Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши

doi: 10.3791/52580 Published: February 22, 2015

Summary

Новый экс естественных условиях подготовки к визуализации мыши спинного мозга. Этот протокол позволяет двухфотонного изображений живых клеточных взаимодействий в течение спинного мозга.

Introduction

Мышиные модели демиелинизации, в том числе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭОС) и внутричерепной инфекции вирусом neuroadapted мыши гепатит (MHV), являются отличными инструментами для изучения молекулярных путей и клеточные взаимодействия, связанные с болезнью. Они привели к и поддерживается эффективность FDA одобрило фармацевтических методов лечения, в основном, для прекращения аутоиммунных и воспалительных 1. Однако, как только эндогенного ремиелинизация не удалось, утвержденные в настоящее время терапия не могут эффективно ремонтировать демиелинизированные поражений в центральной нервной системе. Таким образом, ремонт ориентированных методов лечения на этой стадии заболевания имеют решающее значение для облегчения хронических симптомов и улучшения качества жизни. В последнее время нейронные клетки-предшественники (НПК) пришли на первый план в качестве потенциального регенеративного метода лечения на проблемные участки воспаления и демиелинизации. Несколько исследований выявили способность NPC, чтобы вызвать endogenoнам ремиелинизации и непосредственно участвовать в ремиелинизации 2-8. Потому что НПС участвуют в непосредственном ремиелинизации, необходимо, чтобы понять их кинетики и взаимодействия с эндогенными клеток после трансплантации. После трансплантации НПС мигрируют вентрально в районы белого повреждений материи, то рострально и каудально по отношению к месту пересадки 5,9. Кинетика миграции отличаются в ответ на сигналы окружающей среды; НПС пересаженные в неповрежденных спинного мозга имеют больше скорости, чем NPC, пересаженных в поврежденный спинной мозг 6. После миграционный период, переданы НПС размножаться широко, по более высокой ставке в поврежденном спинном мозге по сравнению с интактной спинного мозга 6. И, наконец, большинство НПС дифференцироваться в олигодендроциты и инициировать прямой ремиелинизацию 4,6,9.

Демиелинизированные поражение является сложным и может включать в себя разнообразную популяцию клеток на различных стадияхctivation. Например, активный рассеянный склероз (MS), поражение может включать значительное население активированных Т-клеток микроглии, M1 и M1 макрофагов, а хроническое повреждение молчание МС может состоять в основном из реактивных астроцитов с несколько воспалительных клеток 10-13. Из-за разнообразия эффекторных клеток, два фотона (2P) изображений в мышиных моделях демиелинизации является чрезвычайно полезным инструментом, чтобы помочь понять местные клеточные взаимодействия внутри поражения. В MS и многих широко используемых моделей MS-исследовательских, большинство поражений расположены на брюшной стороне спинного мозга, области недоступны для визуализации прижизненный 2P-за глубины поражения и высоким содержанием липидов в спинном мозге. Чтобы обойти эти проблемы и исследование межклеточных взаимодействий в рамках поражений вдоль вентральной спинного мозга мы разработали простой экс естественных 2P подготовки изображений 6.

Это исследование является продолжением предыдущей публикации методы, которые показалиПроцедура пересадки усиленный зеленый флуоресцирующий белок (EGFP), экспрессирующие НПС в спинном мозге мышей после JHMV штамма MHV-индуцированной демиелинизации 14. Пять недельных мышей, инфицированных JHMV и пересадить с EGFP-NPC, на грудном уровне 9 на 14 день после заражения. Протокол, представленные здесь приведены подробные шаги на том, как извлечь спинной мозг, сделать Экс Vivo агарозном подготовку и изображения пересадить EGFP-NPC взаимодействия с повышенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) экспрессирующие аксонов. Мыши, экспрессирующие EYFP под нейронов конкретных Thy1 промотора были использованы в этой процедуре 15. Только некоторые из аксонов выразить EYFP, что делает его полезным для работы с изображениями отдельных аксонов. Здесь мы показываем, спинного мозга удалены через 7 дней после трансплантации; Однако, спинной мозг может быть извлечена в любой момент времени после трансплантации. В то время как показано взаимодействие НПС с поврежденных аксонов, наш протокол может быть использован в сочетании с генетическими флуоресцентных маркеровдругих типов клеток, чтобы исследовать множество клеточных взаимодействий, происходящих во всем спинного мозга мыши.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

О себе Этика:: Примечание протокол для обращения с животными был утвержден уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета Калифорнии в Ирвине, протокол # 2010-2943 мимо.

1. Удаление спинного мозга

  1. Поместите бумажные полотенца, смоченного ~ 100% жидкого ИФ, USP в эвтаназии камеру и поместите сухие бумажные полотенца сверху. Поместите курсор в камере сверху сухие бумажные полотенца, чтобы мышь не касаясь изофлурана и убедитесь, что камера покрыта. Подождите, по крайней мере, одну минуту после остановки дыхания, чтобы гарантировать, что мышь эвтаназии.
  2. Выполните перерезки спинного шеи, чтобы обеспечить мышь эвтаназии. Не выполняйте шейки дислокации, так как это может привести к повреждению спинного мозга.
  3. Спрей мышь с 70% этанола, чтобы смочить волосы.
  4. Использование тонких ножниц острые, чтобы удалить волосы и кожу от задней части мыши подвергать позвоночник от примерно 1 шейки пластинки (C1) С сакральной пластинки 4 (S4).
  5. Использование скальпеля с # 10 лезвие, делать надрезы влево и вправо от позвоночника, чтобы отделить его от мышц и жира. Это сделает удаление спинного мозга гораздо проще.
  6. Дополнительно: изогнутые Луер кусачек может быть использован, чтобы зачерпнуть от дополнительного плоть.
  7. Удерживая верхнюю часть позвонков с зубчатыми щипцами Грефе, вставьте титана изогнутые Vännäs ножницы с изогнутой стороной вверх в открытой позвоночника в С1, будьте осторожны, не прикасайтесь к спинного мозга.
  8. Слайд титана изогнутые ножницы Vännäs все до упора вправо и сделать один небольшой разрез. Небольшой хрустящий звук должен быть слышен и чувствуется как ножницами вырезать позвоночник. Повторите этот разрез на дальнем левом стороне спинного мозга. Будьте осторожны, чтобы не идти слишком быстро или сделать слишком большой разрез, как это будет рискуете повредить кабель с ножницами.
  9. Единственный пластинка должна иметь возможность быть сняты с щипцами после того, как стороны позвонков вырезают. REPEAT этот шаг для каждого пластинки до S4, продолжая держать и тянуть обратно в спинной позвонок шнур.
    ПРИМЕЧАНИЕ: над местом пересадки позвонков, скорее всего, оторваться, как только он вырубается на сайт трансплантата. Продолжайте процедуру, начиная чуть ниже сайта трансплантата.
  10. Дополнительно: заложить позвонков вниз, чтобы увидеть, где сайт пересадка и мера и вырезать ~ 20 мм ростральной и хвостовой на сайт трансплантата.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При пересадке НПС больше не будут нужны, как пересаженные НПС, как правило, не мигрируют дальше, чем на 15 мм. Количество спинного мозга, необходимого будет зависеть от эксперимента и миграции характеристик типа клеток пересаженного. Создание ростральные и хвостовой сокращений, которые находятся на одинаковом расстоянии сайте трансплантации позволит на сайт трансплантата, который будет расположен легче во время съемки.
  11. Использование скальпеля с # 11 лезвие аккуратно вырезать ганглиев справа и слева от брюшной стороне спинного мозга, начиная с ростральной конца. Это жболен включить спинной мозг должен быть удален из брюшной позвонков более легко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Совершено быстро (шаги 1.7-1.11), спинной мозг не иссякнет. Тем не менее, 1X PBS можно вводить в мозге, чтобы держать его влажным.
  12. Обратить мыши и удерживайте кнопку мыши так, спинной мозг вниз. Тщательно очистите из спинного мозга с использованием закрытых зубчатых щипцов Грефе. Без засечек спинной мозг, аккуратно вырезать любые оставшиеся ганглиев, чтобы спинного мозга должны быть сняты в одной цельной детали.
  13. Убедитесь, что спинной мозг в RPMI-1640 и поместить его на льду для транспортировки микроскопа 2P.

2. Подготовка спинного мозга для работы с изображениями

  1. Встраивание спинного мозга в агарозы
    1. Держите изолированного спинного мозга в охлажденном RPMI-1640 на льду до визуализации.
    2. Взвесить агарозы (низкая температура гелеобразования) и подготовить 5% раствор в 5 мл 1x PBS. Микроволновая 5% раствором агарозы в течение 15 сек, чтобы растворить AGвстал и пусть решение остыть до 37 ° С.
    3. Подготовка спинной мозг, поместив его на листе парафильмом с вентральной стороной вверх.
    4. Пипеткой приблизительно 5 мл 5% раствора агарозы над вентральной стороны спинного мозга. Пусть агарозном затвердеть при охлаждении до комнатной температуры. Полное затвердевание занимает около 5 мин.
    5. Нанесите тонкий слой клея ткани на 22 мм квадратный покровным.
    6. Обратить встроенный спинной мозг, помещая брюшной стороне на парафильмом. Спинная сторона теперь будет вверх. Придерживайтесь покровное к спинной стороне, и погрузите в агарозном встроенный спинного мозга / крышка подготовку к скольжению на RMPI, чтобы укрепить клеем. Удалить избыток укрепил агарозы, используя лезвие бритвы.
  2. Монтаж спинного мозга на столик микроскопа
    1. Применение вазелин, чтобы в нижней части покровным. Это будет стабилизировать препарат при перфузии.
    2. Поместите подготовку спинного мозга ввизуализации и на столике микроскопа с вентральной стороной вверх в сторону погружения цели 25X. Изготовленный на заказ и изображений составляет примерно 20 мм в глубину, длину 50 мм, и 50 мм в поперечнике.
    3. Изображение, а superfusing подготовку с подогреваемой (37 ° C), кислородом (95: 5 кислорода: диоксид углерода карбогена) среде RPMI-1640 без сыворотки.
      1. Предварительно теплой носитель до 37 ° С на водяной бане и соединить ее с насосом труб, вставив трубку в медиа-бутылке.
      2. Сохраните температура рабочей среды в 37 ° C нагреватель устройства в связи трубки к камере. Superfuse носитель через скважины на 3 мл / мин с использованием трубки, соединенный с насосно-компрессорных труб насос (Фиг.1В).

3. 2P изображений вентральной спинного мозга

  1. Микроскоп Setup
    1. Получение изображений со Thy1-EYFP спинного мозга с помощью Chameleon Ультра Ti: Sapphire лазер, настроенный на 900 нм. Ослабление мощности лазерного излучения наобразца до <5%, чтобы обеспечить минимальную фототоксичность 16. Поддержание температуры путем перфузии кислородом перфузии RPMI-1640 при постоянной температуре 37 ° С с использованием одного нагреватель Конвейер решение для обеспечения стабильного изображений, а также для предотвращения ткани дрейфа и повреждение клеток.
    2. Чтобы отделить EGFP и EYFP флуоресцентный сигнал, поместите 520 нм одного края Дихроичный и нм одного края сплиттер 560 дихроичное луча в серии, чтобы отделить 2P выбросов в трех каналах, нарочно разделения зеленое излучение, которое улучшает видимость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это канал, называются сине-зеленый (эмиссии <520 нм), желто-зеленый (520-560 нм) и красный (эмиссия> 560 нм). Фотоэлектронных умножителей детектирование излучаемый свет в каждом канале.
  2. Установочные изображений областях, представляющих интерес
    1. Использование окуляр и яркий источник света поля, основное внимание погружной задачи на нижний край спинного мозга, чтобы установить точку отсчета.
    2. Сделайте источник света, что окружающая выключен и SWзуд 2P возбуждения, открыв лазерный затвор.
    3. Если есть возможность, при поиске ткани для областей, представляющих интерес, используйте более низкое разрешение, высокую громкость без цифровым зумом и более высокую скорость сканирования, чем при приобретении окончательные изображения. Типовые настройки с этой системой при поиске ткани для области интересов: разрешение: 256 пикселей; объем: х = 600 мкм, Y = 600 мкм, г = 0-300 мкм.
    4. Соблюдайте аксоны EYFP рядом с нижнего края спинного мозга. Вторая гармоника сигнала из коллагена (синий) будет яркое спинного края шнур ткани. Найдите аксоны EYFP только спинной второй гармонике сигнала от коллагена и сигнал EYFP визуализируется в зелено-желтый канала.
    5. Расположить сайт трансплантата в продольном центре спинного мозга подготовки 14. Для мышей один день после трансплантации EGFP-NPC, найти сайт трансплантата, сосредоточив внимание на пути луча в плоскости г глубоко в ткани. Пересадка сайт WiLL незначительно отличаться от животных, но, как правило, находится ~ 200 мкм от нижнего края. Соблюдайте кластеров EGFP-NPC, в трактов белого вещества, ближе к вентральной и боковых краев у мышей после дня 1 после трансплантации.
  3. Приобретение окончательные изображения
    1. Приобретать разрешение изображения 512 пикселей; Объем: X = 270 мкм, Y = 212 мкм, и Z = 100 мкм, используя Slidebook 6 программного обеспечения. Компиляция Z-стеки, приобретая последовательных фокальных плоскостей с шагом 2,5 мкм.
    2. Выполнение двунаправленного сканирования с соответствующим смещением чередования для обеспечения быстрого количественного любых объектов, мигрирующих в спинном мозге. Убедитесь, что идеально подходит частота кадров приобретение для определения клеточного скорость в пределах спинного мозга составляет примерно 1 кадр / сек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки визуализации может быть изменен с индивидуальными предпочтениями пользователей, такие как частота кадров приобретения, разрешение изображения и объемов изображений. Большие объемы изображений, как правило, занимает больше времени, чтобы приобрести на GIVРазрешение ан.
    3. Анализ, обрезать, гладкой и псевдоцвете файлы Slidebook изображения с программным обеспечением для анализа изображений, такие как битовой плоскости Imaris 7.7. Заключительных видео покадровой расчесывать подряд объемы изображений с использованием автоматизированного процесса в Slidebook и Imaris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В то время как эксплантировали протокол изображения спинного мозга может быть использован для визуализации любой флуоресценции в спинном мозге, наш представитель результаты показывают, EGFP-NPC взаимодействия с EYFP-аксонов. Во-первых, мы показываем встроенный вентральной спинномозговой подготовку шнура на рисунке 1А. Далее, мы показываем установки 2P микроскоп и ключевые компоненты на рисунке 1b. Рисунок 2 демонстрирует EGFP и EYFP флуоресценции в одном Z-стека в брюшной спинного мозга. Приобретение подряд Z-стеки могут быть скомпилированы для производства покадровой видео для анализа в режиме реального времени клеточной динамики в неповрежденной ткани. Использование 520 нм одного края Дихроичный и 560 нм одного края сплиттер дихроичное луча, как отмечено в протоколе, может отделить EGFP и EYFP сигнал. Отдельные каналы могут быть псевдоцветной зеленый и желтый с помощью программного обеспечения визуализации.

80 / 52580fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Спинной мозг и настройка микроскопа. (А) спинного мозга встроен в 5% -ном агарозном геле (слева) и установлен на покровное после удаления избыточного агарозы (справа). (Б) изображение установки микроскопа с ключевых компонентов, меченных. 1. водяной бане при 37 ° С. 2. подогретого RPMI-1640. 3. C / L Насос с переменной скоростью трубки. 4. Одно Встроенный нагреватель решение. 5. Погружение цель. 6. Цифровой термометр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2: Пример 2P изображение, полученное внутри брюшной спинного мозга 3D реконструкции брюшной стороне у неинфицированных, неповрежденных (А) и JHMV-инфицированных, демиелинизированные (B) спинного мозга.от Thy1-EYFP мыши после трансплантации с EGFP меченных НПС. Флуоресцентно меченные аксоны псевдоцветной желтый и НПС псевдоцветной зеленый. Разрешение изображения: 512 пикселей; Объем изображений: (А) х = 239 мкм, у = 259 мкм, г = 65 мкм построены с использованием 26 Z-стеки на расстоянии 2,5 мкм друг от друга и (В) х = 497 мкм, Y = 389 мкм, г = 127,5 мкм, построенную с использованием 51 Z-стеки на расстоянии 2,5 мкм друг от друга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В режиме реального времени 2P визуализации неповрежденной ткани, необходимых для расследования NPC кинетики и взаимодействий при трансплантации в демиелинизированные мыши спинного мозга. Изображения прижизненные 2P обычно используется для определения клеточной динамики на спинной стороне спинного мозга в живых мышей, и был использован для изучения спинной демиелинизации в демиелинизирующих заболеваний 17-19. Однако, поскольку пересаженных НПС мигрируют в брюшной белого вещества, которая лежит слишком глубоко, чтобы изображение на месте с помощью 2P микроскопии, экс естественных подготовка необходима. Эта методика была использована в нашей лаборатории, чтобы определить подвижность и ремиелинизацию кинетику НПС трансплантированных в поврежденных и неповрежденных спинного мозга 6. Экс естественных препараты включить сканирование спинного мозга не только продольно, но и в поперечном направлении от вентральной стороне 6,20 , Это позволяет проводить анализ различий в движении клеток (скорость и направление) и взаимодействия на Тransplant сайт, рядом с сайта трансплантации, и на различных расстояниях от места трансплантации 6. В то время как мы первоначально разработан этот препарат для трансплантированного изображения EGFP-НПС на вентральной стороне спинного мозга, он может быть использован для любого изображения или флуоресцентно меченных окрашенных клеток из брюшной, спинной или боковые стороны, изменяя ориентацию спинного мозга установлен. Преимущества этого препарата в течение прижизненной визуализации включать в себя предоставление брюшной стороне изображений и не хватает необходимость обезболивания и хирургии выживания, который по-прежнему нуждаются в новых прижизненных препаратов с использованием "Витраж" установку, которая позволит за несколько сеансов изображений без повторных операций 19,21 , Следует отметить, что одно ограничение этой процедуры по сравнению с "стекло" окна подхода в сочетании с прижизненной визуализации является невозможность получить различные моменты времени от одной мыши, так как спинной мозг удал ют и мыши умерщвлены,

Изображения 2P идеально подходит для решения динамику отдельных клеток в интактных тканях 22,23. Возбуждения 2P использует ближней ИК-области фотоны, которые позволяют в течение длительных периодов изображений глубокой ткани с минимальным фототоксичности. Возбуждение 2P возникает при одновременном поглощении двух фотонов флуорофором. Высокая концентрация фотонов, необходимых для возбуждения 2P достигается пространственно-временной компрессии выходе лазера 2P в одной фокальной плоскости. Это ограничивает флуоресцентный возбуждение в фокальной точке, дальше минимизации фототоксичность спинного регионах мозга вне фокальной плоскости. Рядом-инфракрасные фотоны также сократили рассеяние, позволяя изображений до примерно 300 мкм с вентральной стороны спинного мозга 16.

Как и с любой новой технологии, однако, 2P визуализации эксплантированной спинного мозга имеет ограничения, которые следует иметь в виду. Этот протокол изображения использует 520 нм dichroIC зеркало, которое делает возможным разделение EGFP и EYFP флуоресценции, отвлекая выбросов EGFP в люминесцентной канала, как правило, зарезервированы для синего света. Генерация второй гармоники, созданный коллагена в спинном мозге также появляется в канале синего, но легко отличить от EGFP-меченых клеток, которые значительно светлее в этом препарате, и иметь часть своего излучения идентифицировать в желто-зеленой канал, коллаген не делает. Этот метод смешивания каналов и разделения различных частей в спектрах излучения с использованием специфических дихроичными часто бывает полезно для визуального или автоматизированной идентификации отдельных флуорофоров с непосредственной или почти перекрытием спектров испускания. Фототоксичность еще одно ограничение данного протокола визуализации 2P. Клеток в одном томе изображения являются чувствительными к фототоксичности; Поэтому, экспериментатор должен быть остро осознают признаков фототоксичности. Фототоксичность обычно первый проявляется в сокращении или отсутствии клеткиподвижности, а затем фотообесцвечивание и / или морфологические изменения в локальных тканей. Ряд факторов может привести к повреждению ткани, ведущее к фототоксичность или делает его непригодным для работы с изображениями живых клеток. Очень важно следить за мощность лазера и температуру и оксигенации перфузированной RPMI-1640. Важно также, чтобы обеспечить надлежащее удаление спинного мозга от мыши без чрезмерного растяжения или сжатия спинного мозга и, не разрезая спинной мозг с лопастями. При правильном обращении, эксплантировали спинного подготовка шнур остаются жизнеспособными в течение десяти часов, а определяется надежной сотовой подвижности в брюшной спинного мозга, без уменьшения в десять часов после экстракции. Разнообразие извлеченной ткани обычно отображаемого для длинных промежутков времени и считается жизнеспособным 23-26. Таким образом, количественная оценка динамики клеточных в различных регионах в пределах одной спинного мозга возможно. Наконец, следует отметить, что подавляющее большинство клеток Тат не флуоресцентно меченных не быть визуализированы с помощью этого препарата (если, естественно, не autofluorescent), и важно, чтобы признать, что меченые клетки взаимодействуют со сложной окружающей среде других без маркировки, казалось бы, невидимые эндогенных клеток и элементов конструкций.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456, (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212, (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224, (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235, (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30, (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86, (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30, (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17, (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590, (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12, (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8, (3), e58033 (2013).
Два-Фотон изображений клеточной динамики в спинном мозге мыши
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).More

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter