Dette manuskriptet beskriver påvisning av sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i den spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.
Post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), som fosforylering, metylering, acetylering, ubiquitinering, og sumoylation, regulere den cellulære funksjonen til mange proteiner. PTMs av kinetochore proteiner som assosierer med centromeric DNA megle trofast kromosom segregering for å opprettholde genom stabilitet. Biokjemiske metoder som massespektrometri og western blot analyse er mest brukt for identifisering av PTMs. Her blir en proteinrensemetode som er beskrevet som tillater påvisning av både sumoylation og ubiquitinering av kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80, i Saccharomyces cerevisiae. En stamme som uttrykker polyhistidin-Flag-merket Smt3 (HF-Smt3) og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80 ble bygget og brukt til våre studier. For påvisning av sumoylation, utviklet vi en protokoll til affinitetskromatografi rense His-tagget sumoylated proteiner ved hjelp av nikkel perler og brukes western blot analyse med anti-Myc antistoff for å påvise sumoylated Ndc10 ennd Ndc80. For påvisning av ubiquitinering, utviklet vi en protokoll for immunoprecipitation av Myc-merket proteiner og brukes western blot analyse med anti-Ub antistoff for å vise at Ndc10 og Ndc80 er ubiquitinmolekyler. Våre resultater viser at epitop tagget-protein av interesse for Hans-Flag merket Smt3 belastning letter påvisningen av flere PTMs. Fremtidige studier bør tillate utnyttelse av denne teknikken til å identifisere og karakterisere protein interaksjoner som er avhengig av en bestemt PTM.
Ubiquitinering og sumoylation tillater konjugering av ubiquitin og små Ubiquitin lignende modifikator (SUMO; Smt3 i S. cerevisiae 1) til et målprotein, respektivt. PTMs av kinetochore proteiner påvirker deres cellulære nivåer og protein-protein interaksjoner i ulike cellesyklusfaser for å sikre trofast kromosom segregering. For eksempel er cellulære nivåer av Cse4 / CENP-A og ytre kinetochore protein Dsn1 regulert av ubiquitin-formidlet proteolyse for å sikre stabilitet genom 2-5. Destabilisering av feil kinetochore-microtubule vedlegg krever Ipl1 / Aurora B kinase som fosforylerer Dam1 og Ndc80 komplekser som direkte samhandler med mikrotubuli 6-8. Til tross for identifisering av over sytti kinetochore proteiner, er det svært få studier som undersøker de modifikasjoner av disse proteinene med PTMs, f.eks ubiquitin og SUMO. En viktig begrensning er evnen til å bevare den PTMs under rensingen og mangelen på tilpassede antistoffer for påvisning av PTMs som sumoylation, fosforylering, metylering, og andre. Karakterisering av sumoylated kinetochore proteiner Ndc10, Cep3, Bir1, og Ndc80 benyttet en tilpasset antistoff 9. I tillegg har Ndc10 vært innblandet som et substrat for ubiquitinering 10. Menneskelig Hec1 (Ndc80 i S. cerevisiae) er også substrat for ubiquitinering, regulert av APC / C-hCdh1 E3 ligase 11. Derfor Ndc10 og Ndc80 er gode kandidater for optimalisering av protokollen for å oppdage både sumoylation og ubiquitinering i S. cerevisiae.
For å lette identifiseringen av sumoylation, bygget vi stammer som uttrykker HF-Smt3 og Myc-merket Ndc10 eller Ndc80. Bruken av epitope tags (HF: His6-Flag) minimerer bakgrunnen på grunn av kryssreaksjon som er hyppig observert i polyklonale serum reist mot en kandidat protein. Vi utviklet en protokoll for å affinitetskromatografirense HF-Smt3 konjugater og deretter brukes kommersielle anti-Flag og anti-myc antistoff for å oppdage tilstedeværelsen av sumolyated Ndc10 og Ndc80 i renset Smt3 preparatet. For ubiquitinering, utviklet vi en modifisert immunopresipitering protokoll som bevarer ubiquitinering av Myc-merkede kinetochore proteiner og utført western blot analyse med kommersiell anti-Ub antistoff for å påvise ubiquitinering av Ndc10 og Ndc80.
EPITOP koder som HA, Myc, flagg, og GST er mye brukt til biokjemisk analyse av proteiner. Bygging av stammer med HF-Smt3 og Myc-merket kinetochore proteiner, slik som Ndc10 og Ndc80, letter påvisningen av PTMs som sumoylation og ubiquitinering. HF-Smt3 trekke ned analysen tillater påvisning av sumoylated kinetochore proteiner, Ndc10 og Ndc80 (figur 1). Den affinitetsrensing protokollen og western blot analyse ved hjelp av anti-Flag antistoff etablere spesifisitet av samspillet mellom HF-Smt3 og målpr…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |