Summary

Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Published: March 31, 2015
doi:

Summary

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Abstract

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic “drivers” among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

Introduction

Раки прогрессирующих заболеваний отмечены накоплением патологических мутаций, делеций и прибыли хромосом с течением времени. Эти генетические аномалии могут влиять несколько клеточные процессы, начиная от клеточного цикла, клеточной гибели, энергетический метаболизм и сборки цитоскелета, чтобы подчеркнуть реакции, такие как гипоксии. Таким образом, канцерогенез отражает коллективные действия нескольких генетических аберраций по всему спектру биологических процессов. Последние интегративные геномные научно-исследовательские работы, в том числе весь секвенирование генома, ExoME последовательности, направленной последовательности, глубокой последовательности и генома исследования ассоциации, определили рост числа новых генетических изменений во всех существу типов опухолей 1-4. Во многих случаях, генетические повреждения происходят вместе в неслучайной образом 5-8, что свидетельствует об их сотрудничество в патогенезе заболевания. Пройдя онкогенных роли большого массива аберрантно экспрессируются гены в результате Fрум эти геномные повреждения необходимо разработать новые терапевтические стратегии и понять ответов опухолевых клеток к этим агентам, но это оказалось сложной задачей, требующей очень надежные модели животных систем для проведения высокой пропускной функциональной геномного анализа в VIVO.

Хотя млекопитающие, особенно грызуны, являются предпочтительными модели в биологии рака, данио начал привлекать большое внимание. Костистых данио (Dario rerio) был использован в качестве модельного организма для изучения развития с 1960 года и впервые был применен к изучению патогенеза опухолей в 1982 году 9-11. Простота обслуживания, малого размера тела и высокой плодовитостью сделать данио надежную модель для крупномасштабных вперед генетических экранов для выявления мутаций, которые придают аномальные и патологические фенотипы 10. Оптической прозрачности данио эмбрионов Еще одной ключевой особенностью поддержку более широкого использования этой модели рака, аэто позволяет в естественных изображений, которые будут проводиться, чтобы найти развитие опухоли в режиме реального времени 9, приложение, которое довольно сложно грызунов 12. Недавний анализ сравнительной геномике данио референсный геном (Zv9) показал, 26206 белок-кодирующих генов, с 71% из них человека ортологи, из которых 82% соотнесены с генами, ассоциированных с заболеваниями в онлайн Законы Менделя в Man (OMIM) базы данных 13, 14. Следовательно, данио был использован для моделирования различных типов рака человека, в том числе 8 нейробластомы, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) 15,16, 17,18 меланомы, саркомы Юинга 19, рабдомиосаркома 20,21, карциномы поджелудочной железы 22, гепатоцеллюлярной карциномы 23 и миелоидный злокачественных опухолей 24,25, и была выбрана в качестве модели рака для ксенотрансплантации изучает 11,26.

Стабильный трансгенныхподход у рыбок данио часто используется для изучения влияния амплитудно-оф-функции генов в нормальном развитии или патогенеза заболевания 27,28. Для разработки такой модели (фиг.1А), один вводит конструкцию ДНК, содержащую ген интерес обусловлен тканеспецифического промотора в эмбрионы дикого типа один-клеток. Три-четыре месяца после инъекции, когда введенный эмбрионы достигают половой зрелости, они ауткроссной дикого типа рыбы для выявления тех, показывающих интеграции ДНК-конструкции в их зародышевой линии, которые лицензируются их как основателя рыбы. Многие факторы, такие как число копий и интеграции сайта трансгена, влияет на экспрессию трансгена в стабильных трансгенных линий. Таким образом, разработка трансгенного модели опухоли, несколько стабильных трансгенных линий экспрессирующих онкоген единого должны быть сгенерированы первым и подвергают скринингу на линии, экспрессирующих трансген на уровне, что может привести к индукции опухолей. Однако, если избыточная экспрессия кандидата Oncogene является токсичным для половых клеток, трудно генерировать стабильный трансгенной линии непосредственно с гиперэкспрессией трансген 29. Таким образом, этот подход может быть трудоемким, с высоким риском неудачи создать подходящую модель рака.

Здесь мы покажем альтернативную стратегию, основанную на мозаика переходный трансгенеза (рис 1б), что обеспечивает уникальные преимущества по сравнению с традиционными стабильной трансгенеза для функционального геномного исследования в естественных условиях. При таком подходе один или более трансгенные конструкты вводятся в стадии один-клеток трансгенных или дикого типа эмбрионов. Инъецированные конструкции ДНК, содержащие трансгены, то мозаично и случайным образом объединены в первичном впрыскиваемого рыбы, в результате чего смешанных генотипов в пределах нескольких клеточных популяций в отдельных рыб 30. Кроме того, совместной инъекции многократного ДНК-конструкций в эмбрионах один-клеток приводит к интеграции совместно в одной и той же клетке в случайных местах, позволяя один, чтобы TRAсе клетки с экспрессией трансгенов и исследовать взаимодействия различных генов во время патогенеза заболевания в мозаичных животных 31. В качестве доказательства принципе, мы временно сверхэкспрессируется мутационно активированный алк (F1174L) с гена-репортера mCherry в периферической симпатической нервной системы (PSNS) под контролем допамина бета-гидроксилазы (d βh), промотор дикого типа рыбы и трансгенных рыб с гиперэкспрессией MYCN. ALK, который кодирует рецептор тирозинкиназы, является наиболее часто мутированным геном в нейробластомы высокого риска 5-7,32,33. алк (F1174L), в качестве одного из наиболее частых и сильных соматических мутаций активации, является чрезмерно представлены в MYCN- усиливается пациентов нейробластомы высокого риска, а синергетический эффект с MYCN гиперэкспрессией ускорить нейробластомы туморогенез в обоих стабильных трансгенных мышей и трансгенных данио моделей 8,34,35. По мозаикипереходный сверхэкспрессия алк (F1174L) с mCherry в MYCN трансгенной рыбы, мы воспроизводятся ускорение начала опухоли наблюдалось в стабильной гиперэкспрессией трансгенных рыб как алк (F1174L) и MYCN, предполагая, что мозаики стратегия трансгенез могут быть использованы, чтобы быстро и эффективно оценить относительный вклад нескольких онкогенов в инициации опухоли в естественных условиях.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все данио исследования и содержанием животных были проведены в соответствии с Mayo Clinic Институт IACUC утвержденных протокол № A41213. 1. ДНК-конструкции для Трансгенез Амплификации 5,2 т.п.н. допамина бета-гидроксилазы (d βh) промоторной области 8 с пом?…

Representative Results

Для исследования ли избыточная экспрессия мутационно активированного ALK F1174L или дикого типа ALK могли бы сотрудничать с MYCN индукции нейробластомы, мы сверхэкспрессируется либо активированного человеческого ALK или дикого типа человека ALK под контролем d βh п?…

Discussion

В этом представительном исследовании мы использовали переходный соинжекцию и экспрессии, активированного ALK с геном-репортером mCherry в MYCN экспрессирующие трансгенных рыб, чтобы показать, что эти гены сотрудничать заметно ускорить начало нейробластомы, в соответствии с н…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We appreciate Dr. Jeong-Soo Lee for sharing the Tg(dbh:EGFP-MYCN) transgenic fish with us in our study. This work was supported by a grant 1K99CA178189-01 from the National Cancer Institute, a fellowship from the Pablove Foundation and the Friends for Life, and young investigator awards from the Alex’s Lemonade Stand Foundation and the CureSearch for Children’s Cancer Foundation.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10 (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459 (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130 (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455 (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14 (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496 (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299 (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18 (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15 (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5 (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21 (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134 (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9 (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155 (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27 (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7 (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2 (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13 (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455 (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. , (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22 (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126 (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6 (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1 (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11 (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14 (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).

Play Video

Cite This Article
Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

View Video