Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Раки прогрессирующих заболеваний отмечены накоплением патологических мутаций, делеций и прибыли хромосом с течением времени. Эти генетические аномалии могут влиять несколько клеточные процессы, начиная от клеточного цикла, клеточной гибели, энергетический метаболизм и сборки цитоскелета, чтобы подчеркнуть реакции, такие как гипоксии. Таким образом, канцерогенез отражает коллективные действия нескольких генетических аберраций по всему спектру биологических процессов. Последние интегративные геномные научно-исследовательские работы, в том числе весь секвенирование генома, ExoME последовательности, направленной последовательности, глубокой последовательности и генома исследования ассоциации, определили рост числа новых генетических изменений во всех существу типов опухолей ^1-4. Во многих случаях, генетические повреждения происходят вместе в неслучайной образом ^5-8, что свидетельствует об их сотрудничество в патогенезе заболевания. Пройдя онкогенных роли большого массива аберрантно экспрессируются гены в результате Fрум эти геномные повреждения необходимо разработать новые терапевтические стратегии и понять ответов опухолевых клеток к этим агентам, но это оказалось сложной задачей, требующей очень надежные модели животных систем для проведения высокой пропускной функциональной геномного анализа в VIVO.

Хотя млекопитающие, особенно грызуны, являются предпочтительными модели в биологии рака, данио начал привлекать большое внимание. Костистых данио (Dario rerio) был использован в качестве модельного организма для изучения развития с 1960 года и впервые был применен к изучению патогенеза опухолей в 1982 году ^9-11. Простота обслуживания, малого размера тела и высокой плодовитостью сделать данио надежную модель для крупномасштабных вперед генетических экранов для выявления мутаций, которые придают аномальные и патологические фенотипы ^10. Оптической прозрачности данио эмбрионов Еще одной ключевой особенностью поддержку более широкого использования этой модели рака, аэто позволяет в естественных изображений, которые будут проводиться, чтобы найти развитие опухоли в режиме реального времени ^9, приложение, которое довольно сложно грызунов ^12. Недавний анализ сравнительной геномике данио референсный геном (Zv9) показал, 26206 белок-кодирующих генов, с 71% из них человека ортологи, из которых 82% соотнесены с генами, ассоциированных с заболеваниями в онлайн Законы Менделя в Man (OMIM) базы данных ^{13, 14.} Следовательно, данио был использован для моделирования различных типов рака человека, в том числе ⁸ нейробластомы, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) ^{15,16, 17,18} меланомы, саркомы Юинга ^19, рабдомиосаркома ^20,21, карциномы поджелудочной железы ^22, гепатоцеллюлярной карциномы ²³ и миелоидный злокачественных опухолей ^24,25, и была выбрана в качестве модели рака для ксенотрансплантации изучает ^11,26.

Стабильный трансгенныхподход у рыбок данио часто используется для изучения влияния амплитудно-оф-функции генов в нормальном развитии или патогенеза заболевания ^27,28. Для разработки такой модели (фиг.1А), один вводит конструкцию ДНК, содержащую ген интерес обусловлен тканеспецифического промотора в эмбрионы дикого типа один-клеток. Три-четыре месяца после инъекции, когда введенный эмбрионы достигают половой зрелости, они ауткроссной дикого типа рыбы для выявления тех, показывающих интеграции ДНК-конструкции в их зародышевой линии, которые лицензируются их как основателя рыбы. Многие факторы, такие как число копий и интеграции сайта трансгена, влияет на экспрессию трансгена в стабильных трансгенных линий. Таким образом, разработка трансгенного модели опухоли, несколько стабильных трансгенных линий экспрессирующих онкоген единого должны быть сгенерированы первым и подвергают скринингу на линии, экспрессирующих трансген на уровне, что может привести к индукции опухолей. Однако, если избыточная экспрессия кандидата Oncogene является токсичным для половых клеток, трудно генерировать стабильный трансгенной линии непосредственно с гиперэкспрессией трансген ^29. Таким образом, этот подход может быть трудоемким, с высоким риском неудачи создать подходящую модель рака.

Здесь мы покажем альтернативную стратегию, основанную на мозаика переходный трансгенеза (рис 1б), что обеспечивает уникальные преимущества по сравнению с традиционными стабильной трансгенеза для функционального геномного исследования в естественных условиях. При таком подходе один или более трансгенные конструкты вводятся в стадии один-клеток трансгенных или дикого типа эмбрионов. Инъецированные конструкции ДНК, содержащие трансгены, то мозаично и случайным образом объединены в первичном впрыскиваемого рыбы, в результате чего смешанных генотипов в пределах нескольких клеточных популяций в отдельных рыб ^30. Кроме того, совместной инъекции многократного ДНК-конструкций в эмбрионах один-клеток приводит к интеграции совместно в одной и той же клетке в случайных местах, позволяя один, чтобы TRAсе клетки с экспрессией трансгенов и исследовать взаимодействия различных генов во время патогенеза заболевания в мозаичных животных ^31. В качестве доказательства принципе, мы временно сверхэкспрессируется мутационно активированный алк (F1174L) с гена-репортера mCherry в периферической симпатической нервной системы (PSNS) под контролем допамина бета-гидроксилазы (d βh), промотор дикого типа рыбы и трансгенных рыб с гиперэкспрессией MYCN. ALK, который кодирует рецептор тирозинкиназы, является наиболее часто мутированным геном в нейробластомы высокого риска ^5-7,32,33. алк (F1174L), в качестве одного из наиболее частых и сильных соматических мутаций активации, является чрезмерно представлены в MYCN- усиливается пациентов нейробластомы высокого риска, а синергетический эффект с MYCN гиперэкспрессией ускорить нейробластомы туморогенез в обоих стабильных трансгенных мышей и трансгенных данио моделей ^8,34,35. По мозаикипереходный сверхэкспрессия алк (F1174L) с mCherry в MYCN трансгенной рыбы, мы воспроизводятся ускорение начала опухоли наблюдалось в стабильной гиперэкспрессией трансгенных рыб как алк (F1174L) и MYCN, предполагая, что мозаики стратегия трансгенез могут быть использованы, чтобы быстро и эффективно оценить относительный вклад нескольких онкогенов в инициации опухоли в естественных условиях.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все данио исследования и содержанием животных были проведены в соответствии с Mayo Clinic Институт IACUC утвержденных протокол № A41213. 1. ДНК-конструкции для Трансгенез Амплификации 5,2 т.п.н. допамина бета-гидроксилазы (d βh) промоторной области 8 с пом?…

Representative Results

Для исследования ли избыточная экспрессия мутационно активированного ALK F1174L или дикого типа ALK могли бы сотрудничать с MYCN индукции нейробластомы, мы сверхэкспрессируется либо активированного человеческого ALK или дикого типа человека ALK под контролем d βh п?…

Discussion

В этом представительном исследовании мы использовали переходный соинжекцию и экспрессии, активированного ALK с геном-репортером mCherry в MYCN экспрессирующие трансгенных рыб, чтобы показать, что эти гены сотрудничать заметно ускорить начало нейробластомы, в соответствии с н…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number
Expand Long Template PCR System	Roche Applied Science, IN	11681834001
pCR-TOPO vector	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix	Invitrogen, CA	11789-020
GC-RICH PCR System	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope	Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera	Nikon, NY