To-foton Imaging av Cellular Dynamics i Mouse Spinal Cord
Summary
En ny ex vivo preparat for avbilding av musen ryggmargen. Denne protokollen gir mulighet for to-foton avbildning av levende cellulære interaksjoner i hele ryggmargen.
Abstract
Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.
Introduction
Musemodeller av demyelinisering, herunder eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) og intrakranielle infeksjon med neuroadapted mus hepatitt virus (MHV), er gode verktøy for å studere molekylære stier og cellulære interaksjoner forbundet med sykdom. De har ført til og støttet effektiviteten av FDA godkjente farmasøytiske behandlinger, hovedsakelig rettet mot opphør av autoimmunitet og betennelse en. Men når endogent remyelinisering har sviktet, de allerede godkjente behandlingsformer ikke effektivt reparere demyelinerte lesjoner i sentralnervesystemet. Derfor reparasjon fokusert terapi på dette stadium av sykdommen er avgjørende for lindring av kroniske symptomer og forbedring av livskvalitet. Nylig har nevrale forløperceller (NPC) kommet i forgrunnen som en potensiell regenerativ terapeutisk modalitet å målrette områder med betennelse og demyelinisering. Flere studier har markert evne NPCer å indusere endogenooss remyelinisering og delta direkte i remyelinisering 2-8. Fordi NPCer er involvert i direkte remyelinisering, er det viktig å forstå deres kinetikk og interaksjoner med endogene celler etter transplantasjon. Etter transplantasjon, NPCer migrere ventralt til områder av hvit substans skade, så rostrally og caudally forhold til transplantasjon området 5,9. Kinetikken til migrasjon forskjellig respons på miljømessige signaler; NPCer transplantert inn i en ikke-skadet ryggmargen har større hastigheter enn NPCer transplantert inn en skadet ryggmarg 6. Etter en trekkfugl periode, overføres NPCer sprer mye, på en høyere rente i en skadet ryggmarg i forhold til en intakt ryggmarg 6. Til slutt, de fleste av NPCer differensieres til oligodendrocytter og initiere direkte remyelinisering 4,6,9.
Den demyelinerte lesjon er komplekse og kan inkludere en mangfoldig befolkning av celler på ulike stadier av enctivation. For eksempel kan en aktiv multippel sklerose (MS) lesjon omfatter en betydelig populasjon av aktiverte T-celler, mikroglia M1 og M1 makrofager, men en kronisk stille MS lesjon kan bestå hovedsakelig av reaktive astrocytter med få betennelsesceller 10-13. På grunn av mangfoldet av effektorcellene, to-foton (2P) bildebehandling i musemodeller av demyelinisering er et svært nyttig verktøy for å forstå lokale cellulære interaksjoner i lesjonen. I MS og mange utstrakt bruk MS forskningsmodeller, er de fleste av lesjoner ligger på ventral side av ryggmargen, en region utilgjengelig for intra 2P bildebehandling grunn lesjon dybde og det høye fettinnholdet i ryggmargen. For å omgå disse problemene og studie celle-celle interaksjoner innenfor lesjoner langs ventral ryggmarg vi har utviklet en enkel ex vivo 2P bildebehandling forberedelse 6.
Denne studien følger opp en tidligere metoder publikasjon, som visteprosedyren for å transplantere forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) -expressing NPCer i ryggmargen av mus etter JHMV stamme av MHV-indusert demyelination 14. Fem uker gamle mus er smittet med JHMV og transplantert med EGFP-NPCs på thorax nivå 9 på dag 14 etter smitte. Protokollen presenteres her gir detaljert fremgangsmåte på hvordan du kan hente den ryggmargen, lage en ex vivo agarose forberedelse, og bilde transplantert EGFP-NPC interaksjoner med forbedret gul fluoriserende protein (EYFP) -expressing aksoner. Mus som uttrykker EYFP under neuronal spesifikke Thy1 promoteren ble brukt i denne fremgangsmåten 15. Bare noen av axoner uttrykke EYFP, noe som gjør det nyttig for å avbilde individuelle axoner. Her viser vi ryggmargen fjernes 7 dager etter transplantasjonen; Imidlertid kan ryggmargen ekstraheres på ethvert tidspunkt etter transplantasjonen. Mens vi vise interaksjoner av NPCer med skadet axoner, kan vår protokoll brukes i kombinasjon med genetiske fluorescerende markørerav andre celletyper for å undersøke en rekke cellulære interaksjoner som forekommer i løpet av mus ryggmargen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sanntids 2P avbildning av intakt vev er nødvendig for å etterforske NPC kinetikk og interaksjoner etter transplantasjonen inn i demyelinerte mus ryggmargen. Intravital 2P avbildning er vanlig brukt for å bestemme celle dynamikk på ryggsiden av ryggmargen i levende mus, og har blitt brukt til å studere dorsal demyelinisering i demyeliniserende sykdom 17-19. Men fordi transplanterte NPCer migrere til ventral hvit substans, som ligger for dypt til bilde in situ ved hjelp 2P mikroskopi, er en ex vivo</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (to M.D.C.), R39 GM-048071 (to I.P.), and R01 NS-074987 (to T.E.L.) and the National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (to C.M.W., T.E.L. and M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (to M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (to J.G.W.), and funding from the George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care, Inc | N/A | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | sharp |
| scalpel blade #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Luer rongeurs | Fine Science Tools | 16001-15 | |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Vannas scissors | Fine Science Tools | 15615-08 | |
| scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 12-115F | |
| agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-25G | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Vetbond (tissue adhesive) | 3M | 1469SB | |
| 22 mm square cover slip | Fisher Scientific | 12-547 | |
| 25x dipping objective, 1.1 NA | Nikon | CFI Apo LWD 25XW | |
| Single inline solution heater | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 520 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF520-Di02-25×36 | Brightline |
| 560 nm single-edge dichroic beam splitter | Semrock | FF560-FDi01-25×36 | Brightline |
| photomultiplier tubes | Hamamatsu | R928 | |
| C/L variable-speed tubing pump | Masterflex | 77122-22 | |
| digital thermometer | Comar Instruments | 3501 | |
| Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser | Coherent | N/A | |
| Slidebook 6 software | 3i | N/A | |
| Imaris 7.7 software | Bitplane | N/A |
References
- Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
- Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
- Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
- Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
- Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
- Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
- Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
- Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
- Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
- Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
- Coyle, P. K., Rizvi, S. A., Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. 3, 43-70 (2011).
- McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
- Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
- Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
- Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
- Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
- Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033 (2013).
