Vi beskriver ett protokoll för att övervaka Ca2 + dynamiken i axonet terminaler kon fotoreceptorer med hjälp av en ex-vivo skiva beredning av musen näthinnan. Detta protokoll möjliggör omfattande studier av kon Ca2 + signalering i en viktig modellsystem däggdjur, musen.
Retinal kon fotoreceptorer (koner) tjänar dagsljus vision och är grunden för färgdiskriminering. De är föremål för degenerering, vilket ofta leder till blindhet i många retinala sjukdomar. Kalcium (Ca2 +), ett nyckel andra budbärare i fotoreceptor-signalering och metabolism, har föreslagits vara indirekt kopplade med fotoreceptor degeneration i olika djurmodeller. Systematiskt studera dessa aspekter av kon fysiologi och patofysiologi har hämmats av svårigheterna med elektriskt inspelning från dessa små celler, i synnerhet i mus där näthinnan domineras av stavfotoreceptorer. För att kringgå detta problem, har vi etablerat en två-foton Ca2 + avbildning protokoll med hjälp av en transgen mus linje som uttrycker genetiskt kodade Ca2 + biosensor TN-XL uteslutande i kottar och kan korsavlade med musmodeller för ljusmätare degeneration. Protokollet som beskrivs här innefattar framställning vertikala sektioner (R20, skivor ") av näthinnor från möss och optisk avbildning av ljus stimulus framkallade förändringar i kon Ca2 + nivå. Protokollet ger också "in-slice mätning" av absoluta Ca2 + koncentrationer; eftersom inspelningarna kan följas av kalibrering. Detta protokoll möjliggör studier i funktionella kon egenskaper och förväntas bidra till förståelsen av konen Ca2 + signalering liksom potentiell inblandning av Ca2 + i ljusmätare död och retinal degeneration.
Vision börjar med ljus-inducerade aktiveringen av ljusöver kaskaden i retinala fotoreceptorer. Rod fotoreceptorer tillåter syn vid låga ljusnivåer, medan kon fotoreceptorer förmedlar färg och hög upplösning dagsljus vision. Många fotoreceptor-specifika gener är känsliga för mutationer som leder till degeneration av dessa celler. Ett antal molekylära markörer i samband med fotoreceptor förlust har identifierats 1, men hittills har de detaljerade molekylära mekanismer och händelseförloppet är fortfarande oklara. Förändrad Ca2 + homeostas spekulerades vara en utlösande faktor för fotoreceptor celldöd, en hypotes som stöds av uppreglering av aktiviteten hos Ca2 + -beroende calpain typ proteaser under degeneration processen 2,3. Men hittills, denna hypotes är inte backas upp av fysiologiska mätningar av Ca2 +. Inkonsekvenser i flera studier om effekten av Ca2 + kanalblockerare i retinal sjukdomar utmanade ytterligare medverkan av Ca2 + i celldöd 4-6, kräver metoder för att direkt bedöma Ca2 + i däggdjurs kon fotoreceptorer.
Tidigare har de flesta elektriska inspelning och Ca2 + imaging studier utförts i amfibie och reptil modeller på grund av lättare tillgång till koner 7-9. Emellertid kan däggdjur ljusmätare fysiologi skilja sig från den hos icke-däggdjur 10 och i synnerhet, i samband med mänskliga ärftliga näthinnedegeneration, är en bättre förståelse av däggdjursfotoreceptor fysiologi en nyckel till utveckling av innovativa behandlingar. Många musmodeller härma mänskliga retinala sjukdomar finns men lite är känt om Ca2 + dynamiken i mus koner 11. Elektriska tekniker är inte lämpliga för hög genomströmning inspelningar från kottar, särskilt inte hos möss, där stavar (~ 97%) betydligt fler än kottar (~ 3%) 12 </supp>. Dessutom känsliga elektrofysiologiska tekniker såsom hel-cell patch-clamp inspelningar stör den intracellulära miljön och lämna uppgifter om Ca 2 + strömmar men inte på absoluta intracellulära Ca2 + koncentrationer. Därför, trots den lägre tidsupplösning, är avbildning metoden för val när man hanterar frågor om kon Ca2 + dynamik. Nyckelfrågan med avbildning är hur man selektivt märka koner med en fluorescerande Ca 2 + indikator färgämne. Korrekt uppdelning och cell specificitet är svårt att uppnå med "bulk-loading" syntetisk Ca 2 + indikator färgämnen i vävnaden. Som en följd av märkta kottar, stänger 13,14, och Müller gliaceller kan inte säkert skiljas. Även syntetiska färgämnen tenderar att läcka ut ur cellerna och förhindrar långvariga inspelningar under enhetliga förhållanden. Dessutom laddar syntetiska Ca2 + indikatorer i sin AM-esterform är problematisk, eftersom den kräver detergents (t.ex. DMSO) och genererar formaldehyd 15. För absoluta Ca2 + mätningar ratiometriska indikatorer är obligatoriska. Men det bästa för närvarande tillgängliga syntetiska ratiometrisk indikator Fura-2 kräver excitation ljus i intervallet 700-760 nm (för tvåfotonexcitering), som, beroende på dess intensitet, kan i sig stimulera kottar, och därmed hindra studier av kon Ca2 + dynamik under fysiologiska belysningsförhållanden.
Till skillnad från syntetiska färgämnen, kan genetiskt kodade Ca2 + indikatorer uttryckas i en celltyp-selektivt sätt. De inte läcker ut ur celler, och därför, om blekning undviks långa och tillförlitliga ratiometriska mätningar är möjliga. Celltyp-selektiva uttrycket av Ca2 + biosensorer, i kombination med två-foton mikroskopi, utgör ett kraftfullt verktyg för att bedöma och studera subcellulära Ca2 + i hög grad fysiologiska förhållanden 13,16,17 </sup>. Här beskriver vi ett protokoll för att studera ljus stimulus-framkallade kon Ca2 + dynamiken i en transgen Ca2 + biosensor mus linje (HR2.1: TN-XL), som uttrycker FRET-baserade Ca2 + biosensor TN-XL 18 selektivt i kottar, enligt den mänskliga röda opsin promotor HR2.1 19. För att komma åt kon terminaler, var en ex-vivo skiva beredning 20 anställda. Protokollet var redan med framgång använts i tre studier på kon funktion hos friska möss 10,21,22. Dessutom tillåter protokollet studera kon Ca2 + signalering i specifika genetiska förhållanden, t.ex. genom att korsa musmodeller för ärftlig näthinnedegeneration med HR2.1: TN-XL möss.
Pre-existerande protokoll som använder elektro encelliga inspelningar eller Ca2 + avbildning med syntetiska fluorescerande indikatorer kämpar för att registrera Ca2 + dynamiken i mus kon fotoreceptorer för ett antal tekniska skäl (se inledningen). Protokollet som beskrivs här möjliggör mätning av Ca 2 + -signaler och även absoluta Ca2 + nivåer i enskilda, identifierade mus kon terminaler i ett effektivt och relativt enkelt sätt.
Detta protokoll har redan med framgång använts i tre studier som behandlar olika aspekter av kon funktion hos friska mus näthinnan. I den första studien 10, den HR2.1: var TN-XL mus karakteriseras med hjälp av immunohistokemi, ERG inspelningar, två-foton Ca2 + avbildning och farmakologi, visar att kon specifika uttryck av Ca2 + biosensorn inte hindrar kon anatomi och funktion. I den andra studien 21, kromatiskoch akromatiska responsegenskaperna hos mus kottar kartlades över näthinnan, visar slående skillnader i kon funktion mellan "gröna" opsin dominerade rygg och "blå" opsin dominerade ventrala mus näthinnan. Dessa regionala skillnader i kon egenskaper matchas distributionsdifferential kontrast i den naturliga miljön (dvs himmel vs jord), vilket tyder på att de olika spektrala typer av mus kottar föreskriver (nära) optimal provtagning av akromatiska kontraster och därmed kan erbjuda en evolutionär fördel. I den tredje studien 22 ömsesidigt feedback som kon axon terminaler får från horisontella celler undersöktes. Eftersom alla föreslagna återkoppling horisontell cellmekanismer verka på spänningskänsliga Ca2 + kanaler i kon axonet terminalerna 28, kan kon terminal Ca2 + fungera som en proxy för övergripande cell-till-kon interaktioner. Studien av Kemmler och medarbetare 22 stödenanser att horisontella celler använder ett komplext återkopplingssystem som omfattar flera mekanismer för att kontrollera ljusmätare glutamatfrisättning.
