Vi beskriver en protokoll for å overvåke Ca 2 + dynamikk i axon terminalene kjegle fotoreseptorer under anvendelse av en ex-vivo skive fremstilling av musen hinnen. Denne protokollen tillater omfattende studier av kjegle Ca 2+ signale i en viktig pattedyr modellsystem, musen.
Retinal kjegle fotoreseptorer (koner) tjener dagslys visjon og er grunnlaget for fargediskriminering. De er underlagt degenerasjon, ofte fører til blindhet i mange netthinnesykdommer. Kalsium (Ca 2 +), en nøkkel andre budbringer i fotoreseptoren signalering og metabolisme, har blitt foreslått å være indirekte knyttet til fotoreseptoren degenerasjon i forskjellige dyremodeller. Systematisk å studere disse aspektene av kjegle fysiologi og patofysiologi er blitt hemmet av vanskelighetene med elektrisk innspilling fra disse små celler, spesielt i mus hvor netthinnen er dominert av stangfotoreseptorer. For å omgå dette problemet, etablerte vi en to-foton Ca 2+ bildebehandling protokollen ved hjelp av en transgen mus linje som uttrykker genetisk kodet Ca 2+ biosensor TN-XL utelukkende i kjegler og kan crossbred med musemodeller for fotoreseptoren degenerasjon. Protokollen er beskrevet her innebærer forbereder vertikale seksjoner (R20, skiver ") av netthinner fra mus og optisk avbildning av lys stimulus-fremkalt endringer i kjegle Ca 2+ nivå. Protokollen tillater også "in-skive måling" av absolutte Ca 2+ konsentrasjon; som opptakene kan følges ved kalibrering. Denne protokollen muliggjør studier av funksjonelle egenskaper konus og forventes å bidra til forståelsen av kjeglen Ca 2+ signalering, så vel som potensialet involvering av Ca 2+ i fotoreseptoren død og retinal degenerasjon.
Vision begynner med lys-indusert aktivering av fototransduksjonskaskade i netthinnens fotoreseptorer. Rod fotoreseptorene tillate visjon ved lave lysnivåer, mens kjegle fotoreseptorene megle farger og høy oppløsning dagslys visjon. Mange fotoreseptorlidelser-spesifikke gener som er utsatt for mutasjoner som fører til degenerering av disse cellene. En rekke av molekylære markører assosiert med fotoreseptoren tap har blitt identifisert en, men så langt har de detaljerte molekylære mekanismer og hendelsesforløpet er fortsatt uklart. Altered Ca2 + homeostase ble spekulert å være en årsak til fotoreseptoren celledød, en hypotese støttes av opp-regulering av aktiviteten av Ca2 + -avhengige kalpain-type proteaser under degenerasjon prosessen 2,3. Men til dags dato, denne hypotesen ikke er støttet av fysiologiske målinger av Ca 2+. Uoverensstemmelser i flere studier på effekten av Ca 2+ kanalblokkere i retinal sykdommer ytterligere utfordret involvering av Ca 2+ i celledød 4-6, ringer etter metoder for å vurdere direkte Ca 2+ i pattedyr kjegle fotoreseptorer.
Tidligere har de fleste elektriske opptak og Ca 2+ imaging studier utført hos amfibier og krypdyr modeller på grunn av lettere tilgang til kjegler 7-9. Imidlertid kan pattedyrfotoreseptoren fysiologi være forskjellig fra det ikke-pattedyr, 10 og spesielt i sammenheng med menneske arvelig retinal degenerasjon, er en bedre forståelse av pattedyrfotoreseptoren fysiologi en nøkkel til utvikling av nye behandlinger. Mange musemodeller som etterligner menneskenetthinnesykdommer er tilgjengelig, men lite er kjent om Ca 2+ dynamikken i mus kjegler 11. Elektriske teknikker er ikke egnet for high-throughput opptak fra membranene, spesielt ikke i mus, hvor stenger (~ 97%) betydelig tallmessig kjegler (~ 3%) 12 </sopp>. Videre sensitive elektrofysiologiske teknikker som hel-celle patch-clamp opptak forstyrre den intracellulære miljø og gi informasjon om Ca 2 + strøm, men ikke på absolutte intracellulære Ca 2 + konsentrasjoner. Derfor, til tross for den lavere tidsmessig oppløsning er avbildning metoden for valg ved adressering spørsmål om kjegle Ca 2 + dynamikk. Det avgjørende med bildebehandling er hvordan du selektivt merke kjegler med et fluorescerende Ca 2+ indikatorfarge. Riktig compartmentalization og celle spesifisitet er vanskelig å oppnå ved "bulk-loading" syntetisk Ca 2 + indikatorfarger i vevet. Som en konsekvens, merkede membranene, stenger 13,14, og Muller gliaceller ikke pålitelig skilles. Også, syntetiske fargestoffer tendens til å lekke ut av cellene, og hindrer langvarig opptakene under konsekvente forhold. Videre legger syntetiske Ca 2+ indikatorer i sine AM-ester form er problematisk, da det krever detergents (f.eks DMSO) og genererer formaldehyd 15. For absolutte Ca 2+ målinger, Proporsjonellekspansjon indikatorer er obligatoriske. Imidlertid krever den beste for tiden tilgjengelig syntetisk ratiometrisk indikator Fura-2 eksitasjonslys i området fra 700-760 nm (for to-foton eksitasjon), som, avhengig av intensiteten, kan i seg selv stimulere kjegler, og således vanskeliggjøre studier av kjegle Ca 2+ dynamikk under fysiologiske belysningsforhold.
I motsetning til syntetiske fargestoffer, kan genetisk kodede Ca 2 + indikatorer kan uttrykkes i en celletype-selektiv måte. De ikke lekke ut av cellene, og derfor, hvis bleking unngås, langvarig og pålitelige ratiometrisk måling er mulig. Celletype-selektiv ekspresjon av Ca 2 + biosensorer, når kombinert med to-foton mikroskopi, representerer et kraftig verktøy for å vurdere og studere subcellulær Ca 2+ i henhold til stort sett fysiologiske betingelser 13,16,17 </sup>. Her beskriver vi en protokoll for å studere lyset stimulus-fremkalt kjegle Ca 2+ dynamikk i en transgen Ca 2+ biosensor muselinje (HR2.1: TN-XL), som uttrykker FRET baserte Ca 2+ biosensor TN-XL 18 selektivt i kjegler, under menneskelig rødt opsin promoter HR2.1 19. Du får tilgang til kjegle terminaler, ble en ex-vivo slice forberedelse 20 sysselsatte. Protokollen ble allerede brukt i tre studier på kjegle funksjon hos friske mus 10,21,22. Videre tillater protokollen studere membran Ca 2+ signalering i spesifikke genetiske forhold, for eksempel ved kryssing musemodeller for arvelig retinal degenerasjon med HR2.1: TN-XL mus.
Pre-eksisterende protokoller ved hjelp av elektrofysiologiske encellede opptak eller Ca 2+ bildebehandling med syntetiske fluorescerende indikatorer sliter med å registrere Ca 2+ dynamikken i muse kjegle fotoreseptorene for en rekke tekniske årsaker (se Innledning). Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for måling av Ca 2 + signaler til og med absolutt Ca 2 + nivåer i individuelle, identifiserte musekjegle terminaler på en effektiv og relativt enkel måte.
Denne protokollen har allerede blitt brukt i tre studier adressering ulike aspekter av kjegle funksjon hos friske mus hinnen. I den første studien 10, den HR2.1: ble TN-XL mus karakterisert ved anvendelse av immunohistokjemi, ERG opptak, to-foton Ca 2+ avbildning, og farmakologi, som viser at den kjegle spesifikk ekspresjon av Ca 2+ biosensor ikke hemme kjegle anatomi og funksjon. I den andre studien 21, kromatiskog akromatiske responsegenskaper av mus kjegler ble kartlagt over netthinnen, viser slående forskjeller i kjegle funksjon mellom den "grønne" opsin dominerte dorsal og "blå" opsin dominerte ventral musen netthinnen. Disse regionale forskjeller i kjegle egenskaper matchet fordelingen differensial kontrast i naturen (dvs. himmel vs. bakken), noe som tyder på at de ulike spektrale typer mus kjegler forsørge (nær) optimal prøvetaking av akromatiske kontraster, og dermed kan tilby en evolusjonær fordel. I den tredje studien 22 gjensidige tilbakemeldinger som kjegle axon terminaler mottar fra horisontale celler ble undersøkt. Som alle foreslåtte horisontal celle tilbakekoblingsmekanismer handle på spenningsstyrte Ca 2+ kanaler i kjegle axon terminaler 28, kan kjegle terminal Ca 2+ tjene som en proxy for horisontale celle-til-cone interaksjoner. Studien av Kemmler og kolleger 22 støtterden oppfatning at horisontale celler bruker et komplekst tilbakemeldingssystem som består av flere mekanismer for kontroll av fotoreseptoren glutamat release.
Disse studiene viser allsidigheten av den beskrevne protokoll, og viser at det kan tilpasses til en lang rekke spørsmål om kjegle funksjon og dens synaptiske kretser. I tillegg muliggjør protokollen studere lokale Ca 2+ signalisering i de ulike kjegle avdelinger, mot en bedre forståelse av kjegle fysiologi. Slik kunnskap er viktig å forstå patofysiologiske prosesser i degenereres kjegler, for til slutt å muliggjøre en rasjonell utnyttelse av den potensielle terapeutiske tilnærminger, særlig for degenerative sykdommer som påvirker kjegler.
I HR2.1: TN-XL mus linje, er Ca 2+ biosensor uttrykt i hele kjeglen, med unntak av det ytre segment. Dette gir en mulighet for direkte og ratiometrisk vurdering av Ca 2+ dynamisks i forskjellige kjegle avdelinger. Siden endringer i Ca 2 + strømninger i det ytre segment er reflektert i terminalene via membranpotensialet og den resulterende aktivering av spenningsstyrte Ca2 + kanaler, kan prosessene i det ytre segment observeres indirekte.
Potensielle fallgruvene:
Disseksjon av netthinnen er et kritisk punkt: I mus, skiller netthinnen fra eyecup vanligvis mellom fotoreseptorlidelser yttersegmentene og pigment epitel. Derfor er det lysfølsomme fotoreseptoren ytre segmenter av det isolerte retina eksponert og ekstremt følsom for mekanisk skade. Stor forsiktighet må tas for ikke å skade ved å berøre fotoreseptoren side med verktøy eller ved å flytte vev sidelengs på en selvklebende overflate (f.eks et filter membran).
Høykvalitets retinal skiver kan gjenkjennes under mikroskopet ved sin rene skjæreflaten ogav en godt organisert fotoreseptoren lag med klart definerte ytre segmenter. Funksjonell vurdering av kvaliteten skive kan raskt utføres ved å blinke med sterkt lys stimuli og bestemme prosentandelen av responderende kjegler (for eksempel i et synsfelt med 10 – 20 kjegler). Her bør responsen kvalitet evalueres ved å beregne signal-til-støy-forholdet (S / N) (amplitude av utgangsverdien støy før lyset stimulus vs. amplitude av lyset respons); en S / N av 2 – 3 skal betraktes som minimum terskel. Vanligvis kaster vi skiver med mindre enn 50% responsive kjegler. Også skiver med kjegler som viser overdreven spontan spiking atferd (se Figur 4 av 10) skal kastes.
Slices i innspillingen kammer som oppfyller de nevnte anatomiske og funksjonelle kriterier viser konsistente svar på 1 – 2 timer (for detaljer om svar konsistens, se 10). Fordi skiver overleve hvår i holdekammeret, kan et vellykket eksperiment vare opptil seks timer. Det er bemerkelsesverdig at det er noen begrensninger med hensyn til å studere lang spenner romlige interaksjoner mellom kjegler og horisontale celler, som slicing uunngåelig kutter sidetilkoblinger i netthinnens nettverk. Men å øke tykkelsen av netthinnens skiver til 300 mikrometer lindrer dette problemet 22.
Bruken av vertikale skiver retinale unngår skanning av lysfølsomme koniske ytre segmenter ved eksitasjon laser og således i stor grad hindrer opsin bleking (for omfattende diskusjon, se 10,21). Likevel, de registrerte Ca 2+ signaler ikke bare avhengig av lys stimuli, men også bli berørt av en bakgrunnsbelysning komponent som genereres av scanning eksitasjon laser. Faktisk, er den effektive bakgrunnsbelysning i slike to-foton bildebehandling eksperimenter en kombinasjon av spredt laserlys, fluorescerende lys emittert ved den registrerte cells, og noen LED stimulans bakgrunn komponent. Derfor bør kjegler få lov til å tilpasse seg i minst 20 – 30 s til laser scanning (med bakgrunnen komponent av lyset stimulus slått på) før opptaket.
Fordeler og bruksområder:
Mens noen bruksområder for denne kjegle Ca 2+ -imaging protokollen er beskrevet ovenfor 10,21,22, kan andre anvendelser tenkes: Farmakologiske studier i kombinasjon med kjegle Ca 2+ avbildning kan validere Ca 2+ signalveier i kjegler og kan bli brukes til å teste effekt og styrke av legemidler rettet mot ulike aktører i Ca 2+ -signaling 10. Imidlertid kan en nøkkel søknad være å studere sykdommer som påvirker kjegle funksjon. Mange retinal degenerasjon musemodeller etterligne menneskelige sykdommer er tilgjengelig. For eksempel er den kjegle fotoreseptoren tap 1 (CPFL 1) muse en primær kjegle degenerasjon modell lidelsefra en Pde6c mutasjon 29. Omvendt, lider stangen degenerasjon 1 (rd 1) mus fra et Pde6b mutasjon. Selv om dette fører til primær stang fotoreseptoren degenerasjon 30. gang rd 1 stang tapet er fullført, videregående kjegle degenerasjon sett i en. Crossbreeding disse dyrene med HR2.1: TN-XL linjen vil tillate å studere og sammenligne Ca 2+ dynamikk i både primær- og sekundær kjegle degenerasjon og vil trolig gi verdifull innsikt i rollen Ca 2+ under kjegle celledød. Også farmakologisk indusert kjegle degenerasjon – for eksempel ved bruk av selektive PDE6 hemmere – kan bidra til å identifisere nedstrøms mekanismer kjegle degenerasjon 10,29,31.
Oppsummert protokollen beskrevet her kan måle Ca 2+ i subcellulære avdelinger av mus kjegle fotoreseptorene og gir store muligheter til å avdekke kjegle fysiologi under et bredt spekterav fysiologiske og patofysiologiske betingelser. I tillegg kan denne protokoll benyttes for screening av farmakologiske midler er utformet for å gripe inn med konusen Ca 2+ -signaling og derved bidra til å etablere nye behandlinger for kjegle sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |