Abstract
Gen ifadesi ve düzenlenmesi, farklı koşullar altında hücrelerin davranışını anlamak için çok önemlidir. Çeşitli teknikler gen ifadesini incelemek için günümüzde kullanılan, ama en tüm transcriptome ifade genel bir resmini sağlama açısından sınırlıdır. DNA mikro küresel gen ifadesinin tam bir bakış verir hızlı ve ekonomik araştırma teknolojisi, teklif ve binlerce analiz yardımcı da siteleri, hücrelerin transkripsiyonel aktivitesinin karakterizasyonu ve bağlayıcı yeni genlerin ve transkripsiyon faktörünün belirlenmesi gibi uygulamaların geniş bir dizi var genlerin (tek bir deneyde). Bu çalışmada, bir DNA mikro-dizi analizi için hücre hasat bakteriyel transcriptome analiz koşulları optimize edilmiştir. Dikkate zaman, maliyetler ve deneyler doğruluğu alarak, bu teknoloji platformu bakteriyel transcripto çalışmak için çok yararlı ve evrensel applicabale olduğunu kanıtlıyormes. Burada, biz S. transkripsiyonel yanıtları karşılaştırarak bir vaka çalışması olarak Streptococcus pneumoniae DNA mikroarray analizi gerçekleştirmek pneumoniae ortamda L-serin çeşitli konsantrasyonlarda varlığında büyütülür. Toplam RNA, RNA kalite kontrol kiti kullanılarak kontrol edilmiştir, bir RNA izolasyon kiti ve RNA kalitesi kullanılarak bir Macaloid yöntemi kullanılarak izole edilmiştir. cDNA, ters transkriptaz kullanılarak elde edilmiştir ve cDNA numuneleri, iki amin-reaktan bir floresan boyalar biri kullanılarak etiketlenmiştir. Ev yapımı DNA mikro-dizi kayar bir cDNA mikrodizi veri ön-işlem çerçevesi (Microprep) kullanılarak analiz edildi etiketli cDNA numuneleri ve mikro-dizi verileri melezleştirme için kullanıldı. Son olarak, Sanal T istatistiksel olarak anlamlı farklı şekilde eksprese edilmiş genlerin tanımlanması için Microprep kullanılarak oluşturulan verileri analiz etmek için kullanıldı. Ayrıca, in-house inşa yazılım paketleri (BİBER, FIVA, ACIKLANMASINI, Savcı, Genome2D) analiz için kullanıldıEldeki.
Introduction
gen aşırı ifadesi veya nakavt de dahil olmak üzere, belirli bir zamanda veya belirli koşullar altında bir tek hücreli organizma ya da bir ökaryotik hücrenin genomu tarafından kodlanan mRNA bolluğu (transcriptome) tüm dizi çalışma, transkriptomik olarak adlandırılır. Transcriptomics bize ölçüde genlerin bir zaman noktası, X de, belirli bir koşullar altında ifade edilmiştir ne gözlemlemek sağlar ve bize genler referansına göre ifade edilmiştir ne kadar güçlü hakkında bilgi verir.
Bir mikro-dizi, bir katı substrat üzerinde bir iki boyutlu dizi (genellikle bir cam slayt, veya silikon ince film hücre), yüksek ölçüde nüfus ayırımına ile biyolojik maddenin büyük miktarlarda analiz etmek için kullanılan ve küçültülmüş olabilir, birden fazla mesaj göndermiş ve paralel işleme ve tespit edilmesi yöntemleri. Mikrodiziler DNA mikrodiziler, protein mikrodizilerinin, peptid mikrodizilerinin, doku mikrodizilerinin, antikor mikroarrayler, hücresel mikroarray'ler ve diğerleri dahil olmak üzere çeşitli türleri, gelir. DNA mikrodizi olantemel olarak mikroskopik bir DNA noktalarından oluşan bir düzenek, katı bir yüzey, genellikle, cam sabitlenir. DNA mikro sıraları, bir genin ekspresyon seviyelerini ya da eş zamanlı olarak gen bir dizi ölçmek ya da bir genom 2,3 birden fazla bölge genotiplemesi için kullanılır. Bir prob pikomol (10 -12 mol), bir raportör olarak bilinen özel bir DNA dizisini temsil eder, her biri, DNA nokta içinde mevcuttur. örneklerden etiketli mRNA molekülleri 'hedefler' denir. Fluorophores prob-hedef hibridizasyonu ve fluoroforla işaretlenmiş hedeflerin tespiti ölçmek için kullanılan hedef nükleik asit dizilerinin göreceli olarak tespit eder. Bir dizi onlarca prob binlerce içerebilir çünkü mikroarray deney paralel çoklu genetik testler gerçekleştirebilirsiniz. basit bir mikro-dizi deney düzeni Şekil 1 'de gösterilmiştir. Son zamanlarda, bu diziler, bu teknik, oldukça maliyet-etkiliğin kılan, yeniden kullanılabilir bizim ve diğer laboratuarlarda kurulmuşör.
8 - Farklı RNA izolasyon ve saflaştırma teknikleri C-TAB, SDS ve GT yöntemleri dahil olmak üzere 4 yılda geliştirilmiştir. Ayrıca, birçok kit de kullanılabilir. Gen ekspresyonu için, yüksek kaliteli bir RNA çok önemlidir. Bu nedenle, bir RNA izolasyon yöntemleri RNA'nın bir maksimum miktarda elde etmek için modifiye edilir. Benzer şekilde, cDNA cDNA hazırlanması ve etiketleme için adımlar en aza indirilir. Taramadan sonra veri Normalleşme da in-house inşa yazılım paketleri ve araçları 9 kullanılarak verimli yapılır.
Streptococcus pneumoniae nazofarenks kolonize ve pnömoni, sepsis, orta kulak iltihabı gibi çoklu enfeksiyonlar nedenidir ve 10 menenjit bir Gram-pozitif patojendir. bakteri büyümesi ve hayatta kalma 11,12 için gerekli bir besin ve çeşitli kullanabilir. Bazı çalışmalar üzerinde gerçekleştirilmiştirAmino asitlerin önemi ve virülans 13,14 rollerini vurgulayan pnömokok azot metabolizması ve düzenlenmesi. Bu çalışmada, S. transkriptomik tepki pneumoniae L-serin, insan kan plazmasındaki bol miktarda bir amino asit, konsantrasyonlarının değiştirilmesi DNA mikrodizileri kullanılarak rapor edilmiştir. S. Transkriptomik tepki L-serin (150 uM), en az bir konsantrasyonda büyütüldü pneumoniae maksimum konsantrasyon serin (10 mM) yetiştirilen ile karşılaştırıldı. Kimyasal olarak tanımlanmış ortam (CDM veya minimal ortam) 15 serin konsantrasyonunu kontrol etmek için, bu çalışma için kullanılmıştır. Bu çalışmanın odak noktası bu teknik kullanıcı dostu yapmak ve veri normalleşmesi ve analizi için farklı araçları sağlamaktır. Bu nedenle, bir dizi araç analizi ve veri yorumlama geliştirilmiştir. FIVA (Fonksiyonel Bilgi Viewer ve Analiz) sahip genlerin kümeler halinde bulunan bilgi işlem için bir platform sağlarBenzer gen ifade kalıpları ve fonksiyonel profilleri 16 oluşturmak için. Savcı varsayılan fonksiyonları ve genlerin 17 açıklamaları belirlenmesini kolaylaştırır başka bir yazılım paketidir. Kümeleme yöntemlerinin kullanımı yaparak, ACIKLANMASINI bir DNA bağlanma sitesi algılama algoritması sağlar. Genlerin Cis- -regulatory motifleri bu algoritmayı 18 kullanılarak tahmin edilebilir. Genome2D bir genom haritası 19 gen ifadesi seviyelerindeki değişiklikleri karakterize farklı renk aralıkları sunarak görselleştirme ve transcriptome verilerinin analizi için Windows tabanlı bir platform sunuyor. BİBER webserver all-in-bir analiz yöntemi, regulonlar, destekleyiciler ve transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri 20 için madencilik için bir araç kutusuna ek olarak sunmaktadır. Bir bakteri genomuna arası bölgelerde tam açıklama bu paketi kullanılarak elde edilebilir. Bu deney tasarımı için onlara bir platform sunuyor Biyologlar büyük biber yararlanabilirs böylece hipotez bilgi vitro 20 teyit edilebilir. Çoğu serbestçe kullanılabilir ve veri normalleşme ve analiz çok güvenilir yapmak gibi bu yazılım paketleri mikroarray analizi önemli katkı sağlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Medya hazırlanması, ve Hücre Kültürü
- S. büyütün Daha önce açıklandığı gibi 11 pneumoniae D39 yabani tip suşu 21. Kimyasal olarak 6.4 15 bir son pH Ortamı (CDM) Tanımlanmış 50 ml (50 ml, 1/100 oranında steril tüp) ile% 10 gliserol içinde o C -80 ° C'de muhafaza hücreleri ile inoküle, ancak bu amino asit, L-serin ihmal Karışım.
Not: İki farklı CDMS kullanıldı; L-serin (10 mM) olan maksimum bir konsantrasyonu ihtiva eden L-serin (150 uM) ve en az bir konsantrasyon ihtiva eden on. Bu minimum konsantrasyonu temelde insan kan plazmasındaki L-serin konsantrasyonudur ve amacı S. gen ekspresyonunu karşılaştırmaktır Bu iki koşul altında pneumoniae D39 suşu.
Toplam RNA İzolasyon 2.
- Malzemeler
- Toplam RNA'nın izolasyonu için bir asit fenol RNA cinsi kullanın.
- Macaloid:
- 2 gram Askıya100 mi TE içinde macaloid ve 5 dakika kaynatılır. 50 ml TE, pH 8 ve mağaza 4 ° C, oda sıcaklığında, 5 dakika, tekrar süspansiyon için 2000 x g 'de çözelti macaloid gels.Centrifuge kadar oda sonikasyon soğutun.
- Çözümler:
- Dietil pirokarbonat (DEPC) ile tüm çözümleri davranın. 15 dakika için 37 ° C 'de O / N inkübe ve otoklav, 100 ul DEPC / 100 ml çözelti ilave edin.
- Metodoloji
- S. 50 ml büyümeye orta-üstel faz (OD ~ 0.3) kadar 37 o C (hiçbir sallayarak) 50 ml'lik tüplerde pneumoniae D39 hücre kültürü. 2 dakika boyunca 10.000 x g, 4 ° C'de santrifüje kültürleri. Ortamı atılır ve hemen sıvı nitrojen içinde hücre pelletleri dondurma.
- Karışımlar 300 ul kloroform: IAA, (24: 1) ve 300 ul fenol (asit fenol RNA derecesi). Aşama 2.2.3 organik fazın 500 ul kullanın.
- RNA ücretsiz vidalı kapaklı tüpler önceden aşağıdaki karışımı hazırlayın: 00,5 gr cam boncuklar, 50 ul% 10 SDS, 500 ul fenol / kloroform: IAA, (aşama 2.2.2 gibi hazırlanan), macaloid katman (150-175 ml, daha çok yapışkan olduğundan tam olmayan şekilde). 400 ul TE (DEPC) hücre pelletleri tekrar ve vidalı kapaklı tüplere yeniden süspanse hücreleri ekleyin.
- Hücreleri kırmak için, buz üzerinde 1 dakika arayla 2x 60 "bakliyat için bir boncuk çırpıcı ('edilen homojen') vida kapaklı tüpler yerleştirin. Santrifüj 10,000 x g (4 ° C) 'de 10 dakika süre ile numuneler.
- , Yeni bir tüp, üst faz transfer 500 ul kloroform ekleyin: IAA (24: 1) ve santrifüj, 5 dakika boyunca 10,000 x g (4 ° C).
- Lizis / bağlanma tamponu 2 birimleri (1 mi) ilave yeni tüplere üst fazın 500 ul aktarın ve yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. RNA izolasyon kiti kullanılarak toplam RNA izole ve üreticisi firmalara tavsiye protokolü izleyin.
3. RNA Temizleme
< ol>RNA 4. analizi
- Bir spektrofotometre ile RNA konsantrasyonunun belirlenmesi. (Şekil 2) aşağıdaki gibi bir tahlil kullanılarak RNA kalitesini belirler.
- 20-200 ng / ul konsantrasyon elde etmek için saf suyun 50 ul örnek 1 ul seyreltin.
- Üreticinin talimatlarına göre BioAnalyser kaliteyi kontrol etmek 1 ul seyreltilmiş RNA örneği kullanın.
- Not: 23S bir oranı yaklaşık 2.0 16S iyi sayılır 1 A260 ünite RNA 40 ug / ml 'ye karşılık gelir.. Etiketleme için önerilen miktar 10-20 mikrogram olduğunu.
5. cDNA Hazırlama ve Etiketleme
ntent "> Not: Aşağıdaki protokol cDNA hazırlanması ve etiketleme için izledi.- Tavlama
- Ev yapımı slaytlar veya şirket yapılan slaytlar için 5 ug toplam RNA 10-15 mikrogram konsantrasyonunu tutarak, 300 ul PCR tüpleri tavlama reaksiyonu gerçekleştirin. 2 ul Rasgele nonamers (1.6 ug / ul) ile RNA karıştırın ve 18 ul bağlanma karışımının nihai bir hacim kalacak gerektiğinde nükleaz içermeyen su ilave edin.
- 5 dakika boyunca 70 ° C 'de tavlama karışımı tutun. Bundan sonra, 10 dakika (tavlama) oda sıcaklığında karışımı soğumaya ve gerekirse, tüpün dibine tepkileri aşağı doğru döndürün. En az 1 dakika boyunca buz üzerinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin.
- Ters Transkripsiyon
- T, 18 ul bağlanma karışımına ul ters 6 ul 5x birinci zincir tamponu oluşan 12 ul ana karışım (3 ul 0.1 M DDT, 1.2 ul 25x AA dUTP / nükleotid karışımı ve 1.8 ekleyin: aşağıdaki gibi ters transkriptaz karışımı hazırlayınranscriptase (şirket yapımı slaytlar için 1 ul). 42 ° C'de 2-16 saat boyunca, reaksiyon karışımı tutun.
6. mRNA Bozulması ve cDNA saflaştırılması
- Reaksiyon karışımından mRNA indirgeme, yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C de 3 2.5 M NaOH ul ve yeri ekleyin. 2M NaOH etkisiz hale getirmek için serbest asit HEPES Daha sonra, 15 ul ekle.
- PCR temizleme sütunlar kullanılarak cDNA karışımı arındırın ve üreticinin protokolünü takip ediniz.
CDNA Konsantrasyon 7. ölçümü
- Bir spektrofotometre üzerinde cDNA konsantrasyonları ölçün. Etiketleme ile devam etmek, cDNA konsantrasyonu en az 60 ng / ul (ev yapımı slaytlar) veya 20 ng / ul (şirket yapımı slaytlar) olup olmadığını kontrol edin.
Amin reaktif boya kullanılarak ve saflandırma için cDNA 8. Etiketleme
- CDNA etiket amin-reaktif boya kullanın. Doğrudan bir alikot (5 ul) ile cDNA karışımıamin-reaktif boya.
- 60-90 dakika boyunca, karanlıkta, oda sıcaklığında inkübe karışımı ve boya etiketli cDNA arıtılmadan doğrudan devam edin. PCR, temizleme kolonu kullanılarak ve üreticinin protokolü izlenerek, boya etiketli cDNA saflaştırılır. Elüsyon tamponu, 50 ul cDNA Zehir.
Etiketli cDNA 9. Ölçüm
- CDNA'ya amin-reaktif boyalar dahil edilmesini ölçmek için bir spektrofotometre kullanılır. Amin reaktif boyaların konsantrasyonu 50 ul bir toplam hacim içinde en azından 0.5 pmol / ul olduğundan emin olun.
Etiketli cDNA Örneklerinin 10. Karıştırma
- Ev yapımı slaytlar için cDNA konsantrasyonda en fazla 30% 'den fazla bir farkla hibridizasyon için tüm etiketli cDNA kullanın. Şirket yapımı slaytlar için, cDNAkonsantrasyonuyla 2 kat fark daha fazla olan cDNA kullanın.
Not: normal olarak, cDNA yaklaşık 300 ng şirketi yapımı slaytlar için gerekli olan, req ile karşılaştırıldığında çok küçük olanEv yapımı slaytlar için cDNA miktarını edinilmiş.
11. Hibritleşme ve Yıkama
- (40 ul maya RNA ile ev yapımı) demi su, etanol% 99, SHY Tampon: Aşağıdaki reaktifler kullanın. SHY maksimum 1 ml hazırlayın.
- Cihaz ve çözeltiler hazırlanması
- Kurutmadan önce vakum soğutucular ve ısıtıcı en az 1 saat açın. (45 ° C kullanın, S. pneumoniae DNA mikrodizilerinin için) doğru hibridizasyon sıcaklığı ayarlanabilir set noktası ile, hibridizasyon fırın açın. Benzer şekilde, 30-60 dakika boyunca melezleme kasetini ve yerleåtirmeden.
- En az 30 dakika boyunca 68 ° C'de ÇEKİNMEYEN tampon ısıtın.
- Örnek hazırlanması (cDNA etiketli)
- Etiketli cDNA'lann (maksimum% 30 fark) eşit miktarda birleştirin. Hacmi daha küçük 7 ul kadar yüksek sıcaklığı (yakl. 40 dk) vakum konsantratörü kullanarak örnek kurulayın.
- Kaldırma-slip
- Temiz kaldırıcı-fişleri kullanın.Not: 30 ul slayt üzerinde yüklenebilir ±.
- Sabun, musluk suyu ve% 100 etanol bol kaldırıcı-fişleri temizleyin. Not: Kirli kaldırıcı fişleri yüksek arka plan verin.
- Hava toz parçacıklarını uçurmak için havalı tabanca ile kaldırıcı-fişleri kurulayın. Yanlarda beyaz teflon kaplama aşağı bakacak şekilde slayt temiz bir kaldırıcı-slip yerleştirin.
- (Etiketli cDNA) hibridizasyon tamponu ekleme
- 7 ul H2O içinde kurutulmuştur boya örnekleri eritin ve 2 dakika boyunca 94 ° C'de inkübe edin.
- Hemen, 35 ul ısıtılmış SHY tampon (68 ° C) ekleyin çökeltilerin kurtulmak için 1 dakika maksimum hızda yavaşça ve spin karıştırın. Yüklenene kadar yaklaşık 5 dakika boyunca 68 ° C'de prob önceden ısıtın.
- Slide-kaldırıcı-kayma montaj ve ön ısıtma.
- 50 ° C'de bir ısı blokta hibridizasyon slayt tutucu yerleştirin. Isıtmalı hibridizasyon slayt tutucu ve p kaldırıcı kayma DNA mikroarray slaytlar yerleştirinBir dakika için kaldırıcı-kayma ile slayt ısıtın. Mümkün olduğunca çabuk bir sonraki adımları uygulayın.
- Sürgünün sonunda örnek hedef 40 ul ekle. Sıvı kılcal zorla cam yüzeyler arasında akmasına izin verin. Yavaş ve dikkatlice pipetlenmesini gerçekleştirin.
- Her zaman kaldırıcı kayma yatay ile slaytlar tutun ve kaldırıcı kayma kıpırdamadı emin olmak için yavaşça hareket ettirin.
- Melezleme fırın dışına önceden ısıtılmış hibridizasyon kaseti alın ve makineyi kapatın. Yer filtre kağıdı hibridizasyon kaset 3 ml 2x SSC (standart salin sitrat) ile ıslatılmış.
- Yavaşça melezleme kaset slaytlar ile melezleme slayt tutucu yerleştirin. Melezleme kasetini kapatın ve (yaklaşık 16-18 saat) fırında tekrar hibridizasyon koymak.
- Slayt yıkama
- I, II ve III, taze yıkama tamponları (yıkama adımı başına 750 mi) hazırlayın. 500 I-yıkama tamponu mi için, 2 x SSC /% 0.5 SDS kullanın. 500 için yıkama-buff mler II, 1 x SSC /% 0.25 SDS kullanın. 500 ml için yıkama tamponu III kullanımı 1 x SSC /% 0.1 SDS (isteğe bağlı)
- 30 ° C sıcaklıkta yıkama tampon yerleştirin (emin olmak için, SDS çözündürülür).
- Cam borunun konik alt üzerinde durana kadar 50 ml dolu bir Falcon tüpü içine, çok yavaşça mümkün olduğu kadar çabuk slaytlar daldırın ama yıkama tamponu.
- Tüpün dibine kaldırıcı-kayma lavabolar, dizi çizmeden cımbız ile slayt çıkar ve yıkama istasyonu rafa koymak bir kaç saniye sonra. Hiçbir zaman boşluğu ile yıkama ile devam edin.
- Yıkama tamponu ml (bir yıkama istasyonu) 500, 5 dakika için slaytlar yıkayın. Yıkama tampon ml 500 20-30 dakika (çamaşır istasyonu) II ikinci bir yıkama ver. Benzer bir şekilde, yıkama tampon ml 500, 5 dakika için slaytlar yıkama III (isteğe bağlı) (yıkama istasyonu).
- 2000 rpm'de 2 dakika için slaytlar kurutun.
12. Mikroarray Analizi
- Tarama görüntülerive tarayıcıya ilgili dalga boylarına sahip bir klasör "Vallahi Projesi" olarak kaydedin.
- Bu yazılımı çalıştırdıktan sonra, daha önce 22. açıklandığı gibi başlangıçta taranmış dosyaları analiz etmek yazılımını kullanın, "Kırmızı" ve yeşil görüntü dosyası (-.635) gibi kırmızı görüntü dosyası (-.550) yüklemek için "Görüntü Aç" sekmesini seçin "Yeşil". Sekmesini 22 "Yük Dizi Listesi" seçerek görüntü dosyası S. pneumoniae dizi listesi olan gal dosyası (.gal) yükleyin.
Not: Bu dizi listesi, 48 ızgaraları oluşan her ızgara üzerinde 16 satır ve 15 sütun vardı. Izgara üzerindeki her nokta bir tek geni temsil ve gen adı da dahil olmak nokta bilgileri spot açıklama dosyası aracılığıyla eklenir. Spot numaraları aşağıya sağa ve yukarıdan soldan verilir. - Dikkatle ızgaraları seçin sekmesini lekelenme sonra noktalar hizalamak için "Özellikler hizalama, Bloklar bul, Array bulun". Tüm özellikleri hizalama sonra, "Analiz" t seçerek görüntüyü analizAB. Sonuçlar, histogram ve scatter plot sahip yeni bir dosya oluşturun. "Farklı Kaydet sonuçları" sekmesi bu dosyayı kaydedin daha fazla analiz için bir .gpr dosyası olarak.
- 9 açıklandığı gibi in-house geliştirilen Microprep yazılım paketi ile daha da normalleşmesi ve veri işleme gerçekleştirin.
- Boya-takas DNA mikroarray verileri için bağımsız biyolojik çoğaltır kullanın. T-test1 bir varyantının CyberT uygulanmasını gerçekleştirmek ve hesaplamak yanlış keşif oranları (YTO) 9 tarif edilen.
- Farklı olarak ifade edilen genler için, bir standart olarak p <0.001 ve FDR <0.05 alır.
- Bir GEO (Gen İfadesi Omnibus) katılım numarası almak için NCBI gönderme sayfasından DNA mikroarray verileri yükleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RNA, cDNA izolasyonları ve analiz
L-serin temel amino asitlerinden biri olup, insan kan plazmasındaki konsantrasyonu, çocuklarda ve erişkinlerde 60-150 uM arasında değişmektedir. Pürin ve pirimidinlerin biyosentezinde rolü metabolizması önemini vurgular ve birkaç amino asitler (glisin, sistein ve triptofan) bir öncüsüdür. S. bütün transcriptome L-serin etkisini incelemek için, pneumoniae D39 vahşi tip suşu, aynı ortam içinde bir maksimum konsantrasyon (10 mM) içinde yetiştirilen karşı L-serin, minimum konsantrasyonda (150 uM) ile CDM yetiştirilen D39 soyunun mikrodizi analizi yapıldı. Her şeyden önce, her iki konsantrasyonda altında yetiştirilen hücrelerden toplam RNA izole edilmiştir. RNA örneklerinin konsantrasyonları, Tablo 1 'de verilmiştir. Toplam RNA niteliği kalite kontrol deneyi kullanılarak incelenmiştir. RNA, bu uygulamadan önce, DNase I ile işleme tabi tutulduTahlil mümkün genomik DNA kaldırmak için Şekil 2 RNA kalitesini gösterir.; şerit L merdiven temsil 1 ve 2, 10 mM serinden RNA ile 150 um serin ve şerit 3 ve 4 ile ilgili RNA ile şeritleri. iki RNA alt birimlerine karşılık gelen iki berrak bantların bulunması RNA kaliteli belirtilen ve Deneyin ikinci aşaması gerçekleştirilebilir.
RNA kalitesini ölçmek sonra, cDNA sentezi yapıldı. cDNA, rasgele nanomers ve ters transkriptaz enzimi kullanılarak oluşturulmuştur. cDNA numune konsantrasyonları, Tablo 1 'de verilmektedir. Bu cDNA, amin-reaktif boyalarla işaretlenmiş ve etiketlenmiş cDNA konsantrasyonları ve boya etiketleri etiketleme işleminden sonra, örnekler hibridize daha sonra buna göre karıştırılmış ve edildi. Tablo 1' de verilmiştir. Yıkama işleminden sonra, slaytlar tarayıcı kullanılarak tarandı ve analiz Gen Pix Pro yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Şekil 3 dağılımını göstermekteAmin reaktif boyalar oranının arsa analizi. İlk analizden sonra, veriler ayrıca son analiz için kullanılan gürültü ve Cyber-T azaltmak için PicroPrep yazılım paketi (PrePrep, Hazırlık, PostPrep) 9 kullanılarak analiz edildi. Tablo 2 ≥ 2.0 kriterleri uygulandıktan sonra mikroarray çalışmaların sonuçlarını özetlemektedir farkı ve p-değeri <0.001 kat. En (Tablo 2) ile karşılaştırıldığında bir takım genler farklı olarak en az L-serin eşliğinde olarak ifade edildi.
Şekil 1. DNA mikro-dizi teknolojisi. RNA'nın bir genel kontrol ve hedef numunelerinden izole edilmiş ve cDNA daha sonra hibridize edilir etiketlenmiştir.
Şekil 2.RNA kalitesi kontrol S. izole pneumoniae D39 hücreleri en az (150 uM) ve maksimum (10 mM), serin konsantrasyonları varlığında büyütülür. 1 şerit ve en az 2 serin konsantrasyonu varlığında büyüyen hücrelerden izole edilmiş RNA örnekleri temsil ederken Şerit L beden-merdiven temsil eder. Benzer şekilde, kuşak 3 ve 4 en yüksek serin konsantrasyonu varlığında büyüyen hücrelerden izole edilmiş RNA örnekleri temsil eder. bantları 23S ve 16S rRNA temsil eder. sadece iki bantların varlığı hiçbir gDNA kirlenme ve RNA kaliteli olduğunu gösterir.
Örnek bir karışımının Şekil 3. Dizi karşılaştırması saçılma grafiğidir. Plot her spot x-ekseni üzerinde, y-ekseni ve boya 2 boya 1 ile bir deney bir genin ortalama ekspresyon değeri (log 2) temsil etmektedir.
| Örnek | RNA, Örnek | Tanım | RNA yoğunluğu (ng / ml) | cDNA, yoğunluğu (ng / ml) | Etiketli cDNA'sı (ng / | il), | DyLight-550 (pmol / ul) | DyLight-650 (pmol / ul) | Hibridizasyon şeması |
| S1 | R1 | CDM + Minimum L-serin yetişen D39 vahşi tip | 2057 | 255 | 225 | 0,8 | R1 + R3 | |
| R2 | CDM + Minimum L-serin yetişen D39 vahşi tip | 2566 | 201 | 179 | 1.2 | R2 + R4, | ||
| S2 | R3 | D39 yabani tip CDM + Maksimum L-serin yetişen | 2831 | 292 | 276 | 2.3 | ||
| R4 | CDM + Max yetiştirilen D39 vahşi tipImum L-serin | 1867 | 172 | 150 | 1 |
Mikro-dizi analizi için kullanılan numuneler Tablo 1. hibridizasyon düzeni.
| Gen bir | Fonksiyon b | Oran C | |||
| SPD0600 | Hücre bölünmesi proteini DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | Fosfogliserat kinaz | 3,5 | |||
| SPD0646 | Varsayımlı proteini | 3.4 | |||
| SPD0873 | Varsayımlı proteini | 3.3 | |||
| SPD1223 | Varsayımlı proteini | 3.3 | |||
| SPD0980 | Riboz-fosfat pirofosfokinaz 2.8 | ||||
| SPD1628 | Ksantin fosforibosiltransferazı | 2.7 | |||
| SPD1011 | Gliserat kinaz | 2.4 | |||
| SPD0645 | Varsayımlı proteini | 2.3 | |||
| SPD0564 | Varsayımlı proteini | 2.2 | |||
| SPD0641 | Mannoz-6-fosfat izomeraz, sınıf I, Mana | 2.1 | |||
| SPD1333 | Varsayımlı proteini | 2.1 | |||
| SPD1384 | Katyon akış ailesi proteini | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP-glukoz 4-epimeraz, gale-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N-asetilglukosamin-6-fosfat deasetilaz Naga | 2.1 | SPD0104 | LysM domain proteini | 2 |
| SPD0140 | ABC transportör ATP-bağlama proteini | 2 | |||
| SPD0261 | Aminopeptidaz C PEPC | 2 | |||
| SPD1350 | Varsayımlı proteini | 2 | |||
| SPD1822 | Ribozomal geniş altünite pseudouridine sintaz, RluD alt familyası proteini | 2 | |||
| SPD0453 | Tip I kısıtlama modifikasyon sistemi, S alt-birimi | -2 | |||
| SPD0459 | Isı şok proteini GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | Glukoz-1-fosfat adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | Sensör histidin kinaz, farazi | -2.1 | </ Tr>|||
| SPD0387 | Beta-hidroksiaçil (asil taşıyıcı protein) dehidrataz fabz | -2,2 | |||
| SPD1494 | Şeker ABC taşıyıcı, permeaz proteini | -2,2 | |||
| SPD0974 | Sınıf I glutamin amidotransferaz, farazi | -2.4 | |||
| SPD1600 | Antranilat phosphoribosyltransferase | -2.5 | |||
| SPD1472 | Izolösil-tRNA sentetaz | -2.6 | |||
| SPD0681 | Varsayımlı proteini | -2.7 | |||
| SPD0501 | Deşifre antiterminator, Lict | -3,4 |
S. transcriptome karşılaştırıldığında ayarlı genlerin Tablo 2. listesi pneumoniae suşu D39 yabani tip CD yetişenL-serin maksimum konsantrasyonu ile az L-serin konsantrasyonu ve CDM 15 M 15. Gene numaraları D39 lokusu etiketleri bakınız. B D39 açıklama / TIGR4 açıklama 21 c. Oranı genlerin ifadesinde kat artış / azalış temsil CDM-maksimum (eksi işareti regülasyonunu gösterir) CDM-minimuma kıyasla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu bakteri tüm transcriptome analizini gerçekleştirmek için uygulanabilir bir kullanıcı dostu bir protokol açıklar. Bu özel tekniği ile ilgili önemli bir nokta hücreler toplanır altında koşulu değişecektir olmasıdır. Hücreler ve RNA izolasyonu hasat ettikten sonra, bu teknik bakteri örnekleri, her türlü eşit hale gelir ve tam olarak aynı adımlar takip eder ve bu nedenle, bakteri kültürü her türlü tatbik edilebilir. protokol çok basit ve kullanışlı ve RNA izolasyonu başlar. (A Macaloid ve RNA izolasyon kiti kullanılarak) Bizim RNA izolasyonu protokolü zaman etkili geleneksel fenol-kloroform ve Trizol yöntemlere göre olduğu gibi. Bir sonraki adımda, transkriptaz III enzimi ile cDNA nın hazırlanması, gerçekleştirilir. Daha sonra, cDNA etiketleme amin-reaktif boyalarla cDNA'nın ilk karıştırma yapılır ve daha sonra etiketlenmiş cDNA saflaştırılması. etiketleme de basit ve örnekler yaklaşık 1 inkübe edilmesi gerekir gibi çok zaman almazKaranlıkta sa. Herhangi bir özel ekipman talep etmez gibi tüm bu adımları herhangi bir standart laboratuvarda yapılabilir. Bir mikrodizi tarayıcı slaytları taramak için gereklidir. Slayt tarama ve analiz için, GenePix Pro programı çok basit ve kullanıcı dostu bir programdır 22 olan kullanılır.
Tüm deneyler yaptıktan sonra, analiz MicroPrep ve CyberT kullanılarak yapıldı. MicroPrep paketi, üç modülden, yani, PrePreP, hazırlık ve PostPreP 9 oluşmaktadır. Bu veriler önceden işleme çerçeve verilerinin normalleşmesi için zamanı azaltır ve aynı zamanda atılır veri miktarını azaltır. Araştırmacı minimum süre DNA mikroarray verilerinin bir anlayışa sahip yazılım kullanılabileceği kolaylığı mümkün kılar. Bu slayt görüntü analizi yapıldıktan sonra daha fazla işlem için yüksek kaliteli veri ham sinyal verilerini dönüştürmek için dakika sadece bir çift alır. MICR düzenlenen genlerin havuzu daha fazla analizioarray farklı içi yazılım paketleri kullanılarak yapılabilir. Onlar BİBER 20, FIVA 16, ACIKLANMASINI 18, Savcı 17 ve Genome2D 19 içermektedir. Bunlar Windows tabanlı araçları ve yazılım paketleri kullanıcı dostu ve daha fazla araştırma sırasında veri içine derin kavrayış sağlamak. Bu yazılım paketleri çok kolay ve kullanışlı bir veri çok daha anlamlı ve alakalı hale gibi araştırmacılar bu teknolojiyi kullanmak için yapmak.
mikrodizileri kullanılan boyalar boyaları bu tarayıcı tarafından kabul edilemez şekilde düşük ozon ve sinyal kuvvetinin varlığında, kararsız hale bir ozon etkisi duyarlı olduğu bilinmektedir. Ozon etkisine daha az duyarlı olan amin-reaktif boyalar cDNA etiketlemek için kullanılır. ozon etkisi çözüm bu teknoloji daha iyi yapacaktır.
Bir liste yukarı olan genlerin oluşturulan veya minimal L-ser varlığında downregüle edildien (Tablo 2) ile karşılaştırıldığında ine konsantrasyonu. upregüle genlerin kendi ürünün işlevine göre kategorize edilebilir. Bunların yedisi varsayımsal proteinler, dört karbonhidrat taşıma ve metabolizma, bir hücre bölünmesi proteini DivIB ve bazı amino asit taşıma ve metabolizma genlerinde katılıyor kodlamak. Benzer şekilde, aynı zamanda bizim test durumda downregüle belirli genler vardır. Bir BglG-aile transkripsiyonel regülatör LicT, bazı karbonhidrat genler ve bazı amino asit spesifik genler baskılanmış genlerin arasındadır. Bir ısı şok proteini GrpE aşağı-regüle olanlar arasındadır. Bu nedenle, bu çalışmada farklı olarak test koşulları altında ifade genlerin tam bir genel bakış sağlar. Sonuçların analizinden sonra, sonuçların bazen doğrulama gereklidir. Bu sonuç, ya lacZ promoteri füzyonlarının kullanıldığı qPCR veya β-galaktosidaz tahlilleri ile yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Biz DNA mikro slayt üretimi ile yardım için Anne de Jong ve Siger Holsappel teşekkür ederiz. Biyoinformatik analiz için Anne de Jong destek de beğeni topluyor. Biz de kağıt gözden Jelle Slager teşekkür ederiz. Muhammed Afzal ve İrfan Manzoor YÖK Pakistan fakülte geliştirme programı kapsamında GC Üniversitesi, Faisalabad, Pakistan tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods. 65, 217-223 (1983).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Galau Levi, A., A, G., Wetzstein, H. Y. A rapid procedure for the isolation of RNA from high-phenolic-containing tissues of pecan. 27 (12), 1316-1318 (1992).
- Lopez-Gomez, R., Gomez-Lim, M. A. A method for extraction of intact RNA from fruits rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. (5), 440-442 (1992).
- Salzman, R. A., Fujita, T., Salzman, Z., Hasegawa, P. M., Bressan, R. A improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates. Plant Molecular Biology Report. 17, 11-17 (1999).
- Kiefer, E., Heller, W., Ernst, D. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Plant Mol. Biol. Report. 18, 33-39 (2000).
- Tattersall, E. A. R., Ergul, A., Alkayal, F., Deluc, L., Cushman, J. C., Cramer, G. R. Comparison of methods for isolating high-quality RNA from leaves of grapevine. Am. J. Enol. Vitic. 56, 400-406 (2005).
- Van Hijum, S. A. F. T., Garcia de la Nava, J., Trelles, O., Kok, J., Kuipers, O. P. MicroPreP: a cDNA microarray data pre-processing framework. Appl.Bioinformatics. 2, 241-244 (2003).
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nat.Rev.Microbiol. 6, 288-301 (2008).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Kuipers, O. P. LacR is a repressor of lacABCD and LacT is an activator of lacTFEG, constituting the lac gene cluster in Streptococcus pneumoniae. Appl. Environ. Microbiol. 80, 5349-5358 (2014).
- Afzal, M., Shafeeq, S., Henriques-Normark, B., Kuipers, O. P. UlaR activates the expression of the ula operon in Streptococcus pneumoniae in the presence of ascorbic acid. Microbiol. Read. Engl. , (2014).
- Hendriksen, W. T., et al. Site-specific contributions of glutamine-dependent regulator GlnR and GlnR-regulated genes to virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun. 76, 1230-1238 (2008).
- Kloosterman, T. G., Kuipers, O. P. Regulation of arginine acquisition and virulence gene expression in the human pathogen Streptococcus pneumoniae by transcription regulators ArgR1 and AhrC. J. Biol. Chem. 286, 44594-44605 (2011).
- Kloosterman, T. G., Bijlsma, J. J. E., Kok, J., Kuipers, O. P. To have neighbour's fare: extending the molecular toolbox for Streptococcus pneumoniae. Microbiol. Read. Engl. 152, 351-359 (2006).
- Blom, E. J., et al. FIVA: Functional Information Viewer and Analyzer extracting biological knowledge from transcriptome data of prokaryotes. Bioinforma. Oxf. Engl. 23, 1161-1163 (2007).
- Blom, E. J., et al. Prosecutor: parameter-free inference of gene function for prokaryotes using DNA microarray data, genomic context and multiple gene annotation sources. BMC Genomics. 9, 495 (2008).
- Blom, E. J., et al. DISCLOSE : DISsection of CLusters Obtained by SEries of transcriptome data using functional annotations and putative transcription factor binding sites. BMC Bioinformatics. 9, 535 (2008).
- Baerends, R. J. S., et al. Genome2D: a visualization tool for the rapid analysis of bacterial transcriptome data. Genome Biol. 5 (5), R37 (2004).
- De Jong, A., Pietersma, H., Cordes, M., Kuipers, O. P., Kok, J. PePPER, a webserver for prediction of prokaryote promoter elements and regulons. BMC Genomics. 13, 229 (2012).
- Lanie, J. A., et al. Genome sequence of Avery's virulent serotype 2 strain D39 of Streptococcus pneumoniae and comparison with that of unencapsulated laboratory strain R6. J. Bacteriol. 189, 38-51 (2007).
- Molecular Devices, Corp. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners-Use's Guide and Tutorial. , Molecular Devices, Corp. (2005).
