यहां हम तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं की दोहरी लेबलिंग की रिपोर्ट करते हैं जो चिकजीएफपी न्यूरल ट्यूब इंट्राप्रपीज का उपयोग करके इंट्रा-वैस्कुलर डीआईआई इंजेक्शन के साथ संयुक्त रूप से ग्राफ्टिंग करते हैं। यह प्रयोगात्मक तकनीक हमें ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान एनसीसी-व्युत्पन्न (आंत्र) तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के विकास की कल्पना और अध्ययन करने की अनुमति देती है।
सभी विकासशील अंगों को तंत्रिका तंत्र (संवेदी और मोटर नियंत्रण के लिए) के साथ-साथ संवहनी प्रणाली (गैस विनिमय, तरल पदार्थ और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए) दोनों से जोड़ा जाना चाहिए। नतीजतन तंत्रिका और संवहनी दोनों प्रणालियां एक दूसरे के साथ विकसित होती हैं और अपने ब्रांचिंग आर्किटेक्चर में हड़ताली समानताएं साझा करती हैं। यहां हम भ्रूणीय जोड़तोड़ की रिपोर्ट करते हैं जो हमें तंत्रिका क्रेस्ट-व्युत्पन्न तंत्रिका ऊतक (इस मामले में आंत्र तंत्रिका तंत्र), और संवहनी प्रणाली के एक साथ विकास का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। यह तंत्रिका ट्यूब के असतत खंडों के प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकन कल्पना पैदा करके हासिल किया जाता है, और संबद्ध तंत्रिका शिखा, एक ही भ्रूण में संवहनी DiI इंजेक्शन के साथ संयुक्त। हमारी विधि इंट्रास्पेस ग्राफ्टिंग के लिए ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी भ्रूण का उपयोग करती है, जिससे प्रत्यारोपण तकनीक 1 9 70 के दशक के बाद से महान प्रभाव के साथ उपयोग किए जाने वाले शास्त्रीय बटेर-चिक इंटरप्रीपीज़ ग्राफ्टिंग प्रोटोकॉल की तुलना में अधिक शक्तिशाली हो गई है। चिकजीएफपी-चिकइंट्रास्पेसेज ग्राफ्टिंग प्रत्यारोपित कोशिकाओं और अक्षुण्ण ऊतकों में उनके अनुमानों की इमेजिंग की सुविधा प्रदान करता है, और प्रजातियों के मतभेदों से जुड़े सेल विकास में किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को समाप्त करता है। यह विधि एंटिक तंत्रिका तंत्र और संवहनी प्रणाली के सह-विकास का अध्ययन करने के लिए एवियन भ्रूण (अन्य कशेरुकी भ्रूण की तुलना में) की पहुंच में आसानी का पूरा लाभ उठाती है।
चिकन भ्रूण कशेरुकी विकासात्मक जीव विज्ञान में एक अमूल्य मॉडल जीव है, कम नहीं है क्योंकि ओवो में इसका विकास प्रयोगात्मक जोड़तोड़ की अनुमति देता है जो अन्यथा गर्भाशयमें विकसित कशेरुकी में प्रदर्शन करना असंभव है। इस पहुंच और जोड़तोड़ की आसानी के कारण चिक भ्रूण विकासात्मक जीव विज्ञान के क्षेत्र में कई मौलिक खोजों में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है । सबसे शक्तिशाली तकनीकों में से कोशिका भाग्य का अध्ययन करने के लिए बटेर-चिक चिमरिक भ्रूण का उपयोग किया गया है, 1 9 70 के1-3में प्रोफेसर निकोल ले Douarin द्वारा बीड़ा उठाया एक विधि। विशेष रूप से, बटेर-चिक कल्पना आनुवंशिक रूप से चिह्नित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी रही है और प्रारंभिक विकास के दौरान अत्यधिक प्रवासी तंत्रिका क्रेस्ट सेल (एनसीसी) आबादी का पालन करती है। एनसीसी प्रवासी कोशिकाओं की एक बहुपसेंट आबादी है, जो तंत्रिका ट्यूब के हाशिए पर पृष्ठीय ectoderm में उत्पन्न होती है, जो कशेरुकी भ्रूण में कोशिका प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला को जन्म देती है। इनमें क्रैनियोफेशियल संरचनाएं (उपास्थि, हड्डी, मांसपेशियां), न्यूरॉन्स और ग्लिया (संवेदी और स्वायत्त तंत्रिका तंत्र में), मेलानोसाइट्स, और एंडोक्राइन सिस्टम2,4,5की कोशिकाओं की एक उपजनसंख्या शामिल हैं। एनसीसी भाग्य को प्रभावित करने वाले सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक तंत्रिका ट्यूब के पूर्वकाल-पीछे धुरी के साथ उनका प्रारंभिक स्थान है। उदाहरण के लिए, आंत्र एनसीसी, जो आंत्र तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) के न्यूरॉन्स और ग्लिया को जन्म देता है, दो असतत उप-आबादी से उत्पन्न होता है: पहला वागल (कौडल हिंडब्रेन) क्षेत्र में स्थित है, और दूसरा तंत्रिका ट्यूब6-13के पवित्र क्षेत्र में। तंत्रिका ट्यूब के संबंधित क्षेत्रों की अंतर या अंतर-प्रजातियों की ग्राफ्टिंग इन कोशिकाओं को स्थायी रूप से लेबल करने के लिए पसंद की तकनीक रही है और बाद में तंत्रिका ट्यूब के हाशिए पर उनके जन्म से, पाचन तंत्र6,7,10के भीतर अपने अंतिम गंतव्यों के लिए ट्रैकिंग की अनुमति देती है।
अन्य पशु मॉडलों की तुलना में लड़की में प्रदर्शन करना आसान एक और भ्रूणीय हेरफेर, संवहनी प्रणाली की महत्वपूर्ण लेबलिंग है। दरअसल, के रूप में लड़की भ्रूण विकसित करता है, यह एक अतिरिक्त भ्रूण संवहनी नेटवर्क है कि जर्दी से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों को परिचालित के शीर्ष पर देता है । जर्दी की सतह पर स्थित इस सुलभ संवहनी नेटवर्क का उपयोग ऑर्गेनोजेनेसिस12,14-17के दौरान भ्रूण के विकासशील संवहनी प्रणाली को लेबल करने के लिए एक प्रवेश द्वार के रूप में किया जा सकता है। लिपोफिलिक डाई डीआईआई जैसे विभिन्न रंगों का इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन नवजात संवहनी नेटवर्क के सभी चमकीले जहाजों को चित्रित/दाग देना संभव बनाता है ।
क्योंकि विकासशील अंगों को तंत्रिका तंत्र (संवेदी और मोटर नियंत्रण के लिए) के साथ-साथ संवहनी प्रणाली (गैस विनिमय, तरल पदार्थ और पोषक तत्वों की आपूर्ति के लिए) दोनों से जुड़ा होना चाहिए, दोनों नेटवर्क एक दूसरे के साथ विकसित होते हैं और अपने ब्रांचिंग आर्किटेक्चर18-20में हड़ताली समानताएं साझा करते हैं। यहां हम भ्रूणीय जोड़तोड़ की रिपोर्ट करते हैं जो हमें ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान संवहनी प्रणाली के साथ-साथ एनसीसी-व्युत्पन्न ईएनएस के एक साथ विकास का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं । यह तंत्रिका ट्यूब के असतत खंडों के प्रत्यारोपण के माध्यम से चिकन कल्पना पैदा करके हासिल किया जाता है, जिसमें तंत्रिका शिखा भी शामिल है, जो संवहनी DiI इंजेक्शन के साथ संयुक्त है। बटेर-चिकन कल्पनाओं से एक अग्रिम के रूप में, हमारी विधि इंट्राप्रजाति ग्राफ्टिंग के लिए ट्रांसजेनिक जीएफपी चिक भ्रूण का उपयोग करती है, इमेजिंग कोशिकाओं और उनके अनुमानों के संदर्भ में प्रत्यारोपण तकनीक को अधिक शक्तिशाली बना रही है, और प्रजातियों के मतभेदों से जुड़े किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को नष्ट करती है।
यहां वर्णित रक्त वाहिका लेबलिंग के साथ संयुक्त तंत्रिका ट्यूब ग्राफ्टिंग की विधि, स्वायत्त तंत्रिका तंत्र (ईएनएस) और संवहनी प्रणाली के तत्व के सह-विकास का अध्ययन करने के लिए अंडे के भीतर एवियन भ्रूण (अन्य कशेरुकी भ्रूण की तुलना में) की पहुंच में आसानी का पूरा लाभ उठाती है।
एनसीसी डेरिवेटिव लेबलिंग के लिए, चिकजीएफपी-चिकइंट्राप्रेपी ग्राफ्टिंग विधि का हम वर्णन शास्त्रीय बटेर-चिक कल्पना विधि पर कई फायदे हैं जो 40 साल पहले1-3से अधिक स्थापित किए गए थे। सबसे पहले, फिटसी प्रकाश के तहत, जीएफपी फ्लोरेसेंस बेहद उज्ज्वल है, इस हद तक कि जीएफपी + कोशिकाएं जीवित चिमरिक भ्रूण में आसानी से समझदार हैं। यह भ्रष्टाचार की सफलता को ओवो मेंजांचने की अनुमति देता है, जबकि बटेर-चिक ग्राफ्टिंग के लिए भ्रूण को मार दिया जाना चाहिए, संसाधित और QCPN का उपयोग कर इम्यूनो दाग, इससे पहले कि भ्रष्टाचार की सफलता का पता लगाया जा सकता है2। दूसरा, ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी में जीएफपी अभिव्यक्ति साइटोप्लाज्मिक है, इसलिए यह न केवल सेल निकायों को लेबल करता है, बल्कि प्रत्यारोपित कोशिकाओं के अनुमानों को22कल्पना करने की अनुमति देता है। यह उच्च रिज़ॉल्यूशन पर देखे जाने वाले जटिल न्यूरोनल नेटवर्क को अनुमति देता है (ध्यान दें कि जब नमूना एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनो दाग होता है तो ठीक अनुमानों की सबसे अच्छी कल्पना की जाती है)। के रूप में QCPN लेबलिंग बटेर सेल नाभिक तक ही सीमित है, इस तरह के नेटवर्क बटेर-लड़की कल्पना का उपयोग कर पता नहीं कर रहे हैं । तीसरा, इंट्रास्पेस ग्राफ्टिंग चिमरिक भ्रूण के भीतर कोशिकाओं के बीच किसी भी संभावित प्रजाति के अंतर को समाप्त करता है। चूंकि बटेर भ्रूण में लड़की (19 दिन बनाम 21 दिन) की तुलना में कम इनक्यूबेशन अवधि होती है, इसलिए यह सुझाव दिया गया है कि बटेर कोशिकाओं में चिक कोशिकाओं की तुलना में अधिक प्रसार दर होती है, जो संभावित रूप से चिमरिक ऊतकों के विकास को प्रभावित कर सकती है23। दिलचस्प बात यह भी है कि यह पौधों में दिखाया गया है कि इंटरप्रपीज ग्राफ्टिंग मेजबान 24में डीएनए मिथाइलेशन पैटर्न में व्यापक परिवर्तन पैदा कर सकता है। चौथा, लड़कीGFP एनसीसी भाग्य और सेल प्रतिबद्धता25जैसे विषयों को संबोधित करने के लिए बैक-ट्रांसप्लांट प्रयोगों की सुविधा प्रदान करता है । पांचवां, ट्रांसजेनिक चिकजीएफपी जीएफपी + सेल सबपॉपुलेशन की एफएएफएस छंटाई, जीएफपी + कोशिकाओं वाले अंगों की ऑर्गेनोटिपिक संस्कृति, अभिव्यक्ति प्लाज्मिड्स 26 के इलेक्ट्रोपाउरेशन के माध्यम से जीएफपी + ग्राफ्टेड ऊतक के आनुवंशिक हेरफेर और ऑप्टिकल अनुमान टोमोग्राफी27जैसी अन्य इमेजिंग प्रौद्योगिकियों सहित कई अन्य तकनीकों के लिए भी उपयोगी है।
तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण दृष्टिकोण तंत्रिका ट्यूब की छोटी मात्रा की जगह microsurgically द्वारा संशोधित किया जा सकता है। तंत्रिका ट्यूब के छोटे खंडों का उपयोग करके माइक्रोसर्जरी भ्रूण के लिए संभावित रूप से कम हानिकारक है और अस्तित्व में सुधार किया जा सकता है। हालांकि, कम तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण का नकारात्मक पक्ष यह है कि मेजबान में GFP + एनसीसी की संख्या कम हो जाएगी । उपयोगकर्ता भ्रूण के इष्टतम अस्तित्व को देने के लिए प्रत्यारोपित तंत्रिका ट्यूब की मात्रा और जानकारीपूर्ण परिणाम देने के लिए पर्याप्त मेजबान आंत के भीतर जीएफपी + एनसीसी की संख्या के बीच संतुलन प्राप्त करने की कोशिश कर सकते हैं।
पोत चित्रकला के लिए, DiI को लाभ है कि इसकी फ्लोरेसेंस बहुत उज्ज्वल और मजबूत है। इसके अलावा, यह बेहतरीन खोला केशिकाओं के धुंधला आश्वासन निर्धारण के दौरान फैलाना करने की क्षमता है । चूंकि यह एक महत्वपूर्ण डाई है, भ्रूण इंजेक्शन प्रक्रिया जीवित है और एक दाग संवहनी प्रणाली के साथ विकसित करने पर ले जा सकते है (हमारे हाथों में 24 घंटे तक, हालांकि धुंधला समय के साथ और अधिक समयनिष्ठ हो जाता है, चित्रा 3Eदेखें) । DiI संवहनी चित्रकला के साथ लड़कीजीएफपी ग्राफ्टिंग का संयोजन इसलिए लाइव इमेजिंग के साथ संगत है। इन सभी फायदों के अलावा, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि संवहनी इंजेक्शन केवल चमकीले जहाजों को लेबल करता है और इसलिए खुले हुए केशिकाओं, एंडोथेलियल टिप कोशिकाओं या अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं की पहचान नहीं करता है। हालांकि, एवियन ट्रांसजेनेसिस में आगे की प्रगति ऐसे मुद्दों को दरकिनार करने के लिए नए तरीके प्रदान कर सकती है, जैसा कि टीजी (tie1: H2B-eYFP) बटेर भ्रूण का उपयोग करके संवहनी मॉर्फोजेनेसिस28का अध्ययन करने के लिए प्रयोगों द्वारा उदाहरण दिया गया है । इस तकनीक की एक और सीमा यह है कि, E7.5 और उससे आगे भ्रूण में प्रभावी पोत लेबलिंग के लिए, डाई की बड़ी मात्रा में इंजेक्शन की जरूरत है, जो प्रयोग महंगा कर सकते हैं । हालांकि, तकनीक के एक संशोधन में हाइलाइटर इंक14का इसयूजिंग कम लागत वाले रक्त वाहिका लेबलिंग शामिल हो सकते हैं, हालांकि इस दृष्टिकोण को हमारे हाथों में आजमाया नहीं गया है।
प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण चरणों में ब्लास्टोडिस्क के नीचे स्याही इंजेक्शन लगाकर भ्रूण की कल्पना करने की प्रक्रिया शामिल है। यदि जर्दी को कवर करने वाली झिल्ली इस स्तर पर स्याही से भरी सुई से फट जाती है तो भ्रूण के अस्तित्व से गंभीर रूप से समझौता किया जाता है। इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है, जब एक दाता तंत्रिका ट्यूब तैयार, कि ऊतक अग्न्याशय में एक जरूरत से ज्यादा लंबे समय के लिए नहीं छोड़ा जाता है (एक अधिकतम के रूप में लगभग 10 मिनट पर विचार करें) । अग्नाशय के लिए लंबे समय तक जोखिम ऊतक को नुकसान पहुंचाता है और तंत्रिका ट्यूब को संभालना मुश्किल होता है और यह मेजबान में अच्छी तरह से शामिल नहीं होगा। जंगली प्रकार के भ्रूण पर DiI इंजेक्शन तकनीक का अनुभव प्राप्त करना चिमरिक भ्रूण इंजेक्शन से पहले आवश्यक है, क्योंकि इंजेक्शन लगाने का केवल एक प्रयास प्रत्येक भ्रूण के लिए आम तौर पर संभव है। DiI मात्रा और सुई व्यास प्रत्येक भ्रूण के लिए महत्वपूर्ण मापदंडों रहे है और जंगली प्रकार, मंच मिलान नियंत्रण पर मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।
अंत में, लाइव चिक भ्रूण में तंत्रिका ट्यूब प्रत्यारोपण और DiI पोत चित्रकला की हमारी दोहरी लेबलिंग विधि का उपयोग ऑर्गेनोजेनेसिस के दौरान एनसीसी और रक्त वाहिका नेटवर्क के बीच अंतर-संबंधों की जांच करने के लिए किया जा सकता है। अंग विकास के दौरान सही लक्ष्य इनरवेशन और संवहनीकरण स्थापित करने के लिए जिम्मेदार तंत्र को ध्यान में रखते हुए अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं, यह पद्धति इस क्षेत्र में भविष्य की खोजों के लिए क्षमता रखती है।
The authors have nothing to disclose.
निषेचित जीएफपी चिकन अंडे प्रो हेलेन सांग, रोसलिन संस्थान, और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय, ब्रिटेन द्वारा आपूर्ति किए गए थे । रोसलिन ट्रांसजेनिक चिकन सुविधा वेलकम ट्रस्ट द्वारा और जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद (BBSRC) द्वारा वित्त पोषित है । काम आंशिक रूप से वित्त पोषित किया गया था, और NT का समर्थन किया, ग्रेट ऑरमंड स्ट्रीट अस्पताल बच्चों के चैरिटी, लंदन, ब्रिटेन द्वारा । लेखकों बेन Jevans, बाल स्वास्थ्य के यूसीएल संस्थान, ग्राफ्टिंग के लिए भ्रूण तैयार करने के साथ मदद के लिए शुक्रिया अदा करते हैं ।
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number |
Fertilised chick eggs | Henry Stewart and Co, Louth, UK | |
Fertilised GFP chick eggs | The Transgenic Chicken Facility, The Roslin Institute, The University of Edinburgh | |
Egg incubator (Profi-H Hatcher) | Lyon Technologies, CA, USA | 910-033 |
14C Incubator | Precision Cooled Incubator, Leec Ltd., Nottingham, UK | Model LT2 |
Stereo-microscope | LEICA | Model MZ 12.5 |
Digital Camera | LEICA | DC500 |
Image acquisition software | LEICA | IM50 |
Goose neck halogen cold light source | Advanced Imaging Concepts, Inc | KL 1500 LCD |
181⁄2 G hypodermic needle | SIGMA – ALDRICH | HSWNH181 |
Pancreatin | SIGMA – ALDRICH | P3292 |
DMEM | SIGMA – ALDRICH | D5030 |
Goat serum | SIGMA – ALDRICH | G6767 |
5ml syringe | SIGMA – ALDRICH | Z248010 |
Mouth tube | SIGMA – ALDRICH | A5177 |
Sigma Pasteur pipettes non-plugged, L 5 3/4 in. | SIGMA – ALDRICH | S6018 |
Transfer pipettes, polyethylene | SIGMA – ALDRICH | Z350796 |
Borosillicate glass capillaries, thin wall without filament | Harvard apparatus | PY8 30-0035 |
Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 |
Curved Iris Scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14059-09 |
Needle holders (Nickel-plated pin holder) | Fine Science Tools | 26018-17 |
Pascheff-Wolff Spring Scissors | Fine Science Tools | 15371-92 |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 |
Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-15 |
Dumont AA forceps, Inox Epoxy- coated | Fine Science Tools | 11210-10 |
Perforated spoon | Fine Science Tools | 10370-18 |
Tungsten needles (0.125mm diameter) | Fine Science Tools | 10130-05 |
Sellotape (clear, 24mm width) | Any Supplier | |
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution | VWR international | 101447-068 |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | S09 512 516 |
Pelikan black ink | Pelikan | 211-169 |
CellTracker CM-DiI | Molecular Probes | C-7001 |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 |
Settings for glass needle puller | Sutter Instruments | Flaming/Brown micropipette puller model P-86 |
Heat 950; Pull 150; Velocity 100; Time 200; Pressure 500 |