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Biology

Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

doi: 10.3791/52531 Published: April 20, 2015

Introduction

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Das Darmepithel ist eine der am schnellsten vermehren Körpergewebe, die verursacht hat es großes Interesse aus der Forschung über Krebs und Stammzellen zu gewinnen. Im Jahr 2009 wurde eine Technik veröffentlicht, um lang anhaltende Kulturen von Klein Darmkrypten in Matrigel erzeugen, Erhaltung eine 3-dimensionale Struktur 1. Diese Strukturen, sogenannte Darm Organoiden, kann unter Verwendung von Standardtechniken gezüchtet werden, mit Umgebungsmedium mit einer Anzahl von definierten Wachstumsfaktoren, einschließlich BMP-Signalweg-Inhibitors Noggin (nOgh) ergänzt, die Wnt-Signalwegs Enhancer rspondin 1 (Rspo1) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) alle eine Darm Proliferation 2-4 verbessern.

Organoide übertreffen traditionelle Krebszelllinien in den Aspekten, dass sie nicht-mutierten sind, haben Stammzellen Hierarchie beibehalten, zeigen intakten Zellpolarisation und Ausstellungs Differenzierung in allen Zelllinien in der im Entstehen begriffenen kleine int gefundenestinal Epithel. Da sie transduziert Transgene tragen oder RNA-Interferenz-Konstrukte 5, werden sie verwendet, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, überwiegt Experimenten mit transgenen Mäusen in Facetten Kosten und Geschwindigkeit. Transgene Expression in Organoiden kann unter Verwendung von entweder murine retroviralen oder lentiviralen Vektoren 6,7 werden. Aufgrund der Einschränkungen der murine Retroviren, in der Lage zu transduzieren mitotischen Zellen ausschließlich 8 wird lentiviralen Transduktion häufiger für Zellen, die nur schwer zu infizieren, wie Organoiden verwendet.

Viral transduziert und stabil exprimierenden transgenen Organoiden kann für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich quantitative RNA-Analysen und Immunhistochemie. Zusammengenommen hat Kultur Organoide von primären intestinalen Epithelzellen in eine Routine-Technik, die einfach und ohne spezielle Laboranforderungen umzusetzen ist entwickelt, und hat sich die neue Norm in cell Kultur in Forschung auf das Darmepithel.

Techniken der virale Transduktion und nachfolgende Downstream-Analyse in Organoide sind mühsam durchzuführen und um organoide Experimente helfen wir generiert dieses Video-Protokoll und zeigt Methoden zur lentivirale Transduktion der kultivierten Organoide. Wir zeigen außerdem, wie die korrekte Verarbeitung Organoide kann die Ausbeute zu erhöhen und damit die Leistung zu verbessern nachgeschalteter Analyse mittels RNA-Techniken oder die Immunhistochemie. In dem Protokoll wurden Organoiden, die von kleinen Darmkrypten abgeleitet werden ausschließlich verwendet, obwohl die beschriebenen Techniken können zum Kolon Organoide als auch angewendet werden.

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Protocol

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1. Herstellung von Polyethylenimin (PEI) als Transfektionsreagenz

  1. Man löst etwa 150 mg von PEI in 100 ml H 2 O.
  2. Einstellen auf pH 7,4 durch Zugabe von HCl, bis die Lösung klar wird und rühre bis zur vollständigen Auflösung. Dieser kann zwischen 10 und 60 Minuten dauern und Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml.
  3. Wenn klar ist, filtern das PEI-Lösung durch ein steriles 0,22 um Filter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 5 ml.

2. Herstellung von Lentivirale Partikel

Tag 1:

  1. Split HEK293T-Zellen zu 60% bis 80% Konfluenz in 162 cm 2 -Kolben oder große Petrischale in Zellinie Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänzt Ergänzung).

Tag 2:

  1. Bereiten DNA Transfektion Lösung mit 45 ug Gesamt-Plasmid-DNA durch Additionlentiviralen Verpackungsvektoren (7 ug pVSVg; 5 ug pRSV rev; 13 ug pMDL) und 20 ug lentiviralen Plasmid, der das Gen von Interesse oder shRNA von Interesse kodiert. Einzustellen, um ein Volumen von 1 ml mit DMEM.
  2. Bereiten PEI Transfektion Lösung durch Zugabe von 90 ul 1 mg / ml PEI 930 ul DMEM und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
  3. In DNA-Transfektion Lösung PEI-Lösung. Vortex oder Invertzucker mehrfach und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um DNA-Transfektion Lösung zu erhalten.
  4. Tropft 2 ml des DNA-Transfektions-Lösung auf die HEK293T Zellen und Inkubation für 4 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C.
  5. Nach 4 Stunden, aktualisieren Sie die Kulturmediums auf PEI zu entfernen. Es ist nicht notwendig, Zellen zu waschen, bevor neues Medium.
    HINWEIS: PEI ist zytotoxischen und Inkubationszeiten länger als 4 Stunden kann zu Schädigungen der HEK293T-Zellen führen.

Tag 4:

  1. Supe ersetzenrnatant mit neuen Kulturmedium. Halten Stand (Virus enthalten); Dies wird in Schritt 2.10 verwendet werden.
  2. Legen Überstand in 15 ml-Kolben. Um tote Zellen, Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g zu entfernen.
  3. Schieben Stand durch ein 0,45 um-Filter unter Verwendung einer großen Spritze 60 ml. Speichern Nacht bei 4 ° C.

Tag 5:

  1. Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand; Zentrifuge und Filter, wie in den Schritten 2,8-2,9.
  2. Pool der Überstände aus den Schritten 2.9 und 2.10 in Ultrazentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50.000 xg in einer Ultrazentrifuge für 90 min.
  3. Nehmen Sie die Kapseln Ultrazentrifugenröhrchen, die sehr sorgfältig und in eine Sterilbank, die Erinnerung an die Ausrichtung des Rohres in der Zentrifuge.
  4. Offene Kapselhalteultrazentrifugenröhrchen dekantiert Medium sorgfältig in einer solchen Weise, daß das Pellet an der Oberseite des Rohrs. Da virale Pellets kann schwierig sein, zu visualisieren, zu erinnern, wasSeite des Rohrs ein Pellet gebildet haben. Werfen Sie einen Mikropipette und entfernen letzte bisschen Medium während kümmert sich nicht um die undurchsichtigen braunen Pellets, die auf der Seite der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen sichtbar zu agitieren.
  5. Resuspendieren dieses Pellet in 500 ul organoiden Kultur-Medium mit 10 mM Nicotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 und 8 ug / ml Polybren ergänzt. Resuspension in diesem Medium ist wichtig, da mit hohem Titer-Virus wird verwendet, um Organoide direkt transduzieren.
  6. Optional: einfrieren, das Virus in diesem Medium in zwei Chargen von 250 ul in -80 ° C aliquotiert.

3. Lentivirale Transduktion Organoide

Tag 0:

  1. Split eine vollständige 0,95 cm 2 und der Organoide zwei Tage vor dem in eine neue und Weiterleitung mit dem Ziel, rund 50 kleine Organoide erhalten. Aufgeteilt Organoiden nach früher veröffentlichten Protokoll 1 (3A, B).
  2. Ergänzen organoide Kulturmedium mit 10 & mgr; Chir99021 und 10 mM Nicotinamid zystische Hyperproliferations Krypten (3C) zu erhalten.
    HINWEIS: Cystic Krypten am besten entwickeln, wenn frisch gespalten Organoide werden in Gegenwart von Chir99021 gewachsen.

Tag 2:

  1. Ernte Organoide durch Auf- und Abpipettieren der Matrigel und mittlere, wodurch das Gemisch mit einer Mikropipette p1000 zu stören. Legen Sie die Mischung in einem 15-ml-Tube.
  2. Weiter stören mit Pasteur-Pipette, in dem sich die distale Öffnung hat, durch Schmelzen verringert. Zentrifuge Organoiden für 5 min bei 100 x g pelletieren.
    HINWEIS: Abhängig von der Größe der Zentrifuge, verwenden Sie ein anderes Zentrifugendrehzahl. Es ist notwendig, die genaue Geschwindigkeit, mit der gestörten Organoide werden aus dem Gemisch abgetrennt finden.
  3. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul vorgewärmtes 1x Trypsin (ähnlich wie 0,25% Trypsin). Resuspendieren Organoide in Trypsin und Inkubation3 min in einem 37 ° C Wasserbad.
  4. Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml Zelllinie Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Glutamin). Zentrifuge 5 min bei 500 x g.
  5. Entfernen Sie den Überstand in Pellet in etwa 20 ul Medium zu verlassen. Übertragen Sie die Organoide in diesem letzten kleinen Menge des Mediums in einen Brunnen auf einem 48-Mulden Platte.
  6. In hohem Titer Lentivirus in Übertragungsmedium, wie in Schritt 2.14, resuspendieren beschrieben und fahren Sie mit Schritt 3.10. In der Begegnung mit niedrigen Übertragungswirksamkeit, Schritt 3.9 hinzugefügt werden.
    HINWEIS: Für eine effiziente Weiterleitung, in der Regel fügen Sie ein Aliquot von 250 ul mit hohem Titer Lentivirus um eine Vertiefung Organoide. Dies entspricht 50% der gesamten Ernte Lentivirus aus einer Produktion wie in Schritt 2 dieses Protokolls beschrieben.
  7. Optional: zu Übertragungswirksamkeit zu verbessern, führen spinoculation, indem Sie die 48 Well-Platte mit Organoide in einem vorgewärmten Zentrifuge auf 326; C und rotieren bei 600 × g für 1 Std.
  8. Setzen organoide-Virus-Mischung in Kulturbrutschrank und Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem Brutschrank zum Übertragung ermöglichen.
  9. Optional: zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der Transduktion inkubieren Organoiden weitere 3 h bei 37 ° C in einem Brutschrank.
  10. 1 ml der organoiden Kulturmedium und resuspendieren organoide-Virus-Mischung, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 850 xg pelletiert Organoide.
  11. Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul eiskaltem Matrigel. Da das Material verfestigt, wenn es wärmer wird, verwenden Sie die Pipettenspitzen, die durch Auf- und Abpipettieren eiskaltem PBS für eine Reihe von mal gekühlt werden.
  12. Setzen des Tröpfchens in der Mitte einer Vertiefung in einer 48 Vertiefungen Inkubieren in Kulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min zu verfestigen.
  13. Nach 15 Minuten vorsichtig mit 250 ul organoide Kulturmedium, ergänzt10 mM Nicotinamid, 10 uM und 10 uM Chir99021 Y27632. Kleine gestört organoide Fragmente werden in kleine zystische Organoide innerhalb von 24 Stunden zu bilden.

Tag 5:

  1. Aktualisieren Medium und zu ergänzen, mit einer Auswahl Antibiotikum (für Puromycin, verwenden Sie 4 ug / ml).

7. Tag:

  1. Ersetzen Medium für Standard organoide Kulturmedium, mit Auswahl Antibiotikum ergänzt.
    HINWEIS: Angehende wird komplett 2-3 Wochen nach Chir99021 Rückzug sein. Nach der Auswahl können Organoide ohne Selektionsantibiotikum angebaut werden.

4. Organoide RNA Vorbereitung Quantitative RT-PCR oder Microarray-

  1. Zur RNA-Präparation, mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Entfernen Sie das Medium aus Organoide und fügen Sie 350 ul Puffer RLT, mit β-Mercaptoethanol ergänzt gerade auf der Kuppel des Matrigel enthält Organoide. Resuspendieren der Material in RLT durch Pipettieren mit p1000 Mikropipette.
  2. Der weitere RNA prep nach dem Protokoll des Herstellers.
  3. Optional: RNA-Ausbeute zu erhöhen durch Amplifikation mit Ovation Pico WTA Systems und schreibt erste Eingabe von 50 ug Gesamt-RNA nach Herstellerprotokoll.
  4. Optional: für die Qualitätskontrolle vor der RNA-Microarray, laufen Proben auf einem 2100 Bioanalyzer mit einem Eukaryoten Gesamt-RNA Nano-Chip, mit dem Ziel für eine RNA Integrity Number (RIN) von 8,5 oder mehr (5) nach dem Protokoll des Herstellers.

5. Die Verarbeitung Organoide für Paraffinausgießstation und Immunhistochemie

  1. Vor Beginn der organoiden Einbindung vorwärmen ein Aluminiumblock mit Bohrungen passend Durchmesser 12 mm Glasröhrchen im Brutschrank bei 70 ° C bis Paraffin flüssig zu halten.
  2. Werfen Sie einen einzigen gut mit ausgewachsenen Organoide und entfernen Sie das Medium, so dass die eingebetteten Organoide intakt.
  3. 1 mlvon 4% Paraformaldehyd in PBS direkt zu gut und zu beheben bei 4 ° C überall von 1 Stunde über Nacht.
  4. Para Ersetzen mit 1 ml eiskaltem PBS.
    Optional: halten fest Organoide in PBS bis zu 1 Woche bei 4 ° C nach diesem Schritt.
  5. Resuspendieren Fest Organoide in 1 ml PBS aufnehmen und in Glasfläschchen.
  6. Lassen Organoiden sinken nach unten für 1 min, zu dekantieren und zu ersetzen PBS mit 70% Ethanol in dem ein paar Tropfen von Eosin-Lösung gelöst, um die Visualisierung von Organoiden gesamten Einbettungsprozesses zu ermöglichen.
  7. Verlassen Organoiden in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten, entfernen Sie 70% Ethanol durch vorsichtiges Dekantieren, die Möglichkeit, die Organoide von Auge, weil der leichte rosa Farbe Eosin sichtbar zu machen. Ersetzen Sie die Einbettung Lösung mit 96% Ethanol.
  8. Wiederholen Sie Schritt 5.7 wird jedes Mal, Austausch der Einbettung Lösung mit dem nächsten. Pass Organoide durch die folgenden Lösungen anschließend: 70% Ethanol, 90% Ethanol, 96% Ethanol, 100% ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol.
  9. Dekantiert man die letzten Xylol Wasch und gießen Paraffin in die Röhre. Das Glas sofort in der Pre erwärmt Aluminiumblock bei 70 ° C für 30 min und ersetzen Paraffin mit neuen sauberen Paraffin.
  10. Gießen Paraffin aus und Pipetten Organoide in den Paraffinblock Form unter Verwendung einer vorgewärmten Pasteur-Pipette mit großer Öffnung. Halten Pasteur-Pipette warmen mit einem Bunsenbrenner. Legen Sie alle Organoide im Paraffinblockform in einer kleinen Schicht von flüssigem Paraffin.
  11. So viel wie möglich, versuchen Sie, alle Organoide in Richtung der Mitte des Paraffinblocks Form unter Verwendung einer erwärmten Dissektion Nadel manipulieren. Halten Sie Dissektion Nadel warmen mit Bunsenbrenner.
  12. Wenn Lokalisierung Organoide in der Form ist zufriedenstellend, Kokille leicht auf die Paraffinschicht verfestigt.
  13. Beenden Sie den Block durch Gießen mehr Paraffin auf und fügen Sie ein Standard-histologische Einbettung Kassette.

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Representative Results

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Organoide lentivirale Transduktion

Die Technik der organoiden Transduktion unter Verwendung lentivirale Partikel hängt von richtigen Umgang mit Organoide vor und während der Weiterleitung. Organoide (3A) wurden kultiviert und sie in einzelne Krypten (3B) gestört wurden. Wie bereits berichtet, diese einzelnen Krypten, wenn sie in Gegenwart der GSK3-Inhibitor Chir99021 kultiviert wurde zystische Krypten 9 (3C). Anschließend wurden Organoide trypsiniert, um das Eindringen von Viruspartikeln, einzelne Zellen zu ermöglichen. Wenn transduzierenden Zellen lentivirale Partikel kann eine Anzahl von Methoden versucht, Transduktion Wirksamkeit wie spinoculation oder längerer Inkubation zu erhöhen. Hohe Titer PGK-eGFP Lentivirus wurde verwendet, um die Visualisierung der Transduktion Wirksamkeit durch Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. Transduction Wirksamkeit Organoide mit diesem Plasmid war hoch und näherte sich 100% (Figure 4E, F). Die Verbesserung der Wirksamkeit mit spinoculation (4A, B) oder längerer Inkubation mit lentivirale Partikel (4C, D), was keine zusätzlichen Mehrwert liefern.

RNA-Extraktion

Nächste Organoide zur RNA-Extraktion wurden gewachsen. Ausgewachsene Organoide geerntet wurden, die zu Gamma-Bestrahlung oder Kontrollbehandlung unterzogen wurden, um reduzierten RNA-Integrität (Abbildung 5) zu zeigen. Bei der Bestrahlung mit 6 Gy, RNA abgebaut wird und im Vergleich zu behandelten Organoiden zu steuern, wird die Integrität der RNA Nummer (RIN) reduziert.

Immunhistochemie auf Paraffin Organoide

Nach Inkubieren Organoiden für 2 Stunden in Kulturmedium mit BrdU ergänzt wurden Organoiden in Formalin fixiert und für die Immunhistochemie (Abbildung 6) verarbeitet. Mit Maus-anti BrdU könnte proliferativen Zellen in Krypta-segm beobachtenents von Organoiden und nicht in der differenzierten Fach.

Abbildung 1
Abb. 1: Schematische Darstellung der Lentivirus-Produktion für organoide Transduktion Wie im Protokoll Teil 2 geschrieben, in dieser schematischen werden die wichtigsten Schritte der Virusproduktion mit Protokollschritt Anzahl und Zeitpunkt vertreten.

Abbildung 2
Abb. 2: Schematische Darstellung des lentiviralen Transduktion Organoide Wie im Protokoll Teil 3 geschrieben, in dieser schematischen werden die wichtigsten Schritte der organoiden Übertragung mit Protokoll Schrittnummern und Zeit vertreten.

Figur 3
Abbildung 3: Organoide vor und während transduction. Normalerweise wächst Organoide (A) werden in dicht wachsenden kleinen Organoide (B), die zystische werden nach der Inkubation mit Chir99021 für eine Anzahl von Tagen (C) aufgeteilt. Nach Dissoziation dieser Organoide mit Trypsin, Einzelzellen und kleine Zellklumpen bleiben (D), die anschließend transduziert werden. Maßstabsbalken 100 um.

4
. Abbildung 4: Transduktion von Organoiden Verwendung lentivirale Expressionsvektoren Hellfeldbilder (A, C, E, G) und Fluoreszenzbilder (B, D, F, H) von Organoiden, die entweder mit PGK-eGFP Lentivirus transfiziert wurden (A - F) oder steuern Lentivirus (G, (A, B), spinoculation nur (C, D), oder keine weiteren Schritte zur Transduktion Wirksamkeit (E, F) zu erhöhen, im Vergleich zu Vektor transduziert Organoide, die dies nicht tun zu kontrollieren auszudrücken eGFP (G, H). Beachten Sie, dass mit PGK-eGFP lentiviralen Konstrukts, Transduktion Wirksamkeit nicht stark von zusätzlichen Schritte erhöht. Maßstabsbalken 100 um.

Abbildung 5 Abb. 5: Repräsentative Ergebnis RNA Präparationen aus Organoide auf Bioanalyzer Hinweis starke Abgrenzung der Banden, die hohe Integrität der RNA in den Bahnen 2-4 und Abstrich um Bands auf Spuren 5-7, die Log-RNA-Integrität. RNA Integrität Nummer (RIN) der Bänder 2-4 beträgt 8,7, 9,2 und 9, wohingegen ter RIN von Bands 5-7 ist 6.4, 6.6 und 5.5.

Figur 6
Fig. 6: Immunhistochemische Analyse von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Organoiden Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten 4 um Schnitt Organoiden in Gegenwart von BrdU zwei Stunden lang kultiviert und anschließend fixiert. Abschnitt ist mit Anti-BrdU-Antikörper gefärbt. Maßstabsbalken 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Basismedium Zugänge
Zelllinie Kulturmedium DMEM 10% FCS
1% Penicillin / Streptomycin
2 mM Glutamine
Organoide Kulturmedium Erweiterte DMEM F12 HEPES
1% Penicillin / Streptomycin
1x Glutamax
1% N2 Ergänzung
2% B27 Ergänzung
125 nM n-Acetylcystein
Mäuse-EGF (50 ng / ml)
10% nOgh-Fc konditioniertes Medium (äquivalent zu 100 ng / ml)
10% Rspo1-Fc konditioniertes Medium (entsprechend 500 ng / ml)

Tabelle 1: Zusammensetzung des Kulturmediums.

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Discussion

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Das aktuelle Video-Protokoll beschreibt lentivirale Transduktion Organoide von der Grund Darmepithel und nachgelagerten Analyse dieser Organoide mittels quantitativer RNA-Techniken und Immunhistochemie.

Lentivirale Transduktion wird oft in anhaftenden oder schwimmende Zellen in Kulturplatten durchgeführt. Da die dreidimensionale Struktur von Organoiden macht sie schwierig durch virale Partikel eindringen, sind eine Reihe von Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Vorbehandlung der Organoide mit Chir99021 erhöht Verbreitung und damit die Lebensfähigkeit nach Transduktion. Es ist wichtig, kleine Zellcluster nach Trypsinisierung erhalten, da einzelne Zellen überleben verringert. Im Gegensatz zur Virus Transduktionen mit murinen Retrovirus sind lentivirale Transduktionen effizienter und gewöhnlich nicht spinoculation, eine Technik, um Erhöhungen Transduktion Wirksamkeit in ES-Zellen 10 bekannt erfordern. Bei der Verwendung von murinen Retroviren oder when lentivirale Transduktion Renditen niedrig Wirksamkeit kann spinoculation wahlweise eingesetzt werden, um Übertragungsrate zu erhöhen. Wir wissen nicht bewertet regelmäßig Virustiter, da alle verfügbaren Virus von einer einzigen Runde der Produktion für die Weiterleitung von Organoide von maximal zwei 0,95 cm 2 Brunnen abgeleitet verwendet wurde. Zusätzlich verwenden in der Regel Antibiotika-Selektion für die Entfernung von nicht-transduzierten Zellen. Bewertung der viralen Titer kann jedoch der Wert bei Problemen mit Übertragungs Wirksamkeit sein.

Identisch mit adhärenten Zellen kann der Pegel des Selektionsantibiotikum, die Anzahl der viralen Integrationen und dadurch die Expression des Transgens zu erhöhen. Verwenden hochrangigen Puromycin (10 ug / ml) zu hohen Expressions und wirksame Zuschlags erhalten, aber als Organoide zeigen Anzeichen von Toxizität, unteren Ebenen verwendet werden können (mindestens 1 & mgr; g / ml). Zusätzlich können alternative Selektionsantibiotika verwendet werden oder die Auswahl kann weggelassen werden, obwohl Transduktion dürfteunvollständig zu sein, und dies kann nicht langfristig stabile Expression führen. Da ferner lentiviralen Integration in das Genom ist im ganzen eine Population von Zellen heterogenen Expression des Transgens zu Veränderungen nach Züchtung von Zellen für eine längere Zeit zu unterwerfen werden. Dies kann von Selektionsdruck durch die Expression des Transgens führen. Obgleich antibiotische Selektion begrenzt diese Veränderungen können sie bleiben, insbesondere im Fall der konstitutiven Expression von Transgenen. Dieser Nachteil kann durch Clonieren einer einzelnen Zelle von Organoiden überwunden werden, aber diese Technik ist zeitaufwendig. Lentivirale Transduktion kann mit einer Vielzahl von Plasmiden, die entweder stabile oder induzierbare Expression von Transgenen Folge durchgeführt werden. Diese Transgene werden üblicherweise aus ubiquitären Promotoren, wie CMV oder dem PGK-Promotor exprimiert und kann natürliche Expression führen. Ähnlich wie transgene Überexpression in Krebszelllinien und Tiermodellen, ist Vorsicht geboten Interpretation der Ergebnisse herm Überexpression.

Für Experimente, die die RNA erforderlich, die geringe Anzahl von lebensfähigen Zellen, die normalerweise in einer einzigen 0,95 cm 2 und (Standard-Oberfläche von 48-Well) in Gegensatz zu adhärenten Zellen, die leicht in großen Kolben gezüchtet werden können, gewachsen ist der geschwindigkeitsbestimmende Faktor für die Qualität und einer Vielzahl von Downstream-Analyse. Wir finden, dass in der Regel eine einzige Vertiefung etwa 50 ausgewachsene Organoiden Ausbeuten zwischen 0,4 ug und 1 ug Gesamt-RNA ausreichen, quantitative RT-PCR und RNA-Mikroarray, ohne weitere Verstärkung. Bestimmte Behandlungsschemata oder genetische Veränderungen können die RNA-Gehalt deutlich jedoch reduzieren. Ein erster Schritt zur Erhöhung der Gesamt-RNA wird die Bündelung von mehreren Brunnen.

Für Paraffineinbettung von Organoiden, ist es wichtig, genügend Material, um Organoiden während des Prozesses sichtbar erhalten. Die Zugabe von geringen Mengen an Eosin festen Organoide ermöglicht die Visualisierung Organoide während der gesamtenVerfahren, ist aber nicht für normale Einbettung erforderlich und kann weggelassen werden, wenn dieser Schritt stört die weitere Analyse. Üblicherweise haben Paraffineinbettung Kassetten Löchern versehen, um die Strömung von Fixiermittel und Prozesslösungen auf das Gewebe in der Kassette zu ermöglichen.

Lentivirale organoiden Transduktion und Vorbereitung für nachfolgende Standardtechniken erhöht wissenschaftlichen Potential dieser Kulturen und hebt den Standard in der Zellkultur, um dreidimensionale Techniken aus primären Darmepithel. Der Bereich der nachgeschalteten Experimente durchzuführen ist jedoch nicht auf Techniken, die in dem aktuellen Protokoll beschrieben beschränkt und können alle Techniken, die auf Zelllinien oder Mäusen umfassen, da die Menge des Zellmaterials von der Kultur erzeugten ausreicht. In der Forschung auf bestimmten genetischen Elemente und ihre Funktion im Darmepithel, homologe Rekombinationstechniken in Tiermodellen, insbesondere Mäuse, bleiben der Goldstandard. Kulturen Organoide tunnicht enthalten mesenchymale oder immunologische Nischenzellen und kultivierte Krypten werden immer größer, Gegenüberstellung der Situation in vivo gefunden. Dennoch haben diese Kulturen, die Qualität der in-vitro-Ergebnisse stark erhöht und unter Berücksichtigung der Vielzahl nachgeschaltete Techniken, die durchgeführt werden können, hat organoide Kultur und ermöglicht eine wesentlich bessere Forschung über das Darmepithel.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polyethylene imine Polysciences 23966-2
DMEM medium Lonza BE12-614F
Fetal calf serum Lonza DE14-801F
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Glutamin Invitrogen 25030-024
matrigel BD BD 356231
Advanced DMEM-F12 Gibco 12634-010
N2 Invitrogen 17502-048
B27 Invitrogen 17504-044
N-acetyl cysteine Sigma A9165-1G
mouse Egf Invitrogen PMG8045
Hepes 1 M Invitrogen 15630-056
glutamax 100x Invitrogen 35050-038
Chir 99021 Axon 1386
Y27632  Sigma Y0503-5MG
polybrene Sigma 107689
nicotinamide Sigma N0636
Trypsin Lonza BE02-007E
puromycin Sigma P 7255
Rneasy mini kit Qiagen 74106
β-mercaptoethanol Merck 8,057,400,250
Ovation Pico WTA system NuGen 3300-12
paraformaldehyde Sigma 252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml VWR LSUKM12
Eosin Yellowish VWR 1,159,350,025

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References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
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  3. Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303, (5664), 1684-1686 (2004).
  4. Zhao, J., et al. R-spondin1, a novel intestinotrophic mitogen, ameliorates experimental colitis in mice. Gastroenterology. 132, (4), 1331-1343 (2007).
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  6. Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9, (1), 81-83 (2012).
  7. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Rep. 3, (4), 1128-1139 (2013).
  8. Roe, T., Reynolds, T. C., Yu, G., Brown, P. O. Integration of murine leukemia virus DNA depends on mitosis. The EMBO Journal. 12, (5), 2099-2108 (1993).
  9. Lau, W., et al. Lgr5 homologues associate with Wnt receptors and mediate R-spondin signalling. Nature. 476, (7360), 293-297 (2011).
  10. Bahnson, A. B., et al. Centrifugal enhancement of retroviral mediated gene transfer. Journal Of Virological Methods. 54, (2-3), 131-143 (1995).
Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide
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Cite this Article

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).More

Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (98), e52531, doi:10.3791/52531 (2015).

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