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Biology

बैक्टीरियल transcriptome विश्लेषण प्रकरण अध्ययन के लिए एक तेज और विश्वसनीय पाइपलाइन: सेरीन निर्भर जीन विनियमन में Published: April 25, 2015 doi: 10.3791/52649
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1
1Department of Molecular Genetics, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department of Bioinformatics and Biotechnology, Government College University Faisalabad

Abstract

जीन अभिव्यक्ति और उसके विनियमन अलग अलग परिस्थितियों में कोशिकाओं के व्यवहार को समझने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हैं। विभिन्न तकनीकों जीन की अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए आजकल इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन सबसे पूरे transcriptome की अभिव्यक्ति का एक समग्र तस्वीर को उपलब्ध कराने के संदर्भ में सीमित कर रहे हैं। डीएनए वैश्विक जीन अभिव्यक्ति की एक पूरी सिंहावलोकन देता है जो एक तेजी से और आर्थिक अनुसंधान प्रौद्योगिकी, प्रदान करते हैं और हजारों का विश्लेषण करने में मदद भी साइटों, कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के लक्षण वर्णन और बाध्यकारी उपन्यास जीन और प्रतिलेखन कारक की पहचान सहित अनुप्रयोगों का एक विशाल संख्या है जीन की (एक ही प्रयोग में)। वर्तमान अध्ययन में, डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए सेल फसल से बैक्टीरियल transcriptome विश्लेषण के लिए शर्तों को अनुकूलित किया गया है। खाते में समय, लागत और प्रयोगों की सटीकता ले रहा है, इस प्रौद्योगिकी मंच बैक्टीरियल transcripto के अध्ययन के लिए बहुत ही उपयोगी और सार्वभौमिक applicabale होना साबित करता हैएमईएस। यहाँ, हम एस के ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं की तुलना द्वारा एक मामले के अध्ययन के रूप में स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के साथ डीएनए माइक्रोएरे विश्लेषण प्रदर्शन निमोनिया माध्यम में एल सेरीन सांद्रता बदलती की मौजूदगी में हो। कुल शाही सेना के एक शाही सेना गुणवत्ता की जांच किट का उपयोग करके जाँच की थी एक शाही सेना अलगाव किट और शाही सेना की गुणवत्ता का उपयोग कर एक Macaloid विधि का उपयोग कर अलग किया गया था। सीडीएनए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग कर तैयार किया गया था और सीडीएनए नमूने दो एमाइन प्रतिक्रियाशील फ्लोरोसेंट रंगों में से एक का उपयोग कर लेबल थे। घर का डीएनए माइक्रोएरे स्लाइड एक सीडीएनए माइक्रोएरे डेटा पूर्व प्रसंस्करण फ्रेमवर्क (Microprep) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया लेबल किया सीडीएनए नमूने और माइक्रोएरे डेटा के संकरण के लिए इस्तेमाल किया गया। अंत में, साइबर टी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण विभिन्न व्यक्त जीनों की पहचान के लिए Microprep का उपयोग कर उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इसके अलावा, घर में निर्मित सॉफ्टवेयर पैकेज (काली मिर्च, FIVA का खुलासा, अभियोजक, Genome2D) का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गयाडेटा।

Introduction

जीन overexpression या नाक आउट सहित, एक विशिष्ट समय में या एक विशिष्ट शर्त के तहत एक कोशिकीय जीव या एक यूकेरियोटिक सेल के जीनोम द्वारा इनकोडिंग mRNA के बहुतायत (transcriptome) के पूरे सेट का अध्ययन, transcriptomics कहा जाता है। Transcriptomics हमें हद तक जीन एक समय बिंदु एक्स पर एक विशेष शर्त के तहत व्यक्त कर रहे हैं कि क्या करने के लिए निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है और हमें जीन एक संदर्भ के सापेक्ष व्यक्त कर रहे हैं कि कैसे दृढ़ता के बारे में जानकारी देता है।

एक माइक्रोएरे एक ठोस सब्सट्रेट पर एक दो आयामी सरणी (आमतौर पर एक गिलास स्लाइड या सिलिकॉन पतली फिल्म सेल) उच्च throughput स्क्रीनिंग का उपयोग कर जैविक सामग्री की एक बड़ी मात्रा परख के लिए इस्तेमाल किया, और छोटी किया जा सकता है, मल्टिप्लेक्स और समानांतर प्रसंस्करण और पहचान है तरीकों। डीएनए-प्रोटीन, प्रोटीन, पेप्टाइड प्रोटीन, ऊतक, एंटीबॉडी, सेलुलर प्रोटीन और अन्य लोगों सहित विभिन्न प्रकार में आते हैं। एक डीएनए माइक्रोएरे हैमूल रूप से सूक्ष्म डीएनए स्थलों में से एक विधानसभा एक ठोस सतह, आमतौर पर कांच के लिए तय की। डीएनए एक जीन की अभिव्यक्ति के स्तर या एक साथ जीनों का एक सेट को मापने के लिए या एक जीनोम 2,3 के कई क्षेत्रों जीनोटाइप के लिए उपयोग किया जाता है। एक जांच के picomoles (10 -12 मोल) भी एक पत्रकार के रूप में जाना जाता है एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रत्येक डीएनए स्थान के भीतर मौजूद हैं। नमूनों से लेबल किया mRNA के अणुओं 'लक्ष्य' कहा जाता है। Fluorophores जांच-लक्ष्य संकरण और फ्लोरोफोरे लेबल लक्ष्य का पता लगाने के उपाय करने के लिए उपयोग किया जाता है लक्ष्य में न्यूक्लिक एसिड दृश्यों के रिश्तेदार बहुतायत निर्धारित करता है। एक सरणी दसियों जांच के हजारों की हो सकती है क्योंकि एक माइक्रोएरे प्रयोग समानांतर में कई आनुवंशिक परीक्षण पूरा कर सकते हैं। एक साधारण माइक्रोएरे प्रयोग के लेआउट चित्र 1 में दिखाया गया है। हाल ही में, यह इन सरणियों इस तकनीक काफी लागत प्रभावी ढंग से है, जो पुन: प्रयोज्य हैं कि हमारे और अन्य प्रयोगशालाओं में स्थापित किया गया थाई।

8 - अलग शाही सेना अलगाव और शोधन तकनीक सी-टैब, एसडीएस और जी.टी. विधियों 4 सहित वर्षों में विकसित किया गया है। इसके अलावा, कई वाणिज्यिक किट भी उपलब्ध हैं। जीन अभिव्यक्ति के लिए उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए बहुत महत्वपूर्ण है। इसलिए, आरएनए अलगाव विधियों शाही सेना की अधिकतम मात्रा प्राप्त करने के लिए संशोधित कर रहे हैं। इसी तरह, सीडीएनए की सीडीएनए तैयारी और लेबलिंग के लिए चरणों को कम से कम कर रहे हैं। स्कैनिंग के बाद डेटा को सामान्य बनाने के भी घर में निर्मित सॉफ्टवेयर संकुल और उपकरणों के 9 का उपयोग करके कुशलता से किया जाता है।

स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया nasopharynx colonizes और ऐसे निमोनिया, पूति, ओटिटिस मीडिया के रूप में कई के संक्रमण के कारण होता है और 10 मैनिंजाइटिस कि एक ग्राम पॉजिटिव मानव रोगजनक है। जीवाणु विकास और अस्तित्व 11,12 के लिए आवश्यक पोषक तत्वों की एक विस्तृत विविधता का उपयोग कर सकते हैं। अध्ययन का एक नंबर पर बाहर किया गया हैअमीनो एसिड के महत्व और डाह 13,14 में उनकी भूमिका पर बल न्यूमोकोकल नाइट्रोजन चयापचय और विनियमन। इस अध्ययन में, एस के transcriptomic प्रतिक्रिया निमोनिया एल सेरीन, मानव रक्त प्लाज्मा में बहुतायत से मौजूद एक एमिनो एसिड की सांद्रता बदलने के लिए डीएनए का उपयोग कर सूचना दी है। एस के transcriptomic प्रतिक्रिया एल सेरीन (150 माइक्रोन) की एक न्यूनतम एकाग्रता में उगाई निमोनिया एक अधिकतम एकाग्रता सेरीन का (10 मिमी) में उगाया जाता है कि की तुलना में था। रासायनिक परिभाषित मध्यम (सीडीएम या कम से कम मध्यम) 15 सेरीन की एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस अध्ययन का ध्यान इस तकनीक उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने के लिए और डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण के लिए विभिन्न उपकरण उपलब्ध कराने के लिए है। इसलिए, उपकरणों की एक संख्या विश्लेषण और डेटा व्याख्या के लिए विकसित किए गए। FIVA (कार्यात्मक सूचना दर्शक और विश्लेषक) होने के जीन के समूहों में निहित प्रसंस्करण जानकारी के लिए एक मंच प्रदान करता हैइसी तरह के जीन अभिव्यक्ति पैटर्न और कार्यात्मक प्रोफाइल को 16 के निर्माण के लिए। अभियोजक ख्यात कार्यों और जीन 17 का एनोटेशन की पहचान की सुविधा है कि एक और सॉफ्टवेयर पैकेज है। क्लस्टरिंग विधियों का उपयोग करके खुलासा एक डीएनए बