This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.
Gen ifadesi ve düzenlenmesi, farklı koşullar altında hücrelerin davranışını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli teknikler gen ifadesini incelemek için günümüzde kullanılan, ama en tüm transcriptome ifade genel bir resmini sağlama açısından sınırlıdır. DNA mikro küresel gen ifadesinin tam bir bakış verir hızlı ve ekonomik araştırma teknolojisi, teklif ve binlerce analiz yardımcı da siteleri, hücrelerin transkripsiyonel aktivitesinin karakterizasyonu ve bağlayıcı yeni genlerin ve transkripsiyon faktörünün belirlenmesi gibi uygulamaların geniş bir dizi var genlerin (tek bir deneyde). Bu çalışmada, bir DNA mikro-dizi analizi için hücre hasat bakteriyel transcriptome analiz koşulları optimize edilmiştir. Dikkate zaman, maliyetler ve deneyler doğruluğu alarak, bu teknoloji platformu bakteriyel transcripto çalışmak için çok yararlı ve evrensel applicabale olduğunu kanıtlıyormes. Burada, biz S. transkripsiyonel yanıtları karşılaştırarak bir vaka çalışması olarak Streptococcus pneumoniae DNA mikroarray analizi gerçekleştirmek pneumoniae ortamda L-serin çeşitli konsantrasyonlarda varlığında büyütülür. Toplam RNA, RNA kalite kontrol kiti kullanılarak kontrol edilmiştir, bir RNA izolasyon kiti ve RNA kalitesi kullanılarak bir Macaloid yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. cDNA, ters transkriptaz kullanılarak elde edilmiştir ve cDNA numuneleri, iki amin-reaktan bir floresan boyalar biri kullanılarak etiketlenmiştir. Ev yapımı DNA mikro-dizi kayar bir cDNA mikrodizi veri ön-işlem çerçevesi (Microprep) kullanılarak analiz edildi etiketli cDNA numuneleri ve mikro-dizi verileri melezleştirme için kullanıldı. Son olarak, Sanal T istatistiksel olarak anlamlı farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin tanımlanması için Microprep kullanılarak oluşturulan verileri analiz etmek için kullanıldı. Ayrıca, in-house inşa yazılım paketleri (BİBER, FIVA, ACIKLANMASINI, Savcı, Genome2D) analiz için kullanıldıEldeki.
gen aşırı ifadesi veya nakavt de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda veya belirli koşullar altında bir tek hücreli organizma ya da bir ökaryotik hücrenin genomu tarafından kodlanan mRNA bolluğu (transcriptome) tüm dizi çalışma, transkriptomik olarak adlandırılır. Transcriptomics bize ölçüde genlerin bir zaman noktası, X de, belirli bir koşullar altında ifade edilmiştir ne gözlemlemek sağlar ve bize genler referansına göre ifade edilmiştir ne kadar güçlü hakkında bilgi verir.
Bir mikro-dizi, bir katı substrat üzerinde bir iki boyutlu dizi (genellikle bir cam slayt, veya silikon ince film hücre), yüksek ölçüde nüfus ayırımına ile biyolojik maddenin büyük miktarlarda analiz etmek için kullanılan ve küçültülmüş olabilir, birden fazla mesaj göndermiş ve paralel işleme ve tespit edilmesi yöntemleri. Mikrodiziler DNA mikrodiziler, protein mikrodizilerinin, peptid mikrodizilerinin, doku mikrodizilerinin, antikor mikroarrayler, hücresel mikroarray'ler ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli türleri, gelir. DNA mikrodizi olantemel olarak mikroskopik bir DNA noktalarından oluşan bir düzenek, katı bir yüzey, genellikle, cam sabitlenir. DNA mikro sıraları, bir genin ekspresyon seviyelerini ya da eş zamanlı olarak gen bir dizi ölçmek ya da bir genom 2,3 birden fazla bölge genotiplemesi için kullanılır. Bir prob pikomol (10 -12 mol), bir raportör olarak bilinen özel bir DNA dizisini temsil eder, her biri, DNA nokta içinde mevcuttur. örneklerden etiketli mRNA molekülleri 'hedefler' denir. Fluorophores prob-hedef hibridizasyonu ve fluoroforla işaretlenmiş hedeflerin tespiti ölçmek için kullanılan hedef nükleik asit dizilerinin göreceli olarak tespit eder. Bir dizi onlarca prob binlerce içerebilir çünkü mikroarray deney paralel çoklu genetik testler gerçekleştirebilirsiniz. basit bir mikro-dizi deney düzeni Şekil 1 'de gösterilmiştir. Son zamanlarda, bu diziler, bu teknik, oldukça maliyet-etkiliğin kılan, yeniden kullanılabilir bizim ve diğer laboratuarlarda kurulmuşör.
8 – Farklı RNA izolasyon ve saflaştırma teknikleri C-TAB, SDS ve GT yöntemleri dahil olmak üzere 4 yılda geliştirilmiştir. Ayrıca, birçok kit de kullanılabilir. Gen ekspresyonu için, yüksek kaliteli bir RNA çok önemlidir. Bu nedenle, bir RNA izolasyon yöntemleri RNA'nın bir maksimum miktarda elde etmek için modifiye edilir. Benzer şekilde, cDNA cDNA hazırlanması ve etiketleme için adımlar en aza indirilir. Taramadan sonra veri Normalleşme da in-house inşa yazılım paketleri ve araçları 9 kullanılarak verimli yapılır.
Streptococcus pneumoniae nazofarenks kolonize ve pnömoni, sepsis, orta kulak iltihabı gibi çoklu enfeksiyonlar nedenidir ve 10 menenjit bir Gram-pozitif patojendir. bakteri büyümesi ve hayatta kalma 11,12 için gerekli bir besin ve çeşitli kullanabilir. Bazı çalışmalar üzerinde gerçekleştirilmiştirAmino asitlerin önemi ve virülans 13,14 rollerini vurgulayan pnömokok azot metabolizması ve düzenlenmesi. Bu çalışmada, S. transkriptomik tepki pneumoniae L-serin, insan kan plazmasındaki bol miktarda bir amino asit, konsantrasyonlarının değiştirilmesi DNA mikrodizileri kullanılarak rapor edilmiştir. S. Transkriptomik tepki L-serin (150 uM), en az bir konsantrasyonda büyütüldü pneumoniae maksimum konsantrasyon serin (10 mM) yetiştirilen ile karşılaştırıldı. Kimyasal olarak tanımlanmış ortam (CDM veya minimal ortam) 15 serin konsantrasyonunu kontrol etmek için, bu çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmanın odak noktası bu teknik kullanıcı dostu yapmak ve veri normalleşmesi ve analizi için farklı araçları sağlamaktır. Bu nedenle, bir dizi araç analizi ve veri yorumlama geliştirilmiştir. FIVA (Fonksiyonel Bilgi Viewer ve Analiz) sahip genlerin kümeler halinde bulunan bilgi işlem için bir platform sağlarBenzer gen ifade kalıpları ve fonksiyonel profilleri 16 oluşturmak için. Savcı varsayılan fonksiyonları ve genlerin 17 açıklamaları belirlenmesini kolaylaştırır başka bir yazılım paketidir. Kümeleme yöntemlerinin kullanımı yaparak, ACIKLANMASINI bir DNA bağlanma sitesi algılama algoritması sağlar. Genlerin Cis- -regulatory motifleri bu algoritmayı 18 kullanılarak tahmin edilebilir. Genome2D bir genom haritası 19 gen ifadesi seviyelerindeki değişiklikleri karakterize farklı renk aralıkları sunarak görselleştirme ve transcriptome verilerinin analizi için Windows tabanlı bir platform sunuyor. BİBER webserver all-in-bir analiz yöntemi, regulonlar, destekleyiciler ve transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri 20 için madencilik için bir araç kutusuna ek olarak sunmaktadır. Bir bakteri genomuna arası bölgelerde tam açıklama bu paketi kullanılarak elde edilebilir. Bu deney tasarımı için onlara bir platform sunuyor Biyologlar büyük biber yararlanabilirs böylece hipotez bilgi vitro 20 teyit edilebilir. Çoğu serbestçe kullanılabilir ve veri normalleşme ve analiz çok güvenilir yapmak gibi bu yazılım paketleri mikroarray analizi önemli katkı sağlamaktadır.
Bu bakteri tüm transcriptome analizini gerçekleştirmek için uygulanabilir bir kullanıcı dostu bir protokol açıklar. Bu özel tekniği ile ilgili önemli bir nokta hücreler toplanır altında koşulu değişecektir olmasıdır. Hücreler ve RNA izolasyonu hasat ettikten sonra, bu teknik bakteri örnekleri, her türlü eşit hale gelir ve tam olarak aynı adımlar takip eder ve bu nedenle, bakteri kültürü her türlü tatbik edilebilir. protokol çok basit ve kullanışlı ve RNA izolasyonu başlar. (A Macaloid…
The authors have nothing to disclose.
Biz DNA mikro slayt üretimi ile yardım için Anne de Jong ve Siger Holsappel teşekkür ederiz. Biyoinformatik analiz için Anne de Jong destek de beğeni topluyor. Biz de kağıt gözden Jelle Slager teşekkür ederiz. Muhammed Afzal ve İrfan Manzoor YÖK Pakistan fakülte geliştirme programı kapsamında GC Üniversitesi, Faisalabad, Pakistan tarafından desteklenmektedir.
Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
Glass beads | 105015 | ||
Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
IAA | 106630 | ||
Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
Wipe | KIMTECH | ||
SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |