Summary
Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.
Introduction
Los modelos de ratón de desmielinización, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) y la infección intracraneal con virus de la hepatitis del ratón neuroadapted (MHV), son excelentes herramientas para estudiar las vías moleculares y las interacciones celulares asociados con la enfermedad. Han liderado y apoyado la eficacia de las terapias farmacéuticas aprobado por la FDA, destinado principalmente a la cesación de la autoinmunidad y la inflamación 1. Sin embargo, una vez que la remielinización endógena ha fracasado, las terapias aprobadas actualmente no reparan efectivamente lesiones de desmielinización en el sistema nervioso central. Por lo tanto, las terapias de reparación centrada en esta etapa de la enfermedad son fundamentales para el alivio de los síntomas crónicos y mejora de la calidad de vida. Recientemente, las células precursoras neuronales (CPN) han venido a la vanguardia como una modalidad terapéutica potencial regenerativo de las zonas de inflamación y desmielinización objetivo. Varios estudios han puesto de manifiesto la capacidad de los NPCs para inducir endogenonos remielinización y participar directamente en la remielinización 2-8. Debido NPCs están involucrados en la remielinización directa, es imprescindible entender su cinética y las interacciones con las células endógenas después del trasplante. Después del trasplante, NPCs migran ventralmente a áreas de daño de la sustancia blanca, entonces rostral y caudal en relación con el sitio de trasplante de 5,9. La cinética de la migración difieren en respuesta a señales ambientales; NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada no tienen mayores velocidades que los NPCs trasplantadas en una médula espinal dañada 6. Después de un período migratorio, transferidos NPC proliferan extensamente, a una tasa superior en un cable dañado la médula relativa a una médula espinal intacta 6. Por último, la mayoría de los NPC diferenciarse en oligodendrocitos e iniciar 4,6,9 remielinización directa.
La lesión desmielinizada es complejo y puede incluir una población diversa de células en diversas etapas de unactivation. Por ejemplo, una lesión activa la esclerosis múltiple (MS) puede incluir una importante población de células T activadas, microglia y macrófagos M1 M1, pero una lesión MS silenciosa crónica puede estar compuesto principalmente de los astrocitos reactivos con pocas células inflamatorias 10-13. Debido a la diversidad de las células efectoras, de dos fotones (2P) de imágenes en modelos de ratón de la desmielinización es una herramienta extremadamente útil para ayudar a entender las interacciones celulares locales dentro de la lesión. En muchos modelos de investigación MS utilizados ampliamente MS y, la mayoría de las lesiones se localizan en el lado ventral de la médula espinal, una región inaccesible para formación de imágenes 2P intravital debido a la profundidad de la lesión y el alto contenido de lípidos de la médula espinal. Para evitar estos problemas y de las interacciones célula-célula estudio dentro de las lesiones de la médula espinal ventral, hemos desarrollado un sencillo preparación imágenes in vivo 2P 6 ex.
Este estudio da seguimiento a una publicación métodos anteriores, que mostróel procedimiento para el trasplante de proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) NPC que expresaban en la médula espinal de ratones después de JHMV cepa de desmielinización inducida por MHV 14. Cinco semanas de edad ratones están infectados con JHMV y trasplantados con eGFP-NPCs a nivel torácico 9 en el día 14 después de la infección. El protocolo que aquí se presenta ofrece los pasos detallados sobre cómo extraer la médula espinal, hacer una preparación ex vivo de agarosa, y de imagen trasplantado interacciones eGFP-NPC con proteína mejorada amarillo fluorescente (eYFP) axones que expresaban. Los ratones que expresan eYFP bajo el promotor Thy1-neuronal específica se utilizaron en este procedimiento 15. Sólo algunos de los axones expresan eYFP, lo que es útil para obtener imágenes de los axones individuales. Aquí mostramos las médulas espinales retirados a los 7 días post-trasplante; sin embargo, las médulas espinales se pueden extraer en cualquier punto de tiempo después del trasplante. Mientras que mostramos interacciones de NPC con axones dañados, nuestro protocolo se puede utilizar en combinación con marcadores fluorescentes genéticosde otros tipos de células para investigar una multitud de interacciones celulares que se producen en toda la médula espinal de ratón.
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Protocol
Declaración de Ética: NOTA: El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Cuidado y Uso de Animales Comité Institucional (IACUC) de la Universidad de California, Irvine, protocolo # 2010-2943.
1. La eliminación de la médula espinal
- Coloque toallas de papel humedecidas con isoflurano líquido ~ 100%, USP en cámara de la eutanasia y colocar toallas de papel secas en la parte superior. Coloque el ratón en la cámara encima de las toallas de papel secas así ratón no está tocando el isoflurano y asegúrese de que la cámara se cubre. Espere al menos un minuto después de la interrupción de la respiración para asegurarse de que el ratón es sacrificado.
- Realizar una transección de la médula del cuello para asegurar el ratón es sacrificado. No realice una luxación cervical ya que esto podría dañar la médula espinal.
- Pulverizar el ratón con etanol al 70% para mojar el cabello.
- Utilice tijeras finas afilados para quitar el pelo y la piel de la parte posterior del ratón para exponer la columna vertebral cervical de la lámina de aproximadamente 1 (C1) A la lámina sacral 4 (S4).
- Usando un escalpelo con una cuchilla # 10, hacer incisiones a la izquierda y derecha de la columna vertebral para separarlo de músculo y grasa. Esto hará que la eliminación de la médula espinal mucho más fácil.
- opcional: a curvas rongeurs Luer se pueden utilizar para recoger distancia carne adicional.
- Mientras sujeta la parte superior de la columna vertebral con pinzas dentadas Graefe, inserte titanio curvado tijeras Vannas con la parte curvada hacia arriba en la columna vertebral expuesta en C1, teniendo cuidado de no tocar la médula espinal.
- Deslice el titanio curvadas tijeras Vannas todo el camino a la derecha y hacer un pequeño corte. Un sonido crunch pequeña debe ser oído y sintió como las tijeras cortan las vértebras. Repita este corte en el extremo izquierdo de la cuerda. Tenga cuidado de no ir demasiado rápido o hacer demasiado grande de un corte como este se arriesgará a dañar el cable con las tijeras.
- La única lámina debe ser capaz de ser levantado con las pinzas una vez que se cortan los lados de las vértebras. REPEAT este paso para cada lámina hasta S4, sin dejar de sujetar y tirar de las vértebras de la médula espinal.
NOTA: las vértebras por encima del sitio de trasplante probablemente saldrá una vez que se corta al sitio de trasplante. Continuar el procedimiento comenzando justo debajo del sitio de trasplante. - opcional: sentar las vértebras hacia abajo para ver donde el sitio de trasplante es y medir y cortar ~ 20 mm rostral y caudal al sitio de trasplante.
NOTA: Cuando el trasplante NPCs más no serán necesarios como los NPCs trasplantados generalmente no migran más de 15 mm. La cantidad de la médula espinal necesaria dependerá de experimento y de migración características de tipo celular trasplantado. Para hacer cortes rostral y caudal que son equidistantes al sitio de trasplante le permitirá al centro de trasplante que se encuentra más fácilmente durante la exploración. - Con un bisturí con una hoja # 11 Corte cuidadosamente los ganglios de la derecha y la izquierda de la cara ventral de la médula espinal a partir de finales rostral. Esta wenfermo permitir la médula espinal para ser removido de las vértebras ventral más fácilmente.
NOTA: Hecho rápidamente (pasos 1.7 a 1.11), la médula espinal no se seque. Sin embargo, 1x PBS se puede administrar a la cuerda para mantenerlo húmedo. - Invierta el ratón y mantenga pulsado el ratón hacia arriba por lo que la médula espinal se encuentra hacia abajo. Retire con cuidado la médula espinal utilizando pinzas dentadas Graefe cerrados. Sin mellar la médula espinal, cortar cuidadosamente cualquier ganglios restantes para permitir la médula espinal para ser levantado en una sola pieza intacta.
- Asegúrese de que la médula espinal es en RPMI-1640 y colocarlo en hielo durante el transporte al microscopio 2P.
2. Preparación de la médula espinal de la Imagen
- Incorporación de la médula espinal en agarosa
- Mantenga la médula espinal aislada en RPMI-1640 enfriado en hielo antes de la imagen.
- Pesar de agarosa (baja temperatura de gelificación) y preparar una solución al 5% en 5 ml de PBS 1x. Microondas la solución de agarosa al 5% durante 15 s para disolver el agsurgió y dejar enfriar la disolución a 37 ° C.
- Preparar la médula espinal, colocándolo en una hoja de Parafilm con la cara ventral hacia arriba.
- Pipetear aproximadamente 5 ml de solución de agarosa al 5% sobre el lado ventral de la médula espinal. Deje que la agarosa solidifique por enfriamiento a temperatura ambiente. Solidificación completa tarda aproximadamente 5 minutos.
- Aplique una ligera capa de adhesivo tisular a un 22 mm tapa cuadrada de deslizamiento.
- Invierta la médula espinal incrustado, colocando la cara ventral de Parafilm. El lado dorsal será ahora hacia arriba. Pegue la hoja de la cubierta de la parte dorsal, y sumerja la preparación de la suspensión de agarosa incrustada médula espinal / cubierta en RMPI para solidificar el adhesivo. Eliminar el exceso de agarosa se solidifica utilizando una hoja de afeitar.
- Montaje de la médula espinal en la platina del microscopio
- Aplique vaselina en la parte inferior de la hoja de la cubierta. Esto estabilizará la preparación durante la perfusión.
- Coloque la preparación de la médula espinal en unaobtener imágenes bien en la platina del microscopio con la parte ventral hacia arriba hacia el objetivo de inmersión 25X. El pozo de imagen hecha a la medida es de aproximadamente 20 mm de profundidad, 50 mm de largo y 50 mm de diámetro.
- Image mientras superfusión la preparación con calentado (37 ° C), oxigenada (95: 5 de oxígeno: dióxido de carbono carbógeno) medio RPMI-1640 sin suero.
- Medios Pre-caliente hasta 37 ° C en el baño de agua y conéctelo a la bomba de tubería mediante la inserción de la tubería en la botella de los medios de comunicación.
- Conserve la temperatura del medio a 37 ° C un dispositivo calentador en la conexión de la tubería a la cámara. Medios de comunicación a través de superfuse bien en 3 ml / min usando un tubo conectado a la bomba de tubería (Figura 1B).
3. 2P Imaging de la médula espinal ventral
- Configuración Microscopio
- Adquirir imágenes desde Thy1-EYFP médula espinal utilizando un Ultra Ti Camaleón: Sapphire láser sintonizado a 900 nm. Atenuar la potencia del láser en elespécimen a <5% para asegurar un mínimo de fototoxicidad 16. Mantener la temperatura por perfusión perfundido en oxígeno RPMI-1640 en una constante 37 ° C utilizando un único calentador de solución en línea para asegurar la formación de imagen estable, y para prevenir la deriva del tejido y daño celular.
- Para separar la señal fluorescente eGFP y eYFP, coloque una nm dicroico 520 de un solo filo y un solo filo nm divisor de haz dicroico 560 en serie para separar 2P emisión a tres canales, a propósito de dividir la emisión verde para mejorar la visibilidad.
NOTA: Estos canales se conocen como azul-verde (emisión <520 nm), verde-amarillo (520-560 nm) y rojo (emisión> 560 nm). Tubos fotomultiplicadores detectan emiten luz en cada canal.
- Localización de áreas de imagen de interés
- Usando el ocular y una fuente de luz de campo claro, se centran el objetivo de inmersión en el borde ventral de la médula espinal para establecer un punto de referencia.
- Haz fuente de luz ambiente seguro está apagado y swprurito de 2P excitación abriendo el obturador de láser.
- Si está disponible, en la búsqueda de tejidos para las áreas de interés, use un ajuste de resolución más baja, mayor volumen sin zoom digital, y una mayor velocidad de barrido que cuando la adquisición de las imágenes finales. La configuración típica con este sistema en la búsqueda de tejidos para una región de interés son: la resolución: 256 píxeles; volumen: x = 600 m, y = 600 m, z = 0 a 300 micras.
- Observar los axones EYFP cerca del borde ventral de la médula espinal. Señal armónica Segundo de colágeno (azul) será más brillante en el borde del tejido de la médula espinal. Ubicar los axones EYFP sólo dorsal a la segunda señal armónica de la señal de colágeno y eYFP se visualiza en el canal de color amarillo-verde.
- Localizar el sitio de trasplante en el centro longitudinal de la preparación de la médula espinal 14. Para los ratones 1 día siguiente eGFP-NPC trasplante, localizar el sitio del trasplante, centrándose la trayectoria del haz en el plano z profundamente en el tejido. El wi sitio trasplantell variar ligeramente entre los animales, pero en general se encuentra ~ 200 m desde el borde ventral. Observar los racimos de eGFP-NPC en los tractos de sustancia blanca, más cerca de los bordes ventrales y laterales en ratones después de 1 día post-trasplante.
- La adquisición de imágenes finales
- Adquirir resolución de imagen de 512 píxeles; volumen: x = 270 m, y = 212 m, y z = 100 micras utilizando software Slidebook 6. Compilar z-pilas mediante la adquisición de planos focales secuenciales en 2,5 micras incrementos.
- Realizar un análisis bidireccional con el offset para garantizar la rápida cuantificación de cualquier objeto que migran en la médula espinal entrelazado apropiado. Asegúrese de que la velocidad de fotogramas adquisición ideal para determinar la velocidad del celular dentro de la médula espinal es de aproximadamente 1 fotograma / seg.
NOTA: Los ajustes de imagen se pueden cambiar las preferencias de usuario individuales, tales como la velocidad de fotogramas adquisición, resolución de imagen y volúmenes de imágenes. Volúmenes de imágenes más grandes por lo general tardan más en adquirir a un givresolución en. - Analizar, cultivos, lisa, y pseudocolor archivos de imagen Slidebook con software de análisis de imágenes, tales como Bitplane Imaris 7.7. Producir vídeos finales de lapso de tiempo peinando volúmenes consecutivos de imagen utilizando un proceso automatizado en Slidebook y Imaris.
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Representative Results
Aunque el protocolo de formación de imágenes de la médula espinal explantado se puede utilizar para visualizar cualquier fluorescencia dentro de la médula espinal, nuestros resultados representativos demuestran interacciones eGFP-NPC con EYFP-axones. En primer lugar, se muestra la preparación de la médula espinal ventral incrustado en la Figura 1A. A continuación, se muestra la configuración 2P microscopio y componentes clave en la Figura 1B. La Figura 2 demuestra eGFP y eYFP fluorescencia en una sola z-pila dentro de la médula espinal ventral. Adquisición de consecutivos z-pilas puede ser compilado para producir vídeos time-lapse de analizar la dinámica celular en tiempo real en el tejido intacto. El uso de un nm dicroico 520 de un solo filo y 560 nm de un solo filo divisor de haz dicroico, como se señala en el protocolo, puede separar eGFP y eYFP señal. Los canales individuales se pueden pseudocoloreada utilizando un software de imagen verde y amarillo.
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Figura 1: La columna vertebral y configuración microscopio. (A) A la médula espinal incrustado en un gel de agarosa al 5% (izquierda) y montado sobre un cubreobjetos después de la eliminación del exceso de agarosa (derecha). (B) Una imagen de la configuración de microscopio con componentes fundamentales etiquetadas. 1. baño de agua a 37 ° C. 2. Pre-calienta RPMI-1640. 3. C / L bomba de tubería de velocidad variable. 4. Individual calentador de solución en línea. 5. Objetivo de inmersión. 6. Termómetro digital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen de ejemplo 2P adquirido en la médula espinal ventral reconstrucciones en 3D de la parte ventral de una no infectada, no dañado (A) e infectado-JHMV, desmielinizada (B) de la médula espinal.de un ratón Thy1-eYFP después del trasplante con CPN-etiquetados eGFP. Axones marcados con fluorescencia, se pseudocoloreada amarillo y NPCs se pseudocoloreada verde. Resolución de la imagen: 512 píxeles; volumen de la imagen: (A) x = 239 micras, y = 259 m, z = 65 m construidos usando 26 z-pilas separadas 2,5 m de distancia y (B) x = 497 m, y = 389 m, z = 127,5 m construidos usando 51 z-pilas separadas 2,5 m de distancia.
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Discussion
En tiempo real se requiere 2P imágenes de tejido intacto para investigar la cinética de la APN y las interacciones tras el trasplante en el ratón desmielinizada médula espinal. Intravital de imágenes 2P se utiliza comúnmente para determinar la dinámica celular en el lado dorsal de la médula espinal en ratones vivos, y ha sido utilizado para estudiar la desmielinización dorsal en enfermedad desmielinizante 17-19. Sin embargo, debido NPC trasplantados migran a la materia blanca ventral, que se encuentra demasiado profundo para imagen in situ utilizando microscopía 2P, una preparación ex vivo es necesaria. Esta metodología se ha utilizado en nuestro laboratorio para determinar la motilidad y remielinización cinética de NPCs trasplantadas en la médula espinal dañada no dañado y 6. Ex preparaciones in vivo permiten la exploración de la médula espinal no sólo en sentido longitudinal, sino también transversalmente desde la parte ventral 6,20 . Esto permite el análisis de las diferencias en el movimiento celular (velocidad y dirección) y las interacciones en el transplant sitio, adyacente al sitio de trasplante, y a varias distancias desde el sitio de trasplante 6. Considerando que inicialmente ideado esta preparación a la imagen trasplantado eGFP-CPN en el lado ventral de la médula espinal, que puede ser utilizado a una imagen marcada con fluorescencia o célula teñida de la ventral, dorsal, o en los lados laterales mediante la alteración de la orientación de la médula espinal es montado. Los beneficios de esta preparación sobre la imagen intravital incluir lo que permite modelar la parte ventral y que carecen de la necesidad de anestesia y cirugía de supervivencia, que todavía se necesita con los nuevos preparados intravitales utilizando una configuración de "ventana de cristal" que permiten múltiples sesiones de formación de imágenes sin cirugías repetidas 19,21 . Cabe señalar que una limitación de este procedimiento en comparación con el enfoque de "ventana de cristal 'en combinación con intravital de imágenes es la incapacidad para obtener múltiples puntos de tiempo a partir de un solo ratón, ya que se elimina la médula espinal y el ratón es sacrificado.
Imágenes 2P es ideal para resolver la dinámica de las células individuales dentro de tejidos intactos 22,23. 2P de excitación utiliza fotones del infrarrojo cercano que permiten durante largos períodos de formación de imágenes de tejido profundo con fototoxicidad mínima. 2P de excitación se produce tras la absorción simultánea de dos fotones por un fluoróforo. La alta concentración de fotones necesarios para 2P de excitación se consigue mediante la compresión espacio-temporal de la salida del láser 2P en un solo plano focal. Esto restringe de excitación fluorescente para el punto focal, minimizando aún más fototoxicidad en las regiones de la médula espinal fuera del plano focal. Fotones del infrarrojo cercano también han reducido la dispersión, lo que permite formación de imágenes de hasta aproximadamente 300 micras desde el lado ventral de la médula espinal 16.
Como con cualquier nueva técnica, sin embargo, 2P imágenes de la médula espinal explantada tiene limitaciones que deben ser tenidas en cuenta. Este protocolo de imágenes utiliza un dichro 520 nmespejo ic que permite la separación de eGFP y eYFP fluorescencia desviando emisión eGFP en el canal fluorescente normalmente reservado para la luz azul. Generación de segundo armónico creado por colágeno en la médula espinal también aparece en el canal azul, pero se distingue fácilmente de células marcadas con eGFP que son significativamente más brillante en esta preparación, y tienen una porción de su emisión identificable en el canal verde-amarillo como colágeno no lo hace. Esta técnica de mezcla de canal y separación de las diferentes porciones de un espectro de emisión usando dicroicos específicos a menudo es útil para la identificación visual o automatizado de fluoróforos individuales con cerca o casi solapamiento espectros de emisión. La fototoxicidad es otra limitación de este protocolo de imágenes 2P. Las células dentro de un solo volumen las imágenes son sensibles a la fototoxicidad; por lo tanto, experimentador debe ser muy consciente de los signos de fototoxicidad. La fototoxicidad es típicamente primera evidente en la reducción o falta de célulasmotilidad, seguido por photobleaching y / o cambios morfológicos en los tejidos locales. Hay varios factores que pueden dañar el tejido que lleva a la fototoxicidad o haciéndola inadecuada para imágenes de células vivas. Es crítico para controlar la potencia del láser y la temperatura y oxigenación de la RPMI-1640 perfundido. También es imprescindible para asegurar la eliminación adecuada de la médula espinal desde el ratón sin estirar o comprimir excesiva de la médula espinal y sin cortar la médula espinal con las cuchillas. Si se utiliza correctamente, la preparación de la médula espinal explantada seguirá siendo viable para hasta diez horas, según lo determinado por la motilidad celular sólida dentro de la médula espinal ventral sin disminución a las diez horas después de la extracción. Una variedad de tejido extraído se forma la imagen comúnmente durante largos períodos de tiempo y se considera viable 23-26. Por lo tanto, la cuantificación de la dinámica celular en múltiples regiones dentro de una sola médula espinal es posible. Por último, cabe señalar que la gran mayoría de las células That no están etiquetados con fluorescencia no será visualizado por esta preparación (a menos que autofluorescentes naturalmente), y es importante reconocer que las células marcadas están interactuando con un entorno complejo de otras células no marcadas, aparentemente invisibles endógenos y elementos estructurales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25X dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25x36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25x36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
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