Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Эта рукопись описывает обнаружение SUMOylation и убиквитинирование кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE.

Abstract

Посттрансляционных модификаций (PTMs), такие как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, убиквитинирования и SUMOylation, регулируют клеточную функцию многих белков. PTMs из кинетохорных белков, которые связывают с центромерной ДНК посредником верный сегрегации хромосом для поддержания стабильности генома. Биохимические подходы, такие как масс-спектрометрии и западной блот-анализа наиболее часто используется для идентификации PTMs. Здесь способ очистки белка описано, что позволяет обнаруживать как SUMOylation и убиквитинирования из кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в Saccharomyces CEREVISIAE. Штамм, который выражает полигистидином Флаг-тегами Smt3 (ВЧ-Smt3) и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80 был построен и используется для наших исследований. Для обнаружения SUMOylation, мы разработали протокол аффинной очистки His-меткой sumoylated белки с помощью никелевых шарики и используется Вестерн-блоттинга с анти-Myc антитела для выявления sumoylated Ndc10 Aй Ndc80. Для обнаружения убиквитинирования, мы разработали протокол для иммунопреципитации Мус-меченных белков и используется Вестерн-блоттинга с анти-Ub антитела, чтобы показать, что Ndc10 и Ndc80 которые убиквитинируется. Наши результаты показывают, что эпитоп тегами интерес белок в Его-Flag помечены штамм Smt3 облегчает обнаружение нескольких PTMs. Будущие исследования должны позволить эксплуатации этой техники, чтобы определить и охарактеризовать белковые взаимодействия, которые зависят от конкретного ПТМ.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Убиквитинирование и сумоилирования позволяют сопряжение убиквитином и Малый Убиквитин-как модификатора (SUMO; Smt3 в S.cerevisiae, 1) к белку-мишени, соответственно. PTMs из кинетохорных белков влияют на их клеточном уровнях и белок-белковых взаимодействий на различных этапах клеточного цикла, чтобы обеспечить точное сегрегации хромосом. Например, сотовые уровни Cse4 / CENP-A и внешний белка кинетохор Dsn1 регулируются убиквитин-опосредованной протеолиза для обеспечения стабильности генома 2-5. Дестабилизация неправильных кинетохорных микротрубочек вложений требует B киназы Ipl1 / Aurora, который фосфорилирует Dam1 и Ndc80 комплексы, которые непосредственно взаимодействуют с микротрубочками 6-8. Несмотря на выявление более семидесяти кинетохорных белков, существует очень мало исследований, которые исследуют изменения этих белков с PTMs, например, убиквитином и сумо. Основным ограничением является способность сохранять PTMс во время очистки и нехваткой таможенных антител для обнаружения PTMs, таких как SUMOylation, фосфорилирования, метилирования, и другие. Характеристика sumoylated кинетохорных белков Ndc10, Cep3, Bir1 и Ndc80 используется пользовательский антитела 9. Кроме того, Ndc10 был вовлечен в качестве субстрата для убиквитинирования 10. Человек Hec1 (Ndc80 в S.cerevisiae,) также субстратом для убиквитинирования, регулируется APC / C-hCdh1 E3 лигазы 11. Таким образом, Ndc10 и Ndc80 являются хорошими кандидатами для оптимизации протокола для выявления как SUMOylation и убиквитинирование в S. Cerevisiae.

Для облегчения идентификации SUMOylation, мы построили штаммов, которые выражают HF-Smt3 и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80. Использование эпитопные метки (HF: His6-Flag) сводит к минимуму фон из-за перекрестной реактивности, что часто наблюдается в поликлональной сывороткой, выработанном против белок-кандидат. Мы разработали протокол к близостиочистить ВЧ-Smt3 конъюгатов, а затем использовали коммерческий анти-Flag и анти-Myc антитела для обнаружения присутствия sumolyated Ndc10 и Ndc80 в очищенный препарат Smt3. Для убиквитинирования, мы разработали модифицированный протокол иммунопреципитации, который сохраняет убиквитинирование из Мус-меченых белков кинетохорных и осуществляется вестерн-блот анализ с коммерческой анти-Ub антитела для выявления убиквитинирование Ndc10 и Ndc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Рост клеток дрожжей

  1. Посев клеток дрожжей в 30 мл YPD (таблица 1) в небольшую колбу. Выдержите на 30 ° С в течение ночи при встряхивании.
  2. Развести клетки к оптической плотности 0,2 при 600 нм (OD 600 = 0,2) в 50 мл YPD и инкубируют при 30 ° C при встряхивании.
  3. Выращивают культуру до оптической плотности 1,0 при 600 нм (OD 600 = 1,0).
  4. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 2000 мкг и отбросить супернатант.
  5. Ресуспендируют осадок клеток в 40 мл стерильной воды и центрифуги в течение 5 мин при 2000 мкг мыть клетки. Жидкость над осадком сливают и хранят осадок клеток при -20 ° С.

2. Добыча белков

  1. Ресуспендируют клеток в 0,5 мл охлажденного льдом буфера гуанидина (таблица 1) для выпадающего анализе с использованием Ni-NTA Superflow шарики или буфер А (таблица 1) для иммунопреципитации. Держите труб на льду во все времена.
  2. Трансфер до 2 мл винтовой крышкой трубки.
  3. Добавить такой же объем стеклянных шариков (Таблица материалов).
  4. Бисера-бить клеток в мини борта колотушки (табл материалов) в течение 2 мин при комнатной температуре, затем поместить на льду в течение 2-3 мин. Повторите это три раза.
  5. Вихревой на высокой скорости при 4 ° С в течение 30-60 мин. Проверка клетки от визуализации под микроскопом, чтобы гарантировать, что клетки лизируют.
    Примечание: лизированных клеток будет выглядеть как темные призраки и отсутствие границу или определенную форму. Оптимально, по меньшей мере 80% клеток должны быть лизированы.
  6. Прокол отверстие в нижней части трубы с помощью канцелярской кнопки и место в коллекции 15 мл коническую трубку (винтовая крышка должна быть свободной).
  7. Центрифуга при 1000 х г в течение 1 мин, чтобы собрать лизата.
  8. Передача лизата в микро трубки центрифуги.
  9. Центрифуга при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для сбора извлеченные белки.
  10. Измерить концентрацию извлеченных белков с использованием белка ASSAу комплект (Таблица материалов) и нормализуют все экстракты содержат одинаковое количество белка. Довести общий объем до 1 мл соответствующего буфера.
    Примечание: Около 5 мг общего белка получают из 50 OD 600 клеток.
  11. Сохранить 50 мкл (250 мкг белка, если общий белок экстрагируют из шаг 2.10 составляет 5 мг) в виде экстракта цельных клеток (WCE). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца (Таблица 1) и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).

3. Очистка ВЧ-Smt3 конъюгатов

  1. Получите Superflow бусы Ni-NTA (табл материалов), необходимых для экспериментов (100 мкл из бисера на пробу) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 мкг в) в течение 1 мин. Удалить супернатант.
  2. Бисер Вымойте 5x 1 мл PBS (табл материалов): Обратить топ-over-Нижняя, пока шарики не ресуспендировали, собирать шарики от низкой скорости центрифугирования и удаления супернатанта.
  3. Приостановка бусины в 1 мл буфера гуанидина (Таблица 1) и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Соберите бусы низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант. Смешайте бисер также путем обращения топ-над нижней.
    Примечание: Смешайте бисер также путем обращения топ-над дном.
  4. Для каждого образца, добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 100 мкл Ni-NTA Superflow бисера.
  5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение по меньшей мере 4 ч или в течение ночи.
  6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
  7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Нагрузка 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (раздел 5: Вестерн-блот анальныйлиз).
  8. Бусины Промывают один раз 1 мл буфера гуанидина в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
  9. Бусины Wash 5x 1 мл буфера нарушение (таблица 1) в течение 5-10 мин на качающейся платформе.
  10. Ресуспендируют бусины в 90 мкл 2x буфера Лэммли образца.
  11. Добавьте 10 мкл 1 М имидазола.
    Примечание: Имидазол помогает отделить Его-меченый белок из бисера Ni-NTA-за конкурирующего взаимодействия между имидазола и бисером.
  12. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
  13. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
  14. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

4. Иммунопреципитация Мус-меченых белков кинетохор

  1. Получить анти-с-Myc агарозном геле сродства апtibody (табл материалов), необходимых для экспериментов (25 мкл смолы на образце) по низкоскоростным центрифугированием (800-1500 XG). Удалить супернатант.
  2. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
  3. Приостановка смолы в 1 мл буфера А и аликвоту их в количестве труб, соответствующих образцов, подлежащих обработке. Сбор смолы с низкой скоростью центрифугирования и удаления супернатанта.
    Примечание: Смешайте смолу и обращением топ-над-дно.
  4. Добавить 950 мкл оставшейся WCE (с шага 2.11: экстракция белков) в 25 мкл смолы.
  5. Инкубировать на платформе-качалке при 4 ° С в течение ночи.
  6. Центрифуга при 800-1500 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
  7. Сохранить 50 мкл супернатанта в качестве (SUP). Добавить 50 мкл 2x буфера Лэммли образца и инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин. Вотобъявления по 10 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
  8. Мойка смолы 5x 1 мл буфера А: Инверсия верхнего над дном до смолу повторно суспендируют, собирают смолу низкоскоростным центрифугированием, и удалить супернатант.
  9. Ресуспендируют смолы в 100 мкл образца буфера SUMEB (Таблица 1).
    Примечание: образец SUMEB буфер содержит 8 M мочевину и 1% SDS (сильное условие денатурации).
  10. Инкубируют при 100 ° С в нагревательный блок в течение 3-5 мин.
  11. Вихрь, затем центрифуги при 13000 мкг в течение 30 сек. Передача супернатант в новую пробирку.
  12. Нагрузка 10-20 мкл каждого образца в геле SDS-PAGE для вестерн-блот анализа (Раздел 5: Вестерн-блот-анализа).
    Примечание: 10-20 мкл соответствует 0,5-1,0 мг ввода, если 5 мг ЗЦЕ используется.

5. Вестерн-блот анализ

  1. Загрузите белковых экстрактов на 4-12% Бис-Трис гели (табл материалов) и перфорацияORM электрофорез при 120 V в течение 90 мин (Запуск буфер: Таблица материалов).
  2. Передача белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану (табл материалов) с использованием аппарата переноса при 30 В в течение 90 мин (буфер передачи: Таблица материалов).
  3. Блок мембраны в 5% молоке / TBST 1x (Table1) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте мембрану с первичными антителами (таблица материалов) в 5% молоке / TBST 1x в течение ночи при 4 ° C. Для первичных антител, использовать разведение 1: 1000 (анти-Flag и анти-UB антитела) или 1: 5000 (анти-Мус антител).
  5. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
  6. Инкубируйте мембраны с вторичным антителом (таблица материалов) в 5% молока / 1x TBST в течение 1 часа при комнатной температуре. Используйте в разведении 1: 5000 вторичных антител.
  7. Вымойте мембраны 3 раза в течение 10 мин каждого с 1x TBST.
  8. Выдержите мембраны с ECL WorkiРаствор нг (табл материалов) в течение 5 мин.
  9. Expose мембрану к синему чувствительной рентгеновской пленки (табл материалов) и развивать с помощью автоматического разработчика (табл материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Для обнаружения SUMOylation из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10, штаммы с ВЧ-Smt3 и Мус-меченых белков кинетохорных (Ndc80 или Ndc10) были построены (таблица 2), как описано ранее 9,12. ВЧ-Smt3 конъюгаты очищали с использованием аффинной бусы Ni-NTA. Вестерн-блот-анализ очищенного HF-Smt3 с анти-Flag антител позволило обнаружения sumoylated форм SUMO субстратов, которые отсутствовали в контрольном штамме без ВЧ-Smt3 (фиг.1А и 1В, левая панель). Как и ожидалось, несколько форм сумо субстратов были обнаружены в штамме ВЧ-Smt3. Затем мы определяли при Ndc80 и Ndc10 присутствуют в очищенной ВЧ-Smt3 конъюгата, делая Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Myc. Несколько групп, которые были более высокой молекулярной массой, чем у Ndc80 или Ndc10 были четко обнаружить (фиг.1А и 1В, справа). Кроме того, несколько полос как Ndc80 и Ndc10были снижены в клетках, обработанных нокодазолом (рис 1с и 1d). Эти результаты показывают, что очистка белка и вестерн-блот анализ, описанный здесь позволяет обнаруживать SUMOylation из Ndc80 и Ndc10, как описано выше 9.

Для обнаружения убиквитинирование Ndc80 и Ndc10, Мус-меченый Ndc80 или Ndc10 иммунопреципитировали (IP) и Вестерн-блоттинга выполняли с анти-Myc и анти-UB антитела (рис 2). Анализ цельных клеточных экстрактов (WCE) и супернатант (ИСП) подтвердил экспрессию Ndc80-Myc и Ndc10-Myc (2А). Нижние молекулярные полосы вес на ЗЦЕ может представлять продукты распада. Образцы IP испытанные с анти-Myc показала множественные высокие полосы молекулярным весом, предполагая, что Ndc80 и Ndc10 содержать PTMs. Лэддеринг шаблон образцов исследуемых IP анти-Ub антитела показали, что Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется (2А, α-UB), Лэддеринг модель Ndc80 и Ndc10 были расширены путем обработки ингибитором протеасом MG132 () (рис 2B, α-UB), далее, подтверждающие, что эти полосы представляют поли-ubiqutination. Представительные результаты показывают, что оба Ndc80 и Ndc10 являются субстратами для SUMOylation и убиквитинирования в S. CEREVISIAE и что описанные способы очистки белка можно использовать для обнаружения PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. По нашей информации, это первый доклад, что Ndc80 в S. CEREVISIAE является субстратом для убиквитинирования, хотя убиквитин опосредованного протеолиза человеческого гомолога Hec1 была ранее опубликована 11.

Фигура 1
Рисунок 1: Очистка sumolyated субстратов позволяет идентифицировать белки кинетохор Ndc80 и Ndc10 как SUMO субстратов Pr.oteins были извлечены и ВЧ-Smt3 были получены конъюгаты и анализировали с помощью вестерн-блоттинга после отделения SDS-PAGE. и Б) Ndc80 и Ndc10 которые sumoylated. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Левая панель: Всего SUMO субстраты были обнаружены с помощью антитела анти-Flag. Справа: Sumoylated Ndc80 или Ndc10 был обнаружен в конъюгатах ВЧ-Smt3 при зондировании антитела анти-Myc. и D), SUMOylation из Ndc80 и Ndc10 уменьшается нокодазол обработанных клеток. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 20 мкг / мл нокодазолом (+) в течение 2 ч при 30 ° С. ВЧ-Smt3 конъюгаты были проанализированы с помощью Вестерн-блот-анализа с использованием анти-Myc антитела. Изогенных штаммов дрожжей, используемых в и С) YPH1800 (Ndc80-Мус), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Мус) и и Г) YPH1734 (Ndc10-Мус), YMB7867 (His-FlAG-SMT3 Ndc10-Мус).

Рисунок 2
Рисунок 2:. Убиквитинирование из кинетохор белков Ndc80 и Ndc10 Добыча белка и иммунопреципитации проводили, как описано в протоколе. () Ndc80 и Ndc10 которые убиквитинируется. Белки были извлечены из логарифмически растущие клетки в YPD. Экстракт Цельноклеточные (WCE), супернатант (SUP), и иммунопреципитации (IP) фракции подвергали SDS-PAGE. Вестернблоты были использованы для выявления Myc-метками и убиквитинированного белки с анти-Myc и анти-Ub антител, соответственно. (Б) убиквитинирование Ndc80 и Ndc10 усиливается в клетках, обработанных ингибитором протеасомы MG132. Логарифмически растущие клетки в YPD обрабатывали ДМСО (-) или ДМСО + 50 мкМ MG132 (+) в присутствии 0,003% ДСН в течение 3 часов при 30 ° С, как описано ранее 13

Решение Компоненты
YPD 1% дрожжевого экстракта, 2% Васто-пептон, 2% глюкозы
Гуанидин буфер 0,1 М Трис-HCl, рН 8,0, 6 М гуанидин-хлорида, 0,5 М NaCl
Буфер 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,2% Тритон Х-100, ингибиторы протеазы 1x
Главные буфер 0,1 М Трис-HCl, рН 8,0, 20% глицерина, 1 мМ PMSF
SUMEB буфера образца 1% ДСН, 8 М мочевины, 10 мМ MOPS рН 6,8, 10 мМ ЭДТА, 0,01% голубой бромфениловый
2x Лэммли Образец Буфер 100 мМ Трис-HClрН 6,8, 4% SDS, 20% глицерина, 0,2% бромфенолового синего (Перед использованием: добавление б-меркаптоэтанола (BME) до конечной концентрации 200 мМ)
1x TBST 137 мМ хлорида натрия, 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 0,1% Твин-20

Таблица 1: Решения.

Таблица 2. Штаммы дрожжей, используемые в данном исследовании *.
Деформации Родитель Генотип Ссылка
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Открыть биосистем
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Открыть биосистем
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 урa3Δ0 ВЧ-SMT3 :: LEU2 Эта учеба
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit др., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit др., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa his3 leu2 URA3 ADE2 trp1 ВЧ-SMT3 :: LEU2 Ndc80-Мус :: His3MX6 Эта учеба
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 URA3 trp1 Lys2 ВЧ-SMT3 :: LEU2 NDC10-Мус :: kanMX6 Эта учеба
* Все штаммы дрожжей являются производными от Saccharomyces Cerevisiae S288C.
Таблица 2: Штаммы дрожжей, используемые в данном исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эпитоп теги, такие как HA, Мус, флаг, и GST широко используются для биохимического анализа белков. Строительство штаммов с HF-Smt3 и Мус-меченных кинетохорных белков, таких как Ndc10 и Ndc80, облегчает обнаружение PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. ВЧ-Smt3 снести анализа позволяет выявлять sumoylated кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80 (рис 1). Протокол аффинной очистки и Вестерн-блоттинга с использованием анти-Flag антитела установить специфичность взаимодействия ВЧ-Smt3 и белков-мишеней, а модифицированные белки не были обнаружены в контрольном штамме без ВЧ-Smt3. Использование тега Myc на белковых субстратах проверяет наличие sumoylated Ndc10 и Ndc80 в конъюгатах ВЧ-Smt3. Кроме того, сумоилирования обоих Ndc10 и Ndc80 была снижена в нокодазол обработанных клеток (рис 1С и 1D). Снижение SUMOylation из Ndc10 в ответ на нокодазолом ЛЕЧЕНИИт, но не Ndc80, ранее сообщал Montpetit др. 9. Это может быть из-за различий в протоколе и использования пользовательского анти-SUMO антитела. Наши результаты для SUMOylation из кинетохорных субстратов предположить, что подобная протокол может быть использован для исследования других кандидатов сумо субстратов.

Для обнаружения убиквитинирование, Мус-тегом кинетохор белки были впервые иммунопреципитировали и IP фракции исследовали с анти-Ub антитела (рис 2). Лэддеринг образец Ndc10 и Ndc80 была увеличена, когда клетки обрабатывали MG132 ингибировать функцию протеасомы (фиг.2В), указывая, что эти белки являются субстратами протеасомы. IP-фракции не удалось обнаружить SUMOylation из Ndc10 или Ndc80 в Вестерн-блот-анализа с анти-Flag или анти-Smt3 антителом (данные не показаны). Это может быть из-за технических причин, таких как уровни sumoylated подложки во фракции IP или interferencе из тегов эпитоп. Дальнейшая оптимизация протокола IP, таких как концентрация солей и вестерн-блоттинга условиях должны способствовать выявлению нескольких PTMs любого интересующего белка. В настоящее время, сумоилирования лучше обнаружены ВЧ-Smt3 снести анализа с последующим западных пятнами кандидата SUMO субстратов (рисунок 1).

Несколько подробнее влияет на эффективность очистки белков и способность обнаруживать PTMs. Во-первых, все трубы должны быть на льду тормозят протеаз кроме как указано. Во-вторых, в соотношении 1: 1 из клеточной суспензии на стеклянные бусы имеет решающее значение для разрушения клеток с помощью бортового колотушки и / или вихревом смесителе. Лизис клеток следует контролировать путем исследования клеток под микроскопом. В-третьих, очень важно, чтобы подготовить осветленной лизата для выпадающего анализа или IP. Краткое или низкая скорость центрифугирования может способствовать загрязнению мусора клеток в лизата, и это влияет на способность детеКТ PTMs. Наконец, энергичного встряхивания гранул с большим объемом прозрачного лизата (около 1 мл) в 1,5 мл микро трубки центрифуги гарантирует, что шарики полностью приостановлено в раскрывающемся анализа или IP-адресов. Таким образом, очистки белков и обнаружения, такой как описана здесь обеспечивают важные механистические понимание того, как ПТМ из кинетохорных белков влияет на их структуру и сборку для верными хромосом 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter