентных каналов) с комбинацией 2 дихроичных зеркал (565 нм и 690 нм), 565/610 и 500/550 полосовых фильтров, и 485 Короткая фильтр нижних частот, с целью Apochromat × 20 (NA = 1) погружения в воду цели.
- Установите камеру нагрева для обеспечения хорошей homeothermy из anaesthetized мыши.,
Примечание: Температура может быть установлена 1 ч до визуализации сеанса для лучшей стабильности. В нашем случае, 32 ° С была выбрана, чтобы получить оптимальную температуру тела анестезированной мыши (36-37 ° C) и выдерживают до 4 ч. Эта температура может быть адаптирована к системе используется (цифровой датчик может быть использован, чтобы проверить эту точку). Кроме того, камера нагрева используется темный / черный и охватывает часть системы (целей и моторизованной пластины), чтобы избежать внешнего источника света. - Включите систему
- Включите Ti: Sapphire лазера, то вся система микроскопа. Запустите программу приобретения. Установите диапазон длины волны лазерного излучения 870 нм. Выберите подходящий NDD для записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, генерация второй гармоники (ГВГ) 19 и голубой флуоресцентный белок (ECFP) обнаруживаются NDD после 485 короткий фильтр нижних частот. ECFP также обнаружен NDD после фильтра 500/550 полосовой и Rhodamin-декстран обнаружены тон NDD после 565/610 полосового фильтра.
- Включите Ti: Sapphire лазера, то вся система микроскопа. Запустите программу приобретения. Установите диапазон длины волны лазерного излучения 870 нм. Выберите подходящий NDD для записи.
- Настройка параметров сбора
- Используйте "в прямом эфире приобретения" команду визуализации программного обеспечения и с помощью регулятора направления микроскопа, настроить фокус на области с ECFP и родамина сигнала. Установите мощность лазера до минимума, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал-шум с минимальным фото-повреждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: установка мощности варьируется в зависимости от глубины области интересов. Обычно настройки АОМ установлены около 20%, что представляет собой мощность лазера выходит за рамки цели около 15 мВт. Это лучше увеличить коэффициент усиления мощности на ФЭУ для каждого NDD, чтобы уменьшить фото-отбеливание и фото-повреждения. Типовые настройки сбора являются однократное сканирование с временем пикселей выдержки 1,58 мкс, а разрешение 512 х 512 пикселей с 1,5 увеличении.
- Используйте "в прямом эфире приобретения" команду визуализации программного обеспечения и с помощью регулятора направления микроскопа, настроить фокус на области с ECFP и родамина сигнала. Установите мощность лазера до минимума, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал-шум с минимальным фото-повреждения.
- Выберите регионах, представляющих интерес
- После того, как параметры записи установлены, использовать снова "Живое" команду приобретение,и обследовать ткани, чтобы выбрать нужный (х, у, г) поле и будет отслеживать в режиме реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, мы выбрали области, включая как сосудистых и паренхиматозных областей. - Регистрация на поле с командой программного обеспечения "Позиция".
Примечание: Эта команда запоминает х, Y, Z координаты разных отдаленных областях. - Выберите и зарегистрировать дополнительные поля, представляющие интерес (до 3), используя ту же процедуру.
- Установите 3D Z-стек с помощью программной команды "Z-Stack" на первом в памяти положение в соответствии с требуемым объемом с выбранной увеличения. Запомните глубокое положение, а затем верхнее положение. Нормализация мощность лазера с глубиной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для многократного изображений сопутствующей поля, мы приобретаем 5 ломтиков, разделенных Z-шагов 3 мкм для каждого поля, чтобы приобрести объем 12 мкм толщины. Эти параметры могут быть адаптированы к типу клеток исследуемой.
- После того, как параметры записи установлены, использовать снова "Живое" команду приобретение,и обследовать ткани, чтобы выбрать нужный (х, у, г) поле и будет отслеживать в режиме реального времени.
- Приобретение Launch
- Выберите220; временные ряды "Команда программное обеспечение и выбрать длительность интервала времени и количества циклов. Начните покадровой обработки изображений в соответствии с промежутком времени и продолжительности, необходимой, выбрав "Пуск эксперимент" команду программного обеспечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем случае, мы приобретаем одну объем каждые 30 секунд в течение 60 циклов, представляющих 30 мин в режиме реального времени. Меньший промежуток времени может быть выполнена быстро, чтобы отслеживать клеток прокатки в кровеносном сосуде. В этом случае растворитель Z-стека и не более чем 2 различных областях могут быть записаны в то же время. - Регулярный мониторинг настроить.
- Всегда следите за животное, чтобы убедиться, что в бессознательном состоянии.
ПРИМЕЧАНИЕ: встряхивания усов или ноги животного являются индикаторами возрождения. В этом случае дыхание животного прерывисто, количество изофлуран может быть несколько снижена. Сильный дрейф ткани во время приобретения индикатор возрождения мыши. - Убедитесь, что цель правильно погружены в воду. Обновить 37 ° C PBS betweeп две поглощения (30 мин).
ПРИМЕЧАНИЕ: постепенное исчезновение сигнала при приобретения индикатор утечки PBS.
- Всегда следите за животное, чтобы убедиться, что в бессознательном состоянии.
- Выберите220; временные ряды "Команда программное обеспечение и выбрать длительность интервала времени и количества циклов. Начните покадровой обработки изображений в соответствии с промежутком времени и продолжительности, необходимой, выбрав "Пуск эксперимент" команду программного обеспечения.
- Конец процедуры
- После того, как необходимые видео записано, усыпить животное путем смещения шейных позвонков быстро до реанимации.
Примечание: заживление ран, приводит к образованию струпа в от 24 до 48 ч, что ограничивает возможность производить продольное изображений.
- После того, как необходимые видео записано, усыпить животное путем смещения шейных позвонков быстро до реанимации.
3. Анализ данных
- Коррекции дрейфа
- Используйте Imaris битовой плоскости программное обеспечение для 3D автоматического слежения.
- Откройте последовательность 3D изображения на Imaris. Выберите команду "спот", а также генерировать ручной трекинг (щелчка мыши + SHIFT) для всех временных точках в течение как минимум 4 разных опорных точек, если возможно равномерно распределены в этой области.
- Применяйте коррекцию дрейфа с помощью команды "правильно дрейфа" на вкладке "Редактирование траектории».
- Проверьте тон Качество коррекции в х, у и, в частности в г, чтобы избежать артефактные колеблющихся.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если коррекция не является удовлетворительным, попробуйте другие опорные точки или исключить видео из анализа.
- Отслеживать сотового
- Используйте "добавить новые точки" команду и выберите "Track пятна с течением времени" настройки алгоритма. Перейдите к следующему шагу.
- Применить процедуру автоматической отслеживания клетка либо на всей канала, представляющего интерес, используя команду "источник канала". Набор объектов (то есть, клетки) диаметром до 10 мкм. Перейдите к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор будет зависеть от различия между объектами и специфике измеряемого сигнала. Короче говоря, автоматическое отслеживание по всему каналу возможно только при обнаружении сигнала является специфичным для объекта интереса. Потому что оба ГВГ и ECFP обнаруживаются NDD после 485 короткий фильтр, отслеживания будет более конкретным и эффективным использованием ECFP сигнал, записанный на NDD после 500/550 полосовые фильтры. Кластерный или плотные упакованные объекты требуют ручного выбора отдельных объектов, подобных шагу 3.1.2. - Выберите "качество" тип фильтра, установить порог для исключения отслеживание неспецифических объектов. Перейдите к следующему шагу.
- Выберите «броуновское алгоритм Motion" с точными параметрами "Максимальное расстояние" и "размер зазора» между двумя пятнами. Подтвердить поколение дорожки.
- После того, как треки рассчитывается автоматически, выберите "продолжительность трека" тип фильтра, установить порог для устранения треки короче 120 сек (что составляет 4 временные точки).
- Обязательно: После автоматического слежения, проверить качество треков.
- Разверните шкалу времени, чтобы проверить, что объекты Следуйте по пути. Если нет, используйте опции коррекции точки трека доступны на вкладке «править»: Удалить ложные или неправильные треки с "удалить" команда (удалить любой трек рoint индивидуально с помощью команды "Отключить"). Если трек путь является непрерывным, добавить недостающие моменты времени (, мыши, + Shift), выделите все точки на данной трассе, и использовать команду "Connect" на вкладке "Редактирование траектории».
- Параметры Количественная
- Выберите вкладку "Статистика" в команду "Настройки", выберите динамических параметров, представляющих интерес в списке. Выберите "Экспортировать все статистические данные в файл" и сохраните файл первенствовать генерируется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые динамические параметры, полученные непосредственно из программного обеспечения, таких как длин треков, мгновенной скорости, средней скорости, а также отслеживать прямолинейность. Коэффициент подвижности 6, 20 может быть определена, но прямо не предусмотрено программой. - Для каждой ячейки, вычислить среднее значение перемещений для каждого периода времени (t) (для 30 сек времени истечения кино, & delta; t будет 30, 60, 90 сек, и т.д.).Участок среднее значение квадрата смещения в зависимости от временного интервала. Получить коэффициента подвижности путем расчета наклона линейной части кривой.
- Выберите вкладку "Статистика" в команду "Настройки", выберите динамических параметров, представляющих интерес в списке. Выберите "Экспортировать все статистические данные в файл" и сохраните файл первенствовать генерируется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Структура черепа мыши предоставляет хорошую возможность для изучения физиологии костного мозга прижизненной визуализации. Костный быть тонким вокруг передней теменной области, можно получить доступ к продолговатого мозга ниши без истиранию кости. Рисунок 1 представляет широкий 2D поле черепа MacBlue трансгенной мыши. Костный матрикс состоит в основном из коллагена I можно было легко обнаружить с помощью ГСП 19. Введение родамина-декстрана пятна сосудистую сеть костного мозга и позволяет для определения ниши мозга паренхимы костного между костной матрицы и сосудов 14. ECFP клетки распределены в двух отсеках костном мозге, но отсутствуют в костный матрикс. Моноциты вручную классифицируются в соответствии с их расположением в ткани. Сосудистый моноцитов определен, когда вся клетка в сосудистой, без учета размера судна. Только большие коллекционирование венул исключены из нашей анализ. Паренхимы моноцитов определен, когда клетка находится между сосудистой и костного матрикса.
Покадровый изображений специфической области интереса (дополнительные видео 1 и 2) позволяет для расчета траектории отдельной клетки в течение долгого времени ни для сосудов (рис 2А) или паренхиматозных (рис 2В) моноцитов. Длина трека показывает, что паренхимы моноциты дисплей уменьшается смещение по сравнению с сосудистыми моноцитов. Анализ смещения во времени сравнивает среднюю скорость моноцитов в обоих отсеках (фиг.2с). Среднеквадратичное смещение как функция времени является мерой степени пространственного случайного движения. Коэффициент Подвижность определяется наклоном линейной части кривой и обеспечивает более полное представление о смещении клеток (см обсуждения раздел). Коэффициент подвижности сосудистых моноцитов (MC = 71μm² / с) выше, чем подвижность coefficieNT паренхиматозных моноцитов (MC = 4.4μm² / с).
Временное разрешение на приобретение должна быть адаптирована к средней скорости клеток. Роллинг сосудистые моноциты могут сделать заметное смещение в течение короткого времени задержки. Для более точного отслеживания клеток, уменьшая промежуток времени приобретения является предпочтительным. 3 показана иллюстрация отслеживания моноцитов с двух разных временных разрешений. 30 сек интервал времени снижает точность, а также длину пути (в зеленой пунктирной линией) по сравнению с 10 сек интервалом времени.
Наконец, Рисунок 4 иллюстрирует возможность анализировать другую ячейку подмножество одновременно моноцитов. Ly6G является специфическим маркером зрелых нейтрофилов мыши. Введение анти-Ly6G в сочетании с флуорохромом (в данном случае Phyco-erythrin) 5 мин до отображающей последовательности пятен нейтрофилов непосредственно в естественных условиях. Такой подход обеспечивает дополнительную Dimension анализа и возможность сравнить поведение разных подмножеств клеток. Такой подход может быть использован для определения подмножества в моноцитов отсеков.
Рисунок 1. Широкое поле организации череп костного мозга. В естественных условиях двухфотонного лазерной сканирующей микроскопии изображение черепа стационарном костного мозга от MacBlue мыши. Сосудистой (красным цветом) окрашивается хвост зря инъекции 2MDa Rhodamin-декстрана 5 мин до визуализации сессии. Кости визуализируется генерации второй гармоники (синий). ECFP + моноциты (Cyan) находятся в паренхиматозных ниш (темные области между сосудистой и костной ткани) и в сосудах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок слежения клеток 2. в режиме реального времени. Представительства трек дорожки вдоль времени моноцитов в течение (А) сосудистой и (В) паренхимы. Дорожки (зеленая линия) для каждой ячейки генерируются автоматически с помощью программного обеспечения. Красные пятна представляют собой центр масс отслеживаемые клетках. (C) означают сравнение скоростей между сосудистых и паренхиматозных моноцитов. Манна-Уитни Статистический анализ был выполнен, *** р <представляет 0001. (D), средний квадрат смещения (MSD) в зависимости от времени представлен сосудистых и паренхиматозных моноцитов. Асимптотической кривой указывает на ограниченный смещение клеток с течением времени, в то время как линейная кривая показывает случайное блуждание в не ограниченных окружающей среды. Коэффициент подвижности указывает на степень смещения клеток и определяется по наклону с Urve рассчитана с помощью линейной регрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. Разрешение по времени интервал в исследовании прокатных моноцитов. Типичные последовательности изображений показывают, что увеличение временного разрешения улучшает точность траектории качения клеток. (Up) последовательности изображений с интервалами 10 сек. (Вниз) последовательность изображения с интервалами 30 сек. Качество Дорожки улучшается и риск рассматривает два различных клеток для же или напротив, уменьшается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4. В естественных условиях совместной локализации из продолговатого мозга нейтрофилов и моноцитов. Этот рисунок иллюстрирует возможность обнаруживать другой ячейки подмножество в естественных условиях одновременно с моноцитами, путем введения специфических моноклональных антител в сочетании с флуорохромом. 2 мкг Ly6G-PE антитела были введены внутривенно за 5 минут до визуализации черепа костного мозга MacBlue мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Дополнительное видео 1. миграционного поведения паренхиматозных моноцитов. В естественных условиях 3D-визуализация стационарном миграционной активности моноцитов в паренхиме череп костного мозга мыши MacBlue. Сигнал ECFP + в голубой цвет. Миграционные пути для каждой ячейки (красная точка) отображается зеленым цветом.
Дополнительный видео 2. миграционного поведения сосудистых моноцитов. В естественных условиях 3D-визуализация стационарном миграционной активности моноцитов в сосудистую череп костного мозга MacBlue мыши. Сигнал ECFP + в голубой цвет. (2М Да) родамин-декстран вводили до сессии изображений, чтобы отличить сосудистую костного мозга (красный). Миграционные пути для каждой ячейки (красная точка) отображается зеленым цветом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические точки естественных методологии формирования изображения в том, чтобы обеспечить стабильность фокуса для того, чтобы максимизировать продолжительность визуализации и свести к минимуму риск бактериального загрязнения и воспаления, которые могут повлиять на динамику воспалительных клеток. Визуализация черепа костного мозга следующим этих целей, как операция, чтобы получить доступ к костного мозга минимальна. Использование стерильного материала и антисептиков важно ограничить риск инфекции, которая может вызвать возмущение в клеточного гомеостаза.
Развитие стереотаксической держатель может быть сложным и требует конкретной настройки для каждой системы (расстояние между объективной и моторизованного столик микроскопа, использование газа ингалятора для анестезии). Важно, чтобы получить голову мыши в максимально горизонтальном положении для обеспечения более широкого доступа поверхности изображения. После того, как животное расположен, вполне вероятно, что через несколько минут может быть эксплуатацию комплексред, чтобы получить хорошую стабильность фокальной плоскости. Поэтому, рекомендуется, чтобы проверить ткани дрейфа до начала записи приобретения. Поскольку этот процесс вместе с выбором регионах, представляющих интерес может длиться некоторое время, он также рекомендуется регулярно проверять, что животное находится в бессознательном состоянии, если были использованы Ketamin / Xylazin, и для проверки надлежащей погружения цели, как утечка и испарения может возникает.
Удобное положение резинового кольца на черепе представляет собой еще один важный шаг в этом процессе. Цианоакрилат клей обеспечивает хорошие результаты с точки зрения стабильности и герметизации, но нужно, чтобы предотвратить чрезмерное загрузку клея, которые могли бы покрыть черепа и блокировать доступ к интересующей области ткани. Преимущество прямого погружения черепа без покровным стеклом, чтобы получить доступ к более глубоких областей кости. Кроме того, поскольку череп не ровной поверхности, это не ограничивает область изображения на контакт поверхность между черепом и покровного стекла, что позволяет широкое поле изображения, как показано на рисунке 1.
Для всех технологий визуализации, выбор между скоростью сбора и качества разрешение составляет компромисс. Таким образом, количество и качество изображений на единицу времени ограничены, и выбор зависит от научной вопрос решать. Как правило, сосудистые моноциты быстро подвижного клеток, в то время как паренхиматозные моноциты медленно подвижные или сидячие. Тщательное отслеживание подвижного клеток требуется высокое разрешение времени приобретения, как показано на рисунке 2. Высокая скорость передачи изображения для сидячих клеток бесполезно и высокие X, Y, разрешение Z может быть предпочтительным для анализа протрузии деятельность дендритов, например. Быстрые клетки потребует толстый том, чтобы получить более длительный отслеживание их перемещения в г.
Средний квадрат смещения как функцию времени не предусмотрено программного обеспечения Imaris. Принципле этого представления на основе того факта, что, для объекта бегущей баллистически без столкновения или структурного сужения, что расстояние Пробег будет пропорциональна временной интервал (рис 2D). Таким образом, линейность склоне указывает на случайное блуждание в не ограниченных окружающей среды. В отличие от этого, асимптотическое форма кривой будет означать, ограниченного перемещения во времени в популяции клеток. Второе преимущество этого расчета является то, что скорость иногда завышены артефактного смещением центра масс. Это особенно важно для медленного подвижных клетки с протрузии активности. Таким образом, расчет коэффициента подвижности по наклону кривой, рассчитанной с помощью линейной регрессии указывает на реальное смещение времени 21 cellover.
Ly6G окрашивание в естественных условиях иллюстрирует возможность добавить новый параметр анализа в процессе визуализации (рис 3 др в прессе). Хотя более 98% нейтрофилов сосудистых правильно помечены, окрашивание нейтрофилов костного мозга менее эффективно, и средняя интенсивность флуоресценции сильно снижается, что свидетельствует снижение доступ антитела к паренхимы костного мозга (данные не показаны). Rhodamin декстран, квантовые точки, или другие специфические красители апоптоза или некроза клеток, таких как DAPI, йодид пропидия, Sytox 22 или флуоресцентные репортер клеточных функций, таких как производство активных форм кислорода 23, могут быть добавлены внутривенно через хвостовую вену при визуализации Процесс и дают хорошую возможность для количественной оценки функциональных свойств, таких как клеточной смерти, фагоцитоз и нейтрофилов внеклеточной ловушку. Мазо и др 12 прекрасно использовали два различных сосудистых красителис низкой и высокой молекулярной массой, чтобы лучше паренхимы контрастным и сосудистой. Выбор флуоресцентным красителем является критическим, чтобы позволить сопутствующей приобретение различных флуоресцентных репортеров. Действительно, длина волны возбуждения будет выбран соответственно, чтобы получить наилучший компромисс между всеми, используемых флуоресцентных красителей.
Протокол, используемый здесь, дает возможность проанализировать в естественных биологическую активность клеточного отсека, исследование которых было трудно до сих пор. Гистологический анализ тканей костного мозга, как правило, требует длительной подготовки костного декальцинации, чтобы тонкий срез, и это обеспечивает только статический вид ткани. Динамичный вид подчеркивает скорость обмена клеток между паренхимы и синусоиды костного мозга. Этот быстрый процесс важный шаг, чтобы расшифровать того, чтобы иметь лучшее понимание механизма мобилизации клеток на воспалительного сигнала 5 или предварительной подготовки myeloaplasive химиотерапиисхемы лечения 6. Мы сообщали событие клеток intravasation 6, но этот процесс является едва обнаруживаемой из-за низкой частоты в стационарном состоянии. Тем не менее, это, вероятно, будет повышена при воспалительных сигналов. Рецепторы хемокинов, таких как CCR2, CX3CR1 или CXCR4 высоко вовлечены в процесс intravasation, следовательно, использование генетического недействительными этих рецепторов следует предложить новые основные идеи в путях миграции клеток
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Анну Дарон и Пьер Луи Loyher за помощь в редактировании, Plateforme Imagerie Питье-Сальпетриер (PICPS) за помощь в двухфотонного микроскопа и животных фонда "НАК" и Камилла Baudesson для мышей животноводства помощь. Научных исследований, ведущих к этим результатам получил финансирование от Седьмой Рамочной Программы Европейского Сообщества (FP7 / 2007-2013) по договору безвозмездной N ° 304810 - RAID-массива, и N ° 241440-Endostem, от Inserm, из Университета Пьера и Марии Кюри "Появление ", из Лос-Анджелеса" Ligue CONTRE ле рака ", от" Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рак "от и до" Agence Nationale-де-ла-Recherche "Программа Появление 2012 (ANR-EMMA-050). PH была поддержана ля "Ligue CONTRE ле рака».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamin | Merial | 100 mg/ml, anesthetic | |
| Xylazin | Bayer HealthCare | 10 mg/ml, anesthetic | |
| Isofluran | Baxter | 2.5%, anesthetic | |
| O2/NO2 | 70/30 mixture, anesthetic | ||
| Rhodamin-Dextran | Invitrogen | 2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining | |
| Ly6G-PE | Becton-Dickinson | clone 1A8, neutrophils staining | |
| Stereotactic holder | Home made | surgery | |
| Ethanol 70% | surgery | ||
| Sterile scissors and nippers | surgery | ||
| Rubber ring | 18 mm diameter, surgery | ||
| Glubran 2 | Queryo Medical | Surgical Glue, rubber ring fixation | |
| Small gauge needles | Terumo | surgery | |
| Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope | Carl Zeiss | Microscope | |
| Ti:Sapphire crystal laser | Coherent Chameleon Ultra | 140 fsec pulses of NIR light | |
| Zen 2010 | Carl Zeiss | Acquistion Software | |
| Imaris Bitplane | Bitplane | Analysis Software, 3D automatic tracking | |
| PBS 1X | D. Dutscher | surgery | |
| Thermostated chamber | Carl Zeiss | intravital imaging |
References
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).
- Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death. J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).
- Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity. 19, 71-82 (2003).
- Robbins, C. S., Swirski, F. K. The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation. Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).
- Shi, C., et al. Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands. Immunity. 34, 590-601 (2011).
- Jacquelin, S., et al. CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice. Blood. 122, 674-683 (2013).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
- Charo, I. F., Ransohoff, R. M. The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation. N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).
- Milo, I., et al. Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow. 122, 193-208 (2013).
- Cavanagh, L. L., et al. Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells. Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).
- Mazo, I. B., et al. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells. Immunity. 22, 259-270 (2005).
- Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).
- Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. J Exp Med. 188, 465-474 (1998).
- Rashidi, N. M., et al. In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells. Blood. , (2014).
- Sipkins, D. A., et al. In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment. Nature. 435, 969-973 (2005).
- Cariappa, A., et al. Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes. Immunity. 23, 397-407 (2005).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).
- Yost, C. C., et al. Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates. Blood. 113, 6419-6427 (2009).
- Devi, S., et al. Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus. Nat Med. 19, 107-112 (2013).