Dessa studier visar mångsidigheten hos den beskrivna protokollet och visar att det kan anpassas till ett brett spektrum av frågor rörande kon funktion och dess synaptiska kretsar. Dessutom möjliggör protokollet studera lokala Ca2 + signalering i de olika kon facken, mot en bättre förståelse av kon fysiologi. Sådan kunskap är viktigt att förstå patofysiologiska processer i degenererande kottar, för att så småningom göra det möjligt för en rationell utveckling av potentiella terapeutiska metoder, i synnerhet för degenerativa sjukdomar som drabbar kottar.
I HR2.1: TN-XL mus linje, är den Ca2 + biosensorn uttryckt i hela kon, med undantag av det yttre segmentet. Detta ger en möjlighet till direkt och ratiometrisk bedömning av Ca2 + dynamiskasi olika cone fack. Eftersom förändringar i Ca 2 + strömmar i det yttre segmentet återspeglas i terminaler via membranpotentialen och den resulterande aktiveringen av spänningskänsliga Ca2 + kanaler, kan observeras processer i det yttre segmentet indirekt.
Potentiella fallgropar:
Dissektion av näthinnan är ett kritiskt steg: I musen, separerar näthinnan från ögonmusslan vanligtvis mellan fotoreceptor yttre segment och pigmentepitelet. Därför är de ljuskänsliga fotoreceptor yttre segment av det isolerade näthinnan exponerade och extremt känslig för mekanisk skada. Stor försiktighet måste vidtas för att inte skada genom att röra vid fotoreceptorsidan med verktyg eller genom att flytta den vävnad i sidled på en vidhäftande yta (t.ex., ett filtermembran).
Högkvalitativa retinal skivor kan kännas igen under mikroskop genom sin rena skäryta ochgenom en välorganiserad fotoreceptor skikt med klart definierade yttre segment. Funktionell bedömning av skiva kvalitet kan snabbt göras genom att blinka starkt ljus stimuli och bestämma andelen responsiva koner (t.ex. i ett synfält med 10 – 20 strutar). Här bör svarskvaliteten utvärderas genom att beräkna signal-till-brusförhållande (S / N) (amplitud av baslinjen brus innan Ijusstimulus kontra amplituden hos ljus respons); en S / N av 2 – 3 bör betraktas som den lägsta tröskeln. Typiskt, vi kasta skivor med mindre än 50% som svarar kottar. Skär också med koner som visar alltför spontana tillsatta beteende (se figur 4 i 10) ska kasseras.
Skivor i inspelningen kammaren som uppfyller de ovan nämnda anatomiska och funktionella kriterier visar konsekventa svar för 1 – 2 tim (för mer information om svars konsistens, se 10). Eftersom skivor överleva hvår i mottagningskammaren, kan ett lyckat experiment pågå i upp till 6 timmar. Det är anmärkningsvärt att det finns vissa begränsningar med avseende på att studera länge gående rumsliga samspelet mellan koner och horisontella celler, som skivning klipper oundvikligen sido anslutningar i näthinnan nätverk. Att öka tjockleken på näthinnan skivor till 300 pm förbättrar denna fråga 22.
Användningen av vertikala retinala skivor undviker scanning av ljuskänslig cone yttre segment av excitation laser och sålunda till stor del förhindrar opsin blekning (för omfattande diskussion, se 10,21). Trots de inspelade Ca 2 + -signaler inte enbart beroende på ljusstimuli, men också få påverkas av en bakgrundsbelysning komponent som alstras av scanning excitation laser. I själva verket är den effektiva bakgrundsbelysning i sådana två-photon imaging experiment en kombination av spritt laserljus, fluorescerande ljus som emitteras av den inspelade ceLLS, och varje LED stimulans bakgrund komponent. Därför bör koner tillåtas anpassa sig under åtminstone 20 – 30 s till laserskanning (med bakgrunden komponenten av Ijusstimulus påslagen) före inspelningen.
Fördelar och applikationer:
Medan vissa program för kon Ca2 + -imaging protokoll har beskrivits ovan 10,21,22, kan andra program förutses: Farmakologiska studier i kombination med kon Ca2 + avbildning kan validera Ca2 + signalvägar i kottar och kan vara används för att testa effektiviteten och potensen av läkemedel inriktade på olika aktörer i Ca2 + -signaling 10. Dock kan en nyckel ansökan vara att studera sjukdomar som drabbar kon funktion. Många retinala modeller degeneration mus härma mänskliga sjukdomar finns. Till exempel är kon fotoreceptor förlust 1 (CPFL 1) mus en primär kon degeneration modell lidandefrån en Pde6c mutation 29. Omvänt, lider stången degeneration 1 (rd 1) mus från en Pde6b mutation. Även om detta orsakar primära spö ljusmätare degeneration 30, när rd 1 spö förlust avslutade, sekundära kon degeneration sätter in 1. Korsa dessa djur med HR2.1: TN-XL linje gör det möjligt att studera och jämföra Ca2 + dynamiken i både primära och sekundära kon degeneration och kommer sannolikt att ge värdefulla insikter i rollen av Ca2 + under kon celldöd. Även farmakologiskt inducerad kon degeneration – till exempel med hjälp av selektiva PDE6 hämmare – kan användas för att identifiera nedströms mekanismer för kon degeneration 10,29,31.
Sammanfattningsvis beskrev protokollet här tillåter mätning Ca2 + i subcellulära fack av mus kon fotoreceptorer och presenterar fantastiska möjligheter att avslöja kon fysiologi under ett brett spektrumav fysiologiska och patofysiologiska tillstånd. Dessutom kan detta protokoll användas för screening av farmakologiska medel som är avsedda att störa kon Ca2 + -signaling och därmed bidra till att skapa nya terapier för kon sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience Tübingen, EXC 307 to T.E. and T.S.; KFO 134 to B.W. and F.P.D.), the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF) (BCCN Tübingen, FKZ 01GQ1002 to T.E and T.B.), and the European Union (DRUGSFORD; HEALTH-F2-2012-304963 to M.K. and F.P.D).
High vacuum grease | Dow Corning | 1018817 | http://www.dowcorning.com |
Cover slips | R. Langenbrinck | 24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Glass slides | R. Langenbrinck | 76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com | |
Blades for tissue chopper | MARTOR KG | ARGENTAX No. 1044 | 0.25 mm; http://www.martor.de |
Tissue chopper | Custom-build | Based on a design by F. Werblin23, adapted by T. Schubert | |
Nitrocellulose filter membrane gridded | Merck Millipore | AABG01300 | Filter type: 0.8 µm; http://www.emdmillipore.com |
Isoflurane CP | CP pharma | AP/DRUGS/220/96 | http://www.cp-pharma.de |
UV/green LED-based full-field stimulator | Custom-build | for details, see10 | |
Open source microprocessor board | Arduino | http://www.arduino.cc | |
Imaging software CfNT | Custom-written | developed by Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany | |
IgorPro | Wavemetrics | http://www.wavemetrics.com | |
VC3-4 System focal perfusion system | ALA Scientific Instrument | with 100 μm-diameter tip manifold; http://www.alascience.com/ | |
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser) | Newport Spectra-Physics | http://www.spectra-physics.com | |
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany |
Sutter Instruments | http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html | |
XLUMPlanFL 20x/0.95w objective | Olympus | http://www.olympusamerica.com | |
Vaporizer 100 series | Surgivet | http://www.surgivet.com | |
Ionomycin, Calcium salt | Life technologies | I24222 | http://www.lifetechnologies.com |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | https://www.sigmaaldrich.com |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 101191250 | http://www.sigmaaldrich.com |
Leica MZ95 | leica microsystems | http://www.leica-microsystems.com/ |