Her rapporterer vi dobbelt mærkning af neurale crest celler og blodkar ved hjælp af chickGFP neuralrør intraspecies podning kombineret med intra-vaskulære DiI injektion. Denne eksperimentelle teknik giver os mulighed for samtidig at visualisere og studere udviklingen af det NCC-afledte (enteriske) nervesystem og det vaskulære system under organogenese.
Alle udviklende organer skal tilsluttes både nervesystemet (til sensorisk og motorisk kontrol) samt det vaskulære system (til gasudveksling, væske- og næringsstofforsyning). Derfor udvikler både nerve- og vaskulære systemer sig side om side og deler slående ligheder i deres forgrenede arkitektur. Her rapporterer vi embryonale manipulationer, der giver os mulighed for at studere den samtidige udvikling af neuralt crest-afledt nervevæv (i dette tilfælde det enteriske nervesystem) og det vaskulære system. Dette opnås ved at generere kylling kimærer via transplantation af diskrete segmenter af neuralrøret, og tilhørende neurale crest, kombineret med vaskulære DiI injektion i samme embryo. Vores metode bruger transgene chickGFP embryoner til intraspecies podning, hvilket gør transplantationsteknikken mere kraftfuld end den klassiske vagtel-chick interspecies podning protokol, der anvendes med stor effekt siden 1970’erne. ChickGFP-chickintraspecies podning letter billeddannelse af transplanterede celler og deres fremskrivninger i intakt væv, og eliminerer enhver potentiel bias i celleudvikling i forbindelse med artsforskelle. Denne metode udnytter fuldt ud avianembryoets let adgang (sammenlignet med andre hvirveldyrembryoner) til at studere den fælles udvikling af det enteriske nervesystem og det vaskulære system.
Kyllingembryoet er en uvurderlig modelorganisme i hvirveldyrudviklingsbiologi, ikke mindst fordi dets udvikling i ovo tillader eksperimentelle manipulationer, der ellers er umulige at udføre i hvirveldyr, der udvikler sig i livmoderen. Denne tilgængelighed og lethed af manipulationer har ført til, at kyllingembryoet spiller nøgleroller i mange skelsættende opdagelser inden for udviklingsbiologi. Blandt de mest kraftfulde teknikker har været brugen af vagtler-chick kimære embryoner til at studere celle skæbne, en metode banebrydende af professor Nicole Le Douarin i 1970’erne1-3. Især har vagtler-chick kimærer været særligt nyttige til genetisk mærke og følge stærkt vandrende neurale crest celle (NCC) befolkninger i den tidlige udvikling. NCC er en multipotent population af migrerende celler, der opstår i ryghvirvelserotallet i udkanten af neuralrøret, der giver anledning til en bred vifte af celletyper i hele hvirveldyrembryoet. Disse omfatter kraniofacial strukturer (brusk, knogler, muskler), neuroner og glia (i de sensoriske og autonome nervesystemer), melanocytter og en delpopulation af celler i det endokrine system2,4,5. En af de vigtigste faktorer, der påvirker NCC skæbne er deres oprindelige placering langs den forreste-bageste akse af neuralrøret. For eksempel opstår enteriske NCC, som giver anledning til neuronerne og glia i det enteriske nervesystem (ENS), fra to diskrete underpopulationer: den første placeret i vagalområdet (kaudale hindbrain) og den anden i neuralrørets sakrale region6-13. Inter- eller intraartstransplantation af de tilsvarende regioner i neuralrøret har været de foretrukne teknikker til permanent at mærke disse celler og efterfølgende tillade sporing fra deres fødsel i udkanten af neuralrøret til deres endelige destinationer inden for fordøjelseskanalen6,7,10.
En anden embryonal manipulation lettere at udføre i kylling, sammenlignet med andre dyremodeller, er den vitale mærkning af det vaskulære system. Faktisk, som kyllingembryoet udvikler sig, lægger det oven på et ekstra embryonalt vaskulært netværk, der cirkulerer ilt og næringsstoffer fra æggeblommen. Dette tilgængelige vaskulære netværk, der er placeret på æggeblommens overflade, kan bruges som en gateway til at mærke embryoets udviklende vaskulære system under organogenese12,14-17. Intravaskulær injektion af forskellige farvestoffer, såsom det lipofile farvestof DiI, gør det muligt at afgrænse/plette alle de lysarmede beholdere i det spirende vaskulære netværk.
Fordi udviklende organer skal tilsluttes både nervesystemet (for sensorisk og motorisk kontrol) samt det vaskulære system (til gasudveksling, væske og næringsstofforsyning), udvikler de to netværk sig sammen med hinanden og deler slående ligheder i deres forgrenede arkitektur18-20. Her rapporterer vi embryonale manipulationer, der giver os mulighed for at studere den samtidige udvikling af den NCC-afledte ENS sammen med det vaskulære system under organogenese. Dette opnås ved at generere kylling kimærer via transplantation af diskrete segmenter af neuralrøret, herunder neurale crest, kombineret med vaskulære DiI injektion. Som et fremskridt fra vagtel-kylling kimærer, vores metode bruger transgene GFP chick embryoner til intraspecies podning, hvilket gør transplantationen teknikken mere kraftfuld, i form af billeddannelse celler og deres fremskrivninger, og fjerne eventuelle bias forbundet med arter forskelle.
Metoden til intraspecies neuralrørstransplantation kombineret med blodkarmærkning beskrevet her, drager fuld fordel af avianembrynets let adgang til ægget (sammenlignet med andre hvirveldyrembryoner) for at studere samudviklingen af et element i det autonome nervesystem (ENS) og det vaskulære system.
Til mærkning af NCC-derivater har kyllingenGFP-chick intraspecies podningsmetode, vi beskriver, en række fordele i forhold til den klassiske vagtel-chick chimera-metode, der blev etableret for over 40 år siden1-3. For det første, under FITC lys, GFP fluorescens er meget lyse, i det omfang, at GFP + celler er let mærkbar i levende kimære embryoner. Dette gør det muligt at kontrollere graftens succes i ovo, mens vagtel-chick podning kræver, at embryoet aflives, behandles og immunostained ved hjælp af QCPN, før graftens succes kan fastslås2. For det andet er GFP-udtrykket i den transgene kyllingGFP cytoplasmisk, derfor er det ikke kun etiketter cellelegemer, men tillader også, at fremskrivningerne af de transplanterede celler visualiseres22. Dette gør det muligt at observere indviklede neuronale netværk ved høj opløsning (bemærk, at fine fremskrivninger bedst visualiseres, når prøven immunostained med anti-GFP antistof). Da QCPN-mærkning er begrænset til vagtelcellekernen, afsløres sådanne netværk ikke ved hjælp af vagtel-chick kimærer. For det tredje eliminerer intraspecies podning eventuelle artsforskelle mellem celler i det kimære embryo. Da vagtele embryoner har en kortere inkubationstid end kylling (19 dage versus 21 dage) er det blevet foreslået, at vagtler celler har en højere spredning end chick celler, som potentielt kan påvirke udviklingen af kimære væv23. Interessant nok har det også vist sig i planter, at interspecies podning kan producere omfattende ændringer i DNA-methyleringsmønstre i vært 24. For det fjerde, chickGFP letter back-transplantation eksperimenter for at løse emner som NCC skæbne og celle engagement25. For det femte er den transgene kyllingGFP også nyttig til mange andre teknikker, herunder FACS sortering af GFP + celle delpopulationer, organotypisk kultur af organer, der indeholder GFP + celler, genetisk manipulation af GFP + podet væv via elektroporation af udtrykket plasmids26, og andre billeddannelse teknologier såsom optisk projektion tomografi27.
Den neurale rørtransplantation tilgang kan ændres ved mikrokirurgisk erstatte kortere mængder af neuralrør. Ved at bruge mindre segmenter af neuralrør mikrokirurgi er potentielt mindre skadeligt for embryoet og overlevelse kan forbedres. Ulempen ved at transplantere mindre neuralrør er imidlertid, at antallet af GFP + NCC i værten vil blive reduceret. Brugere kunne forsøge at opnå en balance mellem mængden af neuralrør transplanteret for at give optimal overlevelse af embryoner, og antallet af GFP + NCC i vært tarmen tilstrækkelig til at give informative resultater.
Til skibsmaling har DiI den fordel, at dets fluorescens er meget lyst og robust. Det har også kapacitet til at diffuse under fiksering forsikre farvning af de fineste åbne kapillærer. Da det er et vitalt farvestof, kan embryoner overleve injektionsproceduren og fortsætte med at udvikle sig med et farvet vaskulært system (op til 24 timer i vores hænder, selvom farvningen bliver mere punktlig over tid, se figur 3E). Kombinationen af chickGFP podning med DiI vaskulært maleri er derfor kompatibel med levende billeddannelse. Ud over alle disse fordele er det vigtigt at bemærke, at vaskulær injektion kun mærker lysarmerede beholdere og derfor ikke identificerer uåbnede kapillærer, endotelspidsceller eller isolerede endotelceller. Yderligere fremskridt inden for fugletransgenese kan imidlertid give nye måder at omgå sådanne problemer på, som eksemplificeret ved forsøg med Tg(tie1:H2B-eYFP) vagteulære embryoner til at studere vaskulær morfogenese28. En anden begrænsning af denne teknik er, at for effektiv mærkning af beholdere i embryoner ved E7.5 og derefter skal der injiceres større mængder farvestof, hvilket kan gøre eksperimenter dyre. En ændring af teknikken kan dog omfatte billige blodkar mærkningbrug highlighter blæk14, selv om denne fremgangsmåde ikke er blevet prøvet i vores hænder.
Kritiske trin i procedurerne omfatter processen med at visualisere embryoet ved at injicere blæk under blastodisc. Hvis membranen, der dækker æggeblommen, er revet af den blækfyldte nål på dette stadium, bliver embryoets overlevelse alvorligt kompromitteret. Det er også vigtigt, når man forbereder et donor neuralrør, at vævet ikke efterlades i alt for lang tid i bugspytkirtlen (overvej ca. 10 minutter som et maksimum). Langvarig udsættelse for pancreatin skader væv og neuralrøret er derefter vanskeligt at håndtere, og det vil ikke indarbejde godt ind i værten. Det er vigtigt at få erfaring med diI-injektionsteknikken på embryoner af vild type, før der injiceres kimære embryoner, da kun ét forsøg på injektion generelt er muligt for hvert foster. DiI volumen og nål diameter er kritiske parametre for hvert foster og bør vurderes på vilde type, fase matchede kontrol.
Afslutningsvis kan vores dobbelte mærkningsmetode til neuralrørstransplantation og DiI-karmaling i levende kyllingembryoner bruges til at undersøge de indbyrdes relationer mellem NCC og blodkarnetværk under organogenese. I betragtning af de mekanismer, der er ansvarlige for at etablere korrekt mål innervation og vaskularisering under organudvikling er stadig stort set ukendt, denne metode rummer potentiale for fremtidige opdagelser på dette område.
The authors have nothing to disclose.
Befrugtede GFP kyllingæg blev leveret af prof. Helen Sang, The Roslin Institute, og University of Edinburgh, UK. Roslin Transgenic Chicken Facility er finansieret af Wellcome Trust og af Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC). Arbejdet blev delvist finansieret, og NT støttet af Great Ormond Street Hospital Children’s Charity, London, UK. Forfatterne takker Ben Jevans, UCL Institute of Child Health, for hjælp til at forberede embryoner til podning.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
Digital Camera | LEICA | DC500 |
Image acquisition software | LEICA | IM50 |
Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |