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Biology

Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Diese Handschrift beschreibt den Nachweis von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80, in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Post-translationale Modifikationen (PTMs), wie Phosphorylierung, Methylierung, Acetylierung, Ubiquitinierung und sumoylation, regulieren die zelluläre Funktion von vielen Proteinen. PTMs der Kinetochor-Proteinen, die mit Centromer-DNA assoziieren vermitteln treu Chromosomensegregation auf Genomstabilität zu gewährleisten. Biochemischen Ansätzen wie Massenspektrometrie und Western-Blot-Analyse werden am häufigsten für die Identifizierung von PTMs verwendet. Dabei wird ein Protein-Reinigungsverfahren beschrieben, das den Nachweis von sowohl sumoylation und Ubiquitinierung des kinetochore Proteinen Ndc10 und Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae ermöglicht. Ein Stamm, der zum Ausdruck bringt Polyhistidin-Flag-markierten Smt3 (HF-Smt3) und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 wurde gebaut und für unsere Studien verwendet. Für den Nachweis von Sumoylierung erarbeiteten wir ein Protokoll zur Affinitätsreinigung His-Tag sumoyliert Proteinen durch Verwendung von Nickel Perlen und verwendet Western Blot-Analyse mit Anti-Myc-Antikörper zu erkennen sumoyliert Ndc10 einnd Ndc80. Für den Nachweis von Ubiquitinierung, entwickelten wir ein Protokoll für die Immunpräzipitation von Myc-markierte Proteine ​​verwendet und Western-Blot-Analyse mit anti-Ub-Antikörper zeigen, dass Ndc10 und Ndc80 werden ubiquitinierten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Epitop-markiertes Protein von Interesse in der His-Flag markiert Smt3 Stamm erleichtert den Nachweis mehrerer PTMs. Künftige Studien ermöglichen sollten Ausnutzung dieser Technik zur Identifizierung und Charakterisierung Protein-Wechselwirkungen, die abhängig von einem bestimmten PTM sind.

Introduction

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Ubiquitinierung und sumoylation ermöglicht die Konjugation von Ubiquitin and Small Ubiquitin-like Modifier (SUMO; Smt3 in S. cerevisiae 1) an ein Zielprotein auf. PTMs der Kinetochor-Proteinen beeinflussen ihre zellulären Ebenen und Protein-Protein-Interaktionen in verschiedenen Zellzyklusphasen treu Chromosomensegregation zu gewährleisten. Beispielsweise sind Zellebenen Cse4 / CENP-A und äußeren Kinetochorenprotein DSN1 durch Ubiquitin-vermittelte Proteolyse zur Sicherstellung Genomstabilität 2-5 geregelt. Destabilisierung der falsche Kinetochor-Mikrotubuli-Anhänge erfordert die Ipl1 / Aurora B-Kinase, die Dam1 und Ndc80 Komplexe, die direkt mit den Mikrotubuli interagieren 6-8 phosphoryliert. Obwohl die Identifizierung von mehr als siebzig kinetochore Proteinen gibt es sehr wenige Untersuchungen, die die Modifikationen dieser Proteine ​​mit PTMs zB Ubiquitin und SUMO untersuchen. Eine wichtige Einschränkung ist die Fähigkeit, die PTM zu bewahrens während der Reinigung und dem Mangel an individuelle Antikörper zum Nachweis von PTMs wie sumoylation, Phosphorylierung, Methylierung, und andere. Charakterisierung von sumoyliert Kinetochor-Proteinen Ndc10, Cep3, genutzt Bir1 und Ndc80 eine benutzerdefinierte Antikörpers 9. Zusätzlich hat Ndc10 als Substrat für Ubiquitinierung 10 in Verbindung gebracht. Menschliche Hec1 (Ndc80 in S. cerevisiae) wird auch für die Ubiquitinierung Substrat durch APC / C-hCdh1 E3-Ligase 11 geregelt. Daher Ndc10 und Ndc80 sind gute Kandidaten für die Optimierung des Protokolls sowohl sumoylation und Ubiquitinierung in S. erkennen cerevisiae.

Um die Identifizierung von Sumoylierung zu erleichtern, konstruierten wir Stämme, die HF-Smt3 und Myc-tagged Ndc10 oder Ndc80 auszudrücken. Die Verwendung von Epitop-Tags (HF: His6-Flag) minimiert den Hintergrund aufgrund von Kreuzreaktivität, die häufig in polyklonales Serum gegen einen Kandidaten-Protein erzeugt wurden beobachtet. Wir entwickelten ein Protokoll zur Affinitätsreinigen HF-Smt3 Konjugate und dann verwendet kommerziellen anti-Flag und Anti-Myc-Antikörper, die Anwesenheit von sumolyated Ndc10 und Ndc80 im gereinigten Präparat Smt3 detektieren. Für Ubiquitinierung, entwickelten wir eine modifizierte Immunpräzipitationsprotokoll die Ubiquitinierung des Myc-tagged Kinetochor-Proteinen konserviert und Western Blot-Analyse durchgeführt, mit kommerziellen anti-Ub-Antikörper gegen Ubiquitinierung von Ndc10 und Ndc80 zu erkennen.

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Protocol

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1. Wachstum von Hefezellen,

  1. Inokulieren Hefezellen in 30 ml YPD (Tabelle 1) in einem kleinen Kolben. Inkubation bei 30 ° C über Nacht unter Schütteln.
  2. Verdünne die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 0,2 bei 600 nm (OD 600 = 0,2) in 50 ml YPD und Inkubieren bei 30 ° C unter Schütteln inkubiert.
  3. Die Kultur auf eine optische Dichte von 1,0 bei 600 nm (OD 600 = 1,0).
  4. Centrifuge Zellen für 5 min bei 2.000 xg und den Überstand verwerfen.
  5. Zellpellet in 40 ml sterilem Wasser und Zentrifuge für 5 min bei 2.000 xg, um die Zellen zu waschen. Überstand verwerfen und speichern Sie das Zellpellet bei -20 ° C.

2. Extraktion von Proteinen

  1. Die Zellen in 0,5 ml eiskaltem Guanidinpuffer (Tabelle 1) für die Pull-Down-Assay unter Verwendung von Ni-NTA-Superflow Perlen oder Puffer A (Tabelle 1) für die Immunfällung. Halten Röhrchen auf Eis zu allen Zeiten.
  2. Transfer zu 2 ml Schraubverschluss Röhrchen.
  3. In die gleiche Menge Glasperlen (Table of Materials).
  4. Bead-schlagen, die Zellen in einem Mini Bead Beater (Table of Materials) für 2 Minuten bei Raumtemperatur, dann auf Eis legen für 2-3 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
  5. Wirbel mit hoher Geschwindigkeit bei 4 ° C für 30-60 min. Überprüfen Sie die Zellen durch Visualisierung unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, daß die Zellen lysiert.
    Hinweis: lysierten Zellen werden als dunkle Geister erscheinen und es fehlt ihnen eine Grenze oder definierte Form. In optimaler Weise mindestens 80% der Zellen lysiert werden sollte.
  6. Punktion ein Loch in den Boden des Röhrchens mit einem Push-Pin und Ort in einer Sammlung enthalten 15 ml konischen Rohr (Schraubdeckel sollte locker sein).
  7. Zentrifuge bei 1000 × g für 1 min, um das Lysat zu sammeln.
  8. Transfer des Lysats auf einem Mikrozentrifugenröhrchen.
  9. Zentrifuge bei 15.000 g für 30 min bei 4 ° C, um die extrahierten Proteine ​​zu sammeln.
  10. Messung der Konzentration der extrahierten Proteine ​​mit dem Protein assay Kit (Table of Materials) und normalisieren extrakte, um die gleiche Menge an Protein enthalten. Bringen des Gesamtvolumens auf 1 ml mit einem geeigneten Puffer.
    Anmerkung: Etwa 5 mg Gesamtprotein aus 50 OD 600-Zellen erhalten.
  11. Sparen Sie 50 ul (250 ug Protein, wenn das Gesamtprotein aus Schritt 2.10 extrahiert ist 5 mg) als Gesamtzellextrakt (WCE). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer (Tabelle 1) und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse).

3. Reinigung von HF-Smt3 Konjugate

  1. Besorgen Sie sich die Ni-NTA-Superflow-Perlen (Table of Materials) für die Versuche (100 & mgr; l Kügelchen pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) für 1 min notwendig. Entfernen Sie den Überstand.
  2. Wash Perlen 5x mit 1 ml PBS (Table of Materials): Invert top-Über-unten, bis die Kügelchen wieder suspendiert werden, sammeln Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand.
  3. Aussetzen Kügelchen in 1 ml Guanidin-Puffer (Tabelle 1) und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammle Perlen durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand. Mischen Sie die Perlen auch durch Umdrehen über top-bottom.
    Hinweis: Mischen Sie Perlen gut durch Umkehren oben über Boden.
  4. Für jede Probe wird mit 950 & mgr; l der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 100 ul Ni-NTA Superflow Beads.
  5. Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C für mindestens 4 Stunden oder über Nacht.
  6. Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C.
  7. Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Last 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-anallyse).
  8. Wasch Kügelchen einmal mit 1 ml Guanidin-Puffer für 5-10 min auf einer Schwingplattform.
  9. Wash Perlen 5x mit 1 ml Aufbruchpuffer (Tabelle 1) für 5-10 min auf einem Wippschüttler.
  10. Resuspendieren Perlen in 90 ul 2x Laemmli-Probenpuffer.
  11. Zugabe von 10 ul 1 M Imidazol.
    Hinweis: Imidazol hilft, die His-Tag-Protein aus der Ni-NTA-Perlen aufgrund konkurrierender Wechselwirkungen zwischen Imidazol und die Perlen zu distanzieren.
  12. Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min.
  13. Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen.
  14. Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse).
    Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet.

4. Immunpräzipitation von Myc-markierten Proteine ​​Kinetochor

  1. Erhalten anti-c-Myc Agarose Affinitätsgel eintibody (Table of Materials) für die Versuche (25 ul Harz pro Probe) durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit (800-1500 xg) notwendig. Entfernen Sie den Überstand.
  2. Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand.
  3. Aussetzen Harz in 1 ml Puffer A und aliquotiert sie in der Anzahl der Rohre entsprechenden Proben zu verarbeiten. Sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand.
    Hinweis: Mischen Sie das Harz auch durch Umkehren Top-über-Boden.
  4. Add 950 ul der verbleibenden WCE (aus Schritt 2.11: Extraktion der Proteine) zu 25 & mgr; l des Harzes.
  5. Inkubieren auf einer Schüttelplattform bei 4 ° C über Nacht.
  6. Zentrifuge bei 800-1500 x g für 1 Minute bei 4 ° C.
  7. Sparen Sie 50 ul als Überstand (SUP). Dann werden 50 ul 2x Laemmli Probenpuffer und Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min. Load 10 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse).
  8. Wash Harz 5x mit 1 ml Puffer A: Invert Top-über-Boden, bis das Harz suspendiert, sammeln Harz durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit, und entfernen Sie den Überstand.
  9. Resuspendieren des Harzes in 100 ul SUMEB Probenpuffer (Tabelle 1).
    Hinweis: SUMEB Probenpuffer enthält 8 M Harnstoff und 1% SDS (starke Denaturierung Bedingung).
  10. Inkubation bei 100 ° C in einem Heizblock für 3-5 min.
  11. Vortex, dann bei 13.000 xg zentrifugieren für 30 Sekunden. Den Überstand in ein frisches Röhrchen.
  12. Last 10-20 ul jeder Probe in einem SDS-PAGE-Gel für Western Blot-Analyse (Abschnitt 5: Western-Blot-Analyse).
    Anmerkung: 10-20 ul entspricht 0,5-1,0 mg Eingang, wenn 5 mg WCE verwendet.

5. Western Blot-Analyse

  1. Laden Sie die Proteinextrakte auf 4-12% Bis-Tris-Gelen (Table of Materials) und perform Elektrophorese bei 120 V für 90 Minuten (Laufpuffer: Table of Materials).
  2. Übertragen Sie die Proteine ​​aus Gel auf eine Nitrocellulosemembran (Table of Materials) mit einem Übertragungsgerät bei 30 V für 90 min (Transfer-Puffer: Table of Materials).
  3. Blockieren die Membran in 5% Milch / 1x TBST (Tabelle 1) für 1 h bei Raumtemperatur.
  4. Inkubieren Membran mit dem primären Antikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST über Nacht bei 4 ° C. Für primäre Antikörper, verwenden Sie eine Verdünnung von 1: 1000 (Anti-Flag und Anti-Ub-Antikörper) oder 1: 5000 (Anti-Myc-Antikörper).
  5. Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x.
  6. Inkubieren Membran mit Sekundärantikörper (Table of Materials) in 5% Milch / 1x TBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Verwenden Sie eine 1: 5000 Verdünnung des sekundären Antikörper.
  7. Für jeweils 10 min mit 1x TBST waschen Membran 3x.
  8. Inkubieren Membran mit ECL working-Lösung (Table of Materials) für 5 min.
  9. Setzen Sie die Membran auf blauempfindlichen Röntgenfilm (Table of Materials) und die Entwicklung unter Verwendung einer automatischen Entwickler (Table of Materials).

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Representative Results

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Zu sumoylation von kinetochore Proteine ​​Ndc80 und Ndc10 detektieren Stämme mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​(Ndc80 oder Ndc10) konstruiert (Tabelle 2), wie zuvor beschrieben, 9,12. HF-Smt3 Konjugate wurden Affinität mit Ni-NTA-Perlen gereinigt. Western Blot-Analyse von gereinigtem HF-Smt3 mit einem Anti-Flag-Antikörper erlaubt Detektion sumoylierten Formen SUMO Substrate, die in dem Kontrollstamm ohne HF-Smt3 (1A und 1B, linkes Feld) abwesend waren. Wie erwartet, wurden mehrere Formen der SUMO Substrate in der HF-Smt3 Belastung festgestellt. Wir als nächstes bestimmt, ob Ndc80 und Ndc10 in den gereinigten HF-Smt3 Konjugat indem Western-Blot Analyse unter Verwendung eines anti-Myc-Antikörper vorhanden sind. Mehrere Bands, die ein höheres Molekulargewicht als die der Ndc80 oder Ndc10 waren eindeutig nachgewiesen (1A und 1B, rechts). Darüber hinaus mehrere Bänder sowohl Ndc80 und Ndc10wurden in Nocodazol behandelten Zellen (1C und 1D) reduziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Proteinreinigung und Western-Blot-Analyse hier beschrieben ermöglicht den Nachweis der Sumoylierung Ndc80 und Ndc10, wie zuvor beschrieben, 9.

Zu Ubiquitinierung Ndc80 und Ndc10 detektieren Myc-markierten Ndc80 oder Ndc10 wurde immunpräzipitiert (IP) und Western-Blot-Analyse wurde mit Anti-Myc und Anti-Ub-Antikörper (Figur 2) durchgeführt. Analyse von Gesamtzellextrakten (WCE) und Überstand (SUP) bestätigt die Expression von Ndc80-Myc und Ndc10-Myc (2A). Die niedermolekularen Banden auf dem WCE können Abbauprodukte darstellen. IP-Proben mit anti-Myc sondiert zeigte mehrere Bands mit hohem Molekulargewicht, was darauf hindeutet, dass Ndc80 und Ndc10 enthalten PTMs. A laddering Muster der IP Proben mit anti-Ub-Antikörper untersucht und gezeigt, dass Ndc80 Ndc10 werden ubiquitinierten (2A, α-Ub). Die Laufmaschen Muster Ndc80 und Ndc10 wurden durch Behandlung mit Proteasom-Inhibitor (MG132) (2B, α-Ub) verbessert wird, eine weitere Bestätigung, daß diese Banden repräsentieren Poly- ubiqutination. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass sowohl Ndc80 und Ndc10 Substrate für Sumoylierung und Ubiquitinierung in S. cerevisiae und daß die beschriebenen Proteinreinigungsverfahren sind nützlich für den Nachweis von PTMs wie sumoylation und Ubiquitinierung. Nach unserem Wissen ist dies der erste Bericht, dass in Ndc80 S. cerevisiae ist ein Substrat für Ubiquitinierung, obwohl Ubiquitin-vermittelte Proteolyse des humanen Homolog Hec1 zuvor veröffentlicht am 11. worden.

Abbildung 1
Abbildung 1: Reinigung von sumolyated Substrate ermöglicht die Identifizierung von Proteinen kinetochore Ndc80 und Ndc10 als SUMO Substrate Pr.oteins wurden extrahiert und HF-Smt3 Konjugate wurden hergestellt und nach der SDS-PAGE-Trennung durch Western-Blot-Analyse analysiert. (A und B) und Ndc80 Ndc10 werden sumoyliert. Proteine ​​wurden aus logarithmisch wachsenden Zellen in YPD extrahiert. Linkes Bild: Total SUMO-Substrate wurden mit einem anti-Flag-Antikörper nachgewiesen. Rechts: sumoylierten Ndc80 oder Ndc10 wurde in den HF-Smt3 Konjugate detektiert, wenn sie mit einem Anti-Myc-Antikörper untersucht. (C und D) Sumoylierung von Ndc80 und Ndc10 in Nocodazol behandelten Zellen reduziert. (-) Logarithmisch wachsenden Zellen in YPD wurden mit DMSO behandelt oder DMSO + 20 & mgr; g / ml Nocodazol (+) für 2 Stunden bei 30 ° C. HF-Smt3 Konjugate wurden durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-Myc-Antikörper untersucht. Isogenen Hefestämme verwendet werden (A und C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) und (B und D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figur 2
Fig. 2: Ubiquitinierung von Proteinen kinetochore Ndc80 und Ndc10 Extraktion des Proteins und die Immunpräzipitation erfolgten wie in dem Protokoll beschrieben sind. (A) und Ndc80 Ndc10 werden ubiquitinierten. Proteine ​​wurden aus logarithmisch wachsenden Zellen in YPD extrahiert. Gesamtzellextrakt (WCE), Überstand (SUP) und die immunpräzipitiert (IP) Fraktionen wurden einer SDS-PAGE unterzogen. Western-Blots wurden verwendet, um Myc-markiertem und ubiquitinierten Proteine ​​mit Anti-Myc und Anti-Ub-Antikörper nachzuweisen sind. (B) Ubiquitinierung von Ndc80 und Ndc10 wird in Zellen mit Proteasom-Inhibitor MG132 behandelt verbessert. Logarithmisch wachsenden Zellen in YPD wurden mit DMSO behandelt (-) oder DMSO + 50 uM MG132 (+) in Gegenwart von 0,003% SDS für 3 Stunden bei 30 ° C, wie zuvor beschrieben 13

Lösung Components
YPD 1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Pepton, 2% Glucose
Guanidinpuffer 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M Guanidiniumchlorid, 0,5 M NaCl
Puffer A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,2% Triton X-100, 1x Proteaseinhibitoren
Bruchpuffer 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 20% Glycerin, 1 mM PMSF
SUMEB Probenpuffer 1% SDS, 8 M Harnstoff, 10 mM MOPS pH 6,8, 10 mM EDTA, 0,01% Bromphenolblau
2x Laemmli-Probenpuffer 100 mM Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% Glycerin, 0,2% Bromphenolblau (Vor der Verwendung: in b-Mercaptoethanol (BME) zu einer Endkonzentration von 200 mM)
1x TBST 137 mM Natriumchlorid, 20 mM Tris-Hcl pH 7,5, 0,1% Tween-20

Tabelle 1: Solutions.

Tabelle 2. Hefestämme in dieser Studie * verwendet.
Stämme Elternteil Genotyp Hinweis
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Open Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Open Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Diese Studie
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Petit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Petit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 Ndc80-Myc :: His3MX6 Diese Studie
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 ura3 trp1 lys2 HF-SMT3 :: LEU2 NDC10-Myc :: kanMX6 Diese Studie
* Alle Hefestämme von Saccharomyces cerevisiae S288C abgeleitet.
Tabelle 2: Hefestämme in dieser Studie verwendet.

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Discussion

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Epitop-Tags, wie HA, Myc, Flagge, und GST sind weit verbreitet für die biochemische Analyse von Proteinen verwendet. Konstruktion von Stämmen mit HF-Smt3 und Myc-markierten kinetochore Proteine ​​wie Ndc10 und Ndc80, erleichtert den Nachweis von PTMs wie sumoylation und Ubiquitinierung. HF-Smt3 Pulldown Assay erlaubt den Nachweis von sumoyliert Kinetochor-Proteinen, Ndc10 und Ndc80 (Abbildung 1). Der Affinitätsreinigungsprotokoll und Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Flag-Antikörper stellen die Spezifität der Wechselwirkung zwischen HF-Smt3 und Zielproteine, modifizierte Proteine ​​nicht in dem Kontrollstamm ohne HF-Smt3 detektiert. Die Verwendung des Myc-Tag auf den Proteinsubstraten bestätigt die Anwesenheit von sumoylierten Ndc10 und Ndc80 in den HF-Smt3 Konjugate. Weiterhin wurde die Sumoylierung von sowohl Ndc10 und Ndc80 in Nocodazol behandelten Zellen (1C und 1D) reduziert. Verringert Sumoylierung von Ndc10 in Reaktion auf Nocodazol treatment, aber nicht Ndc80, wurde zuvor von Mont et al. 9 angegeben. Dies kann aufgrund von Unterschieden in Versuchsprotokoll und die Verwendung eines speziellen Anti-SUMO Antikörper sein. Unsere Ergebnisse für Sumoylierung von Kinetochor Substrate lassen vermuten, dass ein ähnliches Protokoll kann verwendet werden, um andere Kandidaten SUMO Substrate zu untersuchen.

Ubiquitiniert nachzuweisen, wurden Myc-markierten Proteine ​​kinetochore ersten immunpräzipitiert und die IP-Fraktionen wurden mit anti-Ub-Antikörper (Figur 2) untersucht. Die Laufmaschen Muster Ndc10 und Ndc80 erhöht wurde, wenn die Zellen mit MG132 um Proteasomenfunktion (2B) zu inhibieren, was darauf hinweist, dass diese Proteine ​​sind Substrate des Proteasoms. Die IP-Fraktionen konnte Sumoylierung von Ndc10 oder Ndc80 in Western Blot-Analyse mit Anti-Flag oder anti-Smt3 Antikörper nachzuweisen (Daten nicht gezeigt). Dies kann aus technischen Gründen, wie beispielsweise Ebenen sumoylierten Substrat in der IP-Fraktion oder der interference von den Epitop-Tags. Eine weitere Optimierung der IP-Protokoll, wie Konzentration von Salzen und Western-Blotting Bedingungen sollte der Nachweis mehrerer PTMs jedes Protein von Interesse zu erleichtern. Derzeit wird Sumoylierung am besten durch die HF-Smt3 erkannt Pulldown Assay gefolgt von Western-Blots der Beitritts SUMO-Substrate (Abbildung 1).

Einige Details, die die Wirksamkeit der Proteinreinigung und die Möglichkeit, das PTMs detektieren. Erstens müssen alle Röhrchen auf Eis gehalten werden, um die Proteasen zu hemmen, außer wie angegeben. Zweitens wird ein 1: 1-Verhältnis der Zellsuspension auf Glasperlen ist kritisch, um die Zellen von der Sicke beater und / oder Vortexer stören. Zelllyse sollte durch Untersuchung der Zellen unter dem Mikroskop beobachtet werden. Drittens ist es sehr wichtig, um eine geklärte Lysat für den Pull-down-Assays oder IP herzustellen. Short oder Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit kann, um eine Kontamination von Zelltrümmern im Lysat beitragen und dies beeinflusst die Fähigkeit, DeTect die PTMs. Schließlich kräftiges Schütteln der Kugeln mit einem großen Volumen von klaren Lysat (etwa 1 ml) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen sorgt dafür, dass die Perlen sind komplett für den Pull-Down-Assay oder IPs suspendiert. Zusammengefasst Proteinreinigung und Nachweistechniken, wie die hier beschriebene wichtige Einblicke in den Mechanismus, wie der PTM kinetochore Proteine ​​beeinflussen ihrer Struktur und Anordnung für treue Chromosomensegregation 14, 15.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

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References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
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Protein Purification Technik, die Erkennung von Sumoylierung und Ubiquitinierung von Bäckerhefe Kinetochor Proteine ​​Ndc10 und Ndc80 Erlaubt
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Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

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