Abstract
La expresión génica y su regulación son muy importantes para entender el comportamiento de las células en diferentes condiciones. Varias técnicas se utilizan hoy en día para estudiar la expresión génica, pero la mayoría están limitados en términos de proporcionar una visión global de la expresión de todo el transcriptoma. Microarrays de ADN ofrecer una tecnología de investigación rápida y económica, lo que da una visión completa de la expresión génica global y tienen un gran número de aplicaciones, incluyendo la identificación de nuevos genes y factores de transcripción sitios, la caracterización de la actividad transcripcional de las células y también vinculantes ayudar en el análisis de miles de los genes (en un solo experimento). En el presente estudio, las condiciones para el análisis del transcriptoma bacteriana de cosecha de células para el análisis de microarrays de ADN han sido optimizados. Teniendo en cuenta el tiempo, los costos y la precisión de los experimentos, esta plataforma tecnológica resulta ser muy útil y universalmente applicabale para estudiar transcripto bacterianames. Aquí, realizamos el análisis de microarrays de ADN con Streptococcus pneumoniae como un caso-estudio comparando las respuestas transcripcional de S. pneumoniae cultiva en presencia de diferentes concentraciones de L-serina en el medio. El ARN total se aisló utilizando un método de Macaloide utilizando un kit de aislamiento de ARN y la calidad del ARN se comprobó mediante el uso de un kit de comprobación de la calidad del ARN. Se preparó ADNc utilizando transcriptasa inversa y las muestras de ADNc se marcaron utilizando uno de los dos colorantes fluorescentes de amina reactiva. Hechas en casa de ADN de microarrays diapositivas fueron utilizados para la hibridación de las muestras de ADNc marcadas y los datos de microarrays se analizaron mediante el uso de un marco de pre-procesamiento de datos de microarrays de cDNA (Microprep). Finalmente, Cyber-T se utilizó para analizar los datos generados usando Microprep para la identificación de estadísticamente significativas genes expresados diferencialmente. Paquetes de software Además, construido en la casa (pimienta, FIVA, DIVULGAR, FISCAL, Genome2D) se utilizaron para analizardatos.
Introduction
El estudio de todo el conjunto de la abundancia de ARNm (transcriptoma) codificada por el genoma de un organismo unicelular o una célula eucariota en un momento específico o bajo una condición específica, incluyendo la sobreexpresión del gen o knock-out, se llama transcriptómica. Transcriptómica nos permite observar hasta qué punto los genes se expresan bajo una condición particular en un punto X tiempo y nos da información acerca de la fuerza con los genes se expresan con respecto a una referencia.
Un microarray es una matriz bidimensional sobre un sustrato sólido (por lo general un portaobjetos de vidrio o silicio de células de película delgada) que se puede utilizar para ensayar grandes cantidades de material biológico mediante cribado de alto rendimiento, y miniaturizado, el procesamiento de multiplexado y en paralelo y detección métodos. Microarrays vienen en varios tipos, incluyendo microarrays de ADN, microarrays de proteínas, péptidos, microarrays microarrays de tejidos, microarrays de anticuerpos, microarrays de celulares y otros. Un microarray de ADN esbásicamente un conjunto de manchas de ADN microscópicos fijado a una superficie sólida, generalmente de vidrio. Microarrays de ADN se utilizan para medir los niveles de expresión de un gen o un conjunto de genes simultáneamente o determinar el genotipo de múltiples regiones de un genoma 2,3. Picomoles (10 -12 moles) de una sonda están presentes dentro de cada punto de ADN que representa una secuencia de ADN específica, también conocido como un reportero. Las moléculas de ARNm etiquetados de las muestras se denominan "objetivos". Los fluoróforos se utilizan para medir la hibridación sonda-diana y detección de blancos marcados con fluoróforo determina la abundancia relativa de secuencias de ácidos nucleicos en el objetivo. Un experimento de microarrays puede lograr múltiples pruebas genéticas en paralelo debido a una matriz puede contener decenas de miles de sondas. El diseño de un sencillo experimento de microarrays se muestra en la Figura 1. Recientemente, se estableció en nuestro y otros laboratorios que estas matrices son reutilizables, lo que hace que esta técnica bastante costo-effective.
Diferentes técnicas de aislamiento y purificación de ARN se han desarrollado a lo largo de los años, incluyendo C-TAB, SDS y métodos GT 4-8. Además, varios kits comerciales están también disponibles. Para la expresión de genes de ARN de alta calidad es muy importante. Por lo tanto, los métodos de aislamiento de ARN se modifican para obtener una cantidad máxima de ARN. Del mismo modo, se reducen al mínimo los pasos para la preparación de cDNA y etiquetado de cDNA. La normalización de los datos después de la exploración también se lleva a cabo de manera eficiente mediante el uso de en-casa construida paquetes y herramientas de software 9.
Streptococcus pneumoniae es un patógeno humano Gram-positivas que coloniza la nasofaringe y es la causa de múltiples infecciones, como la neumonía, sepsis, otitis media y meningitis 10. La bacteria puede utilizar una amplia variedad de los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia 11,12. Un número de estudios han llevado a cabo en elel metabolismo del nitrógeno neumocócica y la regulación destacando la importancia de los aminoácidos y su papel en la virulencia 13,14. En este estudio, la respuesta transcriptómica de S. pneumoniae a la evolución de las concentraciones de L-serina, un ácido muy presentes en el plasma sanguíneo humano amino, se reportó el uso de microarrays de ADN. La respuesta transcriptómica de S. pneumoniae crecido en una concentración mínima de L-serina (150 mM) se comparó con la crecido en una concentración máxima (10 mM) de la serina. Se utilizó medio químicamente definido (CDM o medio mínimo) 15 para este estudio para controlar la concentración de serina. El objetivo de este estudio es hacer que esta técnica fácil de usar y proporcionar diferentes herramientas para la normalización y el análisis de datos. Por lo tanto, se han desarrollado una serie de herramientas para el análisis e interpretación de datos. FIVA (Funcional Information Viewer y Analyzer) proporciona una plataforma para procesamiento de la información contenida en grupos de genes que tienenlos patrones de expresión de genes similares y para la construcción de perfiles funcionales 16. FISCAL es otro paquete de software que facilita la identificación de las funciones y las anotaciones de genes putativos 17. Al hacer uso de métodos de agrupamiento, DIVULGAR proporciona un algoritmo de detección de ADN sitio de unión. Motivos Cis-regulador de los genes pueden proyectarse utilizando este algoritmo 18. Genome2D ofrece una plataforma basada en Windows para la visualización y análisis de datos transcriptoma ofreciendo gamas de colores diferentes para caracterizar los cambios en los niveles de expresión de genes en un mapa del genoma 19. El servidor web pimienta ofrece, además del método todo-en-un análisis, una caja de herramientas para la minería para regulons, promotores y de unión al factor de transcripción sitios de 20. Anotación completa de las regiones intergénicas en un genoma bacteriano se puede lograr mediante el uso de este paquete. Los biólogos pueden beneficiarse enormemente de pimienta, ya que les ofrece una plataforma para el diseño de experimentos para que la información hipótesis puede confirmarse in vitro 20. Estos paquetes de software contribuyen significativamente a la análisis de microarrays ya que la mayoría de ellos son libremente disponible y crea la normalización de datos y análisis muy fiable.
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Protocol
1. Preparación de los medios de comunicación, y cultivo celular
- Crecer S. D39 pneumoniae cepa de tipo salvaje 21 como se describió anteriormente 11. Inocular células almacenadas a -80 ° C en glicerol al 10% (con relación 1/100 en tubos de 50 ml estériles) en 50 ml químicamente medio definido (CDM) con un pH final de 6,4 15, pero omitir L-serina a partir del aminoácido mezcla.
Nota: se utilizaron dos MDL diferentes; uno que contiene una concentración mínima de L-serina (150 mM) y el otro que contiene una concentración máxima de L-serina (10 mM). Esta concentración mínima es básicamente la concentración de L-serina en el plasma sanguíneo humano y el objetivo es comparar la expresión de genes de S. pneumoniae cepa D39 bajo estas dos condiciones.
2. Aislamiento de ARN total
- Materiales
- Utilice fenol ácido, ARN de grado para el aislamiento de ARN total.
- Macaloide:
- Suspender 2 gramos deMacaloide en 100 ml de TE y hervir durante 5 minutos. Enfriar a temperatura ambiente y se somete a ultrasonidos hasta Macaloide gels.Centrifuge la solución a 2000 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente, se vuelve a suspender en 50 ml de TE pH 8 y se almacena a 4 ° C.
- Soluciones:
- Tratar a todos sus soluciones con pirocarbonato de dietilo (DEPC). Añadir 100 l DEPC / 100 ml de solución, incubar O / N a 37 ° C y autoclave durante 15 min.
- Metodología
- Crecer 50 ml de S. cultivo celular pneumoniae D39 en tubos de 50 ml a 37 ° C (sin agitación) hasta mediados de la fase exponencial (OD ~ 0,3). Culturas centrifugar a 4 ° C en 10000 × g durante 2 min. Deseche los medios de comunicación y congelar inmediatamente los sedimentos de células en nitrógeno líquido.
- Premix 300 l de cloroformo: IAA (24: 1) y 300 l de fenol (fenol ácido, ARN grado). Utilice 500 l de la fase orgánica en el paso 2.2.3.
- Preparar la siguiente mezcla con antelación en tubos con tapa de rosca-ARN libre: 00,5 g de perlas de vidrio, 50 l 10% de SDS, 500 l de fenol / cloroformo: IAA (tal como se preparó en el paso 2.2.2), la capa de Macaloide (150-175 l, no exacta ya que es muy viscoso). Resuspender los sedimentos de células en 400 l de TE (DEPC) y añadir las células resuspendidas en los tubos con tapa de rosca.
- Para romper las células, colocar los tubos con tapa de rosca en un batidor de bolas para pulsos 2x 60 "(" homogeneizar ") con 1 min de intervalo en el hielo. Centrifugar las muestras durante 10 min a 10.000 × g (4 ° C).
- Transferir la fase superior a un tubo nuevo, añadir 500 l de cloroformo: IAA (24: 1) y se centrifuga durante 5 min a 10.000 × g (4 ° C).
- Transferir 500 l de la fase superior a tubos nuevos, agregar 2 volúmenes (1 ml) de tampón de lisis / unión y mezclar pipeteando arriba y abajo. Aislar el ARN total usando el kit de aislamiento de ARN y seguir el protocolo recomendado fabricante.
3. ARN Limpieza
< ol>4. Análisis de ARN
- Determinar la concentración de ARN en un espectrofotómetro. Determinar la calidad del ARN mediante el uso de un ensayo de la siguiente manera (Figura 2).
- Diluir 1 l de muestra con 50 l de agua DEPC para obtener una concentración de 20 a 200 ng / l.
- Utilice 1 l muestra de ARN diluido para comprobar la calidad en la Bioanalyser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Nota: una relación de 23S: 16S de alrededor de 2,0 se considera bueno 1 A260 unidad de RNA corresponde a 40 mg / ml.. Una cantidad recomendada para el etiquetado es de 10-20 g.
5. Preparación de ADNc y Etiquetado
ntent "> NOTA: El siguiente protocolo se siguió para la preparación de cDNA y etiquetado.- Recocido
- Realizar reacción de hibridación en 300 tubos de PCR mu l, manteniendo la concentración de ARN total de 10-15 mg para las diapositivas hechas en casa o 5 mg para las diapositivas hechos a la empresa. Mezclar ARN con 2 nonamers l azar (1,6 g / l) y añadir agua libre de nucleasas si es necesario para mantener el volumen final de la mezcla de recocido a 18 l.
- Mantener la mezcla de hibridación a 70 ° C durante 5 min. Después de eso, enfriar la mezcla a TA durante 10 min (recocido) y si es necesario, de girar las reacciones a la parte inferior del tubo. Colocar los tubos de reacción en hielo durante al menos 1 min.
- Transcripción inversa
- Preparar la mezcla de la transcriptasa inversa de la siguiente manera: a la mezcla de recocido 18 l, añadir 12 l de mezcla Master (que consta de 6 l de tampón 5X First Strand, 3 l 0,1 M DDT, 1,2 l 25x AA-dUTP mezcla / nucleótidos y 1,8 l revertir transcriptase (1 l de diapositivas hechos a la empresa). Mantenga la mezcla de reacción durante 2-16 horas a 42 ° C.
6. La degradación de mRNA y purificación de cDNA
- Para degradar el ARNm a partir de la mezcla de reacción, añadir 3 l de 2,5 M NaOH y lugar a 37 ° C durante aproximadamente 15 min. A continuación añadir 15 l de 2M HEPES ácido libre para neutralizar el NaOH.
- Se purifica la mezcla de ADNc por PCR usando columnas de limpieza y siga el protocolo del fabricante.
7. Medición de cDNA Concentración
- Medir las concentraciones de ADNc en un espectrofotómetro. Para continuar con el etiquetado, comprobar que la concentración de ADNc es de al menos 60 ng / l (diapositivas caseras) o 20 ng / l (toboganes hechos a la empresa).
8. Etiquetado de cDNA con Amine reactiva Dye y Purificación
- Use colorante reactivo con aminas para etiquetar el ADNc. Mezclar directamente el ADNc con una alícuota (5 l) deamina reactiva tinte.
- Incubar la mezcla a RT, en la oscuridad, durante 60 a 90 min y proceder directamente a la purificación de cDNA marcado con colorante. Purificar cDNA marcado tinte usando PCR columnas de limpieza y siguiendo el protocolo del fabricante. Eluir cDNA en 50 l de tampón de elución.
9. Medición de cDNA Labelled
- Utilice un espectrofotómetro para medir la incorporación de colorantes reactivos con amina en el ADNc. Compruebe que la concentración de colorantes reactivos con amina es de al menos 0,5 pmol / l en un volumen total de 50 l.
10. Mezcla de muestras de cDNA Labelled
- Para diapositivas caseras, utilizar todo el cDNA marcado para la hibridación con diferencia no más de 30% en la concentración de ADNc. Para toboganes hechos a la compañía, use cDNA con no más de 2 veces la diferencia en la concentración de cDNA.
Nota: normalmente, se necesita alrededor de 300 ng de cDNA para diapositivas hechos a la empresa, lo cual es muy poco en comparación con el reqcantidad de cDNA pedirá otra para diapositivas caseras.
11. La hibridación y lavado
- Utilice los siguientes reactivos: agua desmineralizada, etanol 99%, Buffer SHY (hecho en casa; con 40 l de levadura ARN). Preparar máximo 1 ml de SHY.
- Aparato de preparación y soluciones
- Encienda concentradores de vacío y calentador al menos 1 hora antes de su secado. Encienda el horno de hibridación, con el punto de consigna ajustado a la temperatura de hibridación correcto (por S. pneumoniae microarrays de ADN, utilizar 45 ° C). Del mismo modo, precalentar casete de hibridación y horno durante 30-60 min.
- Precaliente búfer SHY a 68 ° C durante al menos 30 minutos.
- Preparación de la muestra (ADNc marcado)
- Combinar cantidades iguales de ADNc marcados (max 30% de diferencia). Secar la muestra usando los concentradores de vacío a alta temperatura (aprox. 40 min) hasta que el volumen es menor que 7 l.
- Lifter antideslizante
- Utilice levantador-se desliza limpias.Nota: ± 30 l se pueden cargar en la diapositiva.
- Limpie el levantador-se desliza con jabón, un montón de agua del grifo y etanol al 100%. Nota: Los resbalones levantador Dirty dan de alta de fondo.
- Deje secar al aire el levantador-se desliza con pistola de aire para soplar las partículas de polvo. Coloque un levantador antideslizante limpio en la diapositiva con el revestimiento de teflón blanco a los lados hacia abajo.
- La adición de tampón de hibridación (a ADNc marcado)
- Disolver las muestras de colorante secas en 7 l H 2 O y se incuba a 94 ° C durante 2 min.
- Inmediatamente, añadir 35 l precalentado búfer SHY (68 ° C), mezclar suavemente y girar a la velocidad máxima durante 1 minuto para deshacerse de precipitados. Precaliente la sonda a 68 ° C durante aproximadamente 5 minutos hasta que la carga.
- Deslice levantador de deslizamiento y montaje y de precalentamiento.
- Coloque el soporte de diapositivas hibridación en un bloque de calor a 50 ° C. Coloque las diapositivas de microarrays de ADN con el levantador de deslizamiento en el soporte de diapositivas hibridación climatizada y precalentar la diapositiva con levantador de deslizamiento por un minuto. Realice los siguientes pasos lo más rápido posible.
- Añadir 40 l de la muestra diana hasta el final de la diapositiva. Permitir que el fluido fluya entre las superficies de vidrio por la fuerza capilar. Realizar todas pipeteo lenta y cuidadosamente.
- Mantenga las diapositivas con elevador horizontal antideslizante en todo momento y se mueven lentamente para asegurarse de que el levantador de deslizamiento no se movió.
- Tome el casete de hibridación precalentado fuera del horno de hibridación y cerrar la máquina. Coloque papel de filtro empapado con 3 ml 2x SSC (citrato salino estándar) en el casete de hibridación.
- Coloque suavemente el soporte de diapositivas hibridación con las diapositivas en el casete de hibridación. Cierre el casete de hibridación y poner en el horno de hibridación de nuevo (por alrededor de 16 a 18 h).
- Lavado de diapositivas
- Preparar frescas de lavado-buffers I, II y III (750 ml por paso de lavado). Por 500 ml lavar-buffer I, utilizar 2 x SSC / SDS al 0,5%. Por 500 ml lavado buffer II, utilice 1 x SSC / SDS al 0,25%. Por 500 ml lavar-buffer III, use 1 x SSC / 0,1% SDS (opcional)
- Coloque los lavaderos tampones a 30 ° C (para asegurarse de SDS se disuelve).
- Sumergir los portaobjetos tan rápidamente como sea posible, pero muy suavemente, en un tubo Falcon de 50 ml lleno con el tampón de lavado I hasta que el vidrio se apoya en la parte inferior cónica del tubo.
- Después de unos segundos, cuando se hunde el levantador antideslizantes a la parte inferior del tubo, saque la diapositiva con pinzas sin rayar la matriz y poner en el estante de la estación de lavado. Continúe con el lavado con ningún espacio de tiempo.
- Lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado I (en una estación de lavado). Darle un segundo lavado durante 20-30 minutos en 500 ml lavar-buffer II (en una estación de lavado). Del mismo modo, lavar los portaobjetos durante 5 min en 500 ml de tampón de lavado III (opcional) (en una estación de lavado).
- Secar los portaobjetos durante 2 minutos a 2000 rpm.
Análisis de microarrays 12.
- Explorar imágenescon las respectivas longitudes de onda en el escáner y guardar en una carpeta "Jove Proyecto".
- Utilice software para analizar los archivos escaneados inicialmente como se describió anteriormente 22. Después de ejecutar este software, seleccione la pestaña "Abrir imagen" para cargar el archivo de imagen de color rojo (-.550) como "Rojo" y el archivo de imagen verde (-.635) como "Verde". Sube el archivo gal (.gal) con S. pneumoniae lista de arreglo de archivo de imagen al seleccionar "Cargar Lista de matrices" ficha 22.
Nota: esta lista de arreglo consistió en 48 cuadrículas, en cada cuadrícula había 16 filas y 15 columnas. Cada punto en la cuadrícula representa un solo gen y de información de puntos incluyendo el nombre de genes se añade a través de un archivo de descripción de lugar. Los números de punto se dan de izquierda a derecha y de arriba abajo. - Después de detectar cuidadosamente las rejillas, seleccione la pestaña "Buscar Array, Encuentra Bloques, Alinear Características" para alinear los puntos. Después de alinear todas las características, analizar la imagen seleccionando la opción "Analizar" tuna b. Crear un nuevo archivo con los resultados, histograma y diagrama de dispersión. Guarde este archivo de pestaña "Guardar los resultados como" como un archivo .gpr para su posterior análisis.
- Realice mayor normalización y tratamiento de datos con desarrollo propio paquete de software Microprep como se describe 9.
- Utilice biológicos repeticiones independientes para datos de microarrays de ADN que son de tinte intercambiado. Realizar implementación CyberT de una variante del t-test1 y calcular tasas de falso descubrimiento (FDR) como se describe 9.
- Para los genes expresados diferencialmente, tome p <0,001 y FDR <0,05 como estándar.
- Sube DNA microarrays de datos en la página de presentación NCBI para conseguir un número de acceso GEO (Expresión Génica Omnibus).
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Representative Results
ARN, aislamientos y análisis de ADNc
L-serina es uno de los aminoácidos esenciales y su concentración en el plasma sanguíneo humano varía desde 60 hasta 150 mM en niños y adultos. Su papel en la biosíntesis de purinas y pirimidinas destaca su importancia en el metabolismo y es un precursor de varios aminoácidos (glicina, cisteína y triptófano). Para estudiar el impacto de la L-serina en todo el transcriptoma de S. Se realizó pneumoniae D39 cepa de tipo salvaje, el análisis de microarrays de la cepa D39 crecido en CDM con una concentración mínima (150 mM) de L-serina en contra de que crecido en una concentración máxima (10 mM) en el mismo medio. En primer lugar, el ARN total a partir de células cultivadas en ambas concentraciones fue aislado. Las concentraciones de las muestras de ARN se dan en la Tabla 1. La calidad del RNA total se examinó utilizando el ensayo de control de calidad. ARN se trató con DNasa I antes de realizar esteensayo para eliminar la posible ADN genómico Figura 2 muestra la calidad del ARN.; carril L representa la escalera, carriles 1 y 2 representan ARN de 150μM serina y carriles 3 y 4 representan el ARN a partir de serina 10 mM. La presencia de dos bandas claras que corresponden a las dos subunidades de ARN indica la buena calidad de RNA y el siguiente paso del experimento se pudo realizar.
Después de medir la calidad de ARN, síntesis de ADNc se realizó. cDNA se formó mediante el uso de nanómeros aleatorios y la enzima transcriptasa inversa. Las concentraciones de las muestras de cDNA se dan en la Tabla 1. Este ADNc se marcó con colorantes reactivos con amina y las concentraciones de la cDNA marcado y etiquetas de tinte se dan en la Tabla 1. Después del marcaje, las muestras se mezclaron en consecuencia y luego se hibridan. Después del lavado, las diapositivas fueron escaneados utilizando el escáner, y se realizó el análisis utilizando el software Gen Pix Pro. La Figura 3 muestra la dispersiónanálisis de la representación de la relación de colorantes-amina reactiva. Tras el análisis inicial, los datos se analizaron mediante el paquete de software PicroPrep (PrePrep, Prep, PostPrep) 9 para reducir el ruido y Cyber-T se utilizó para el análisis final. La Tabla 2 resume los resultados de los estudios de microarrays después de aplicar los criterios de ≥ 2,0 diferencia y valor de p <0,001 veces. Un número de genes se expresaron diferencialmente en la presencia de un mínimo de L-serina en comparación con el máximo (Tabla 2).
Figura 1. Una visión general de la tecnología de microarrays de ADN. El ARN se aisló a partir del control y las muestras objetivo y etiquetado cDNA se hibrida a continuación.
La Figura 2.Verificación de la calidad del ARN aislado de S. células pneumoniae D39 cultivadas en la presencia de mínimo (150 mM) y máximo (10 mM) concentraciones de serina. Lane, L representa el tamaño escalera mientras que el carril 1 y 2 representan muestras de ARN aisladas a partir de células cultivadas en la presencia de concentración mínima serina. Del mismo modo, carril 3 y 4 representan muestras de ARN aisladas a partir de células cultivadas en presencia de la concentración máxima serina. Las bandas representan la 23S y 16S rRNA. La presencia de sólo dos bandas de muestra que no hay contaminación gDNA y ARN es de buena calidad.
Figura 3. Arreglo de dispersión comparación trama de una mezcla de la muestra. Cada punto en el gráfico representa el valor medio de expresión (log2) de un gen en un experimento con colorante 1 sobre el eje y y el colorante 2 en el eje-x.
| Muestra | ARN de la muestra | Descripción | La concentración de ARN (ng / l) | concentración de ADNc (ng / l) | CDNA Etiquetado (ng / l) | DyLight-550 (pmol / l) | DyLight-650 (pmol / l) | Esquema de hibridación |
| S1 | R1 | D39 de tipo salvaje crecido en MDL + Mínimo L-serina | 2057 | 255 | 225 | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | D39 de tipo salvaje crecido en MDL + Mínimo L-serina | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 de tipo silvestre crece en MDL + Máximo L-serina | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | D39 de tipo salvaje crecido en MDL + Maximum L-serina | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Tabla 1. esquema de hibridación de las muestras utilizadas en el análisis de microarrays.
| Gen una | Función b | Relación de c | |||
| SPD0600 | DivIB proteína división celular | 4 | |||
| SPD0445 | Fosfoglicerato quinasa | 3.5 | |||
| SPD0646 | Proteína hipotética | 3.4 | |||
| SPD0873 | Proteína hipotética | 3.3 | |||
| SPD1223 | Proteína hipotética | 3.3 | |||
| SPD0980 | Pyrophosphokinase ribosa-fosfato 2.8 | ||||
| SPD1628 | Fosforibosiltransferasa xantina | 2.7 | |||
| SPD1011 | Glicerato quinasa | 2.4 | |||
| SPD0645 | Proteína hipotética | 2.3 | |||
| SPD0564 | Proteína hipotética | 2.2 | |||
| SPD0641 | La manosa-6-fosfato isomerasa, clase I, ManA | 2.1 | |||
| SPD1333 | Proteína hipotética | 2.1 | |||
| SPD1384 | Proteína de la familia de flujo de salida de cationes | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP-glucosa 4-epimerasa, Gale-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-acetilglucosamina-6-fosfato histona, Naga | 2.1 | SPD0104 | Proteína de dominio LysM | 2 |
| SPD0140 | ABC transportador, la proteína de unión a ATP | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidasa C, PepC | 2 | |||
| SPD1350 | Proteína hipotética | 2 | |||
| SPD1822 | Ribosomal subunidad grande pseudouridina sintasa, la proteína RluD subfamilia | 2 | |||
| SPD0453 | Sistema de restricción-modificación de tipo I, S subunidad | -2 | |||
| SPD0459 | Proteína de choque térmico GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Adeniltransferasa de glucosa-1-fosfato | -2 | |||
| SPD1799 | Sensor histidina quinasa, putativo | -2,1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hydroxyacyl- (acil-carrier-proteína) dehidratasa Fabz | -2,2 | |||
| SPD1494 | Azúcar transportador ABC, proteína permeasa | -2,2 | |||
| SPD0974 | Clase glutamina amidotransferasa I, putativo | -2,4 | |||
| SPD1600 | Fosforibosiltransferasa Antranilato | -2,5 | |||
| SPD1472 | Isoleucil-tRNA sintetasa | -2,6 | |||
| SPD0681 | Proteína hipotética | -2,7 | |||
| SPD0501 | Antiterminator Transcripción, LICT | -3,4 |
Tabla 2. Lista de genes regulados en la comparación del transcriptoma de S. pneumoniae cepa D39 de tipo silvestre crece en CDM 15 con concentración mínima de L-serina y CDM 15 con la concentración máxima de L-serina. Un número de genes se refieren a las etiquetas locus D39. Anotación b D39 / 21 TIGR4 anotación. Ratio c representa el pliegue aumento / disminución en la expresión de genes en CDM-máximo en comparación con CDM-mínimo (signo menos indica regulación a la baja).
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Discussion
Se describe un protocolo fácil de usar que puede ser aplicado para realizar el análisis del transcriptoma enteras de bacterias. El punto clave de esta técnica en particular es que las condiciones en que se cosechan las células variará. Después de cosechar las células y el aislamiento de ARN, esta técnica se hace igual para todos los tipos de muestras bacterianas y sigue los pasos exactamente idénticos y por lo tanto, se puede aplicar a cualquier tipo de cultivo bacteriano. El protocolo es muy simple y conveniente y comienza a partir de aislamiento de ARN. Nuestro protocolo de aislamiento de ARN (usando un Macaloide y kit de aislamiento de ARN) es eficaz en el tiempo en comparación con fenol-cloroformo convencional y métodos de Trizol. En el siguiente paso, se lleva a cabo la preparación de ADNc con transcriptasa III enzima. A continuación, el etiquetado de los ADNc se realiza por primera mezcla de cDNA con colorantes reactivos con amina, y luego purificando el cDNA marcado. El etiquetado también es sencillo y no toma mucho tiempo que las muestras deben ser incubadas durante aproximadamente 1h en la oscuridad. Todos estos pasos se pueden realizar en cualquier laboratorio estándar, ya que no exige ningún equipo especializado. Se necesita un escáner de microarrays para escanear diapositivas. Para escanear diapositivas y el análisis, se utilizó el programa GenePix Pro, que es un programa muy simple y fácil de usar 22.
Después de hacer todos los experimentos, se realizó un análisis utilizando Microprep y CyberT. El paquete Microprep, consta de tres módulos, es decir, PrePreP, PREP y PostPreP 9. Este marco de pre-procesamiento de datos reduce el tiempo para la normalización de los datos y también reduce la cantidad de datos descartados. La facilidad con la que el software puede ser utilizado hace posible que el investigador tenga una comprensión de los datos de microarrays de ADN en un tiempo mínimo. Se tarda sólo un par de minutos para convertir los datos de la señal en bruto en datos de alta calidad para su posterior procesamiento después de que se realiza el análisis de imágenes de diapositivas. Un análisis más detallado en la piscina de genes regulados en el microarray se puede hacer uso de diferentes paquetes de software de la casa. Incluyen pimienta 20, 16 FIVA, DIVULGAR 18, FISCAL 17 y Genome2D 19. Estas herramientas basadas en Windows y paquetes de software son fáciles de usar y proporcionan un profundo conocimiento de los datos durante una investigación adicional. Estos paquetes de software hacen que sea muy fácil y muy útil para los investigadores que utilizan esta tecnología ya que los datos se vuelve mucho más significativo y relevante.
Los colorantes utilizados en microarrays se sabe que son susceptibles a un efecto de ozono, en donde los colorantes se vuelven inestables en presencia de ozono y fuerza de la señal es tan baja que no puede ser reconocido por el escáner. Colorantes reactivos con amina que son menos sensibles a la capa de ozono efecto se utilizan para etiquetar cDNA. La solución al ozono-efecto hará que esta tecnología aún mejor.
Una lista se ha creado de genes que estaban arriba o downregulated en la presencia de la mínima L-Serine concentración en comparación con el máximo (Tabla 2). Los genes upregulated se pueden clasificar de acuerdo a la función de su producto. Siete de ellos codifican proteínas hipotéticas, cuatro están involucrados en el transporte de carbohidratos y el metabolismo, una proteína de división celular DivIB, y ciertos genes de transporte de aminoácidos y el metabolismo. Del mismo modo, también hay ciertos genes que son regulados a la baja en nuestra condición probada. Un LicT regulador transcripcional BglG familiar, algunos genes de carbohidratos y algunos genes-aminoácido específico son algunos de los genes regulados negativamente. Una proteína GrpE de choque térmico también se encuentra entre los que las reguladas. Por lo tanto, este estudio proporciona una visión completa de los genes expresados diferencialmente en las condiciones ensayadas. Después del análisis de los resultados, a veces verificación de los resultados es necesario. Esto puede ser hecho por qPCR o ensayos de β-galactosidasa utilizando promotor lacZ fusiones.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Anne de Jong y Siger Holsappel para obtener ayuda con la producción de diapositivas microarrays de ADN. El apoyo de Anne de Jong para el análisis de la bioinformática también se agradece. También agradecemos a Jelle Slager para revisar el documento. Muhammad Afzal y Irfan Manzoor son apoyados por la Universidad GC, Faisalabad, Pakistán bajo el programa de desarrollo de la facultad de HEC Pakistán.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
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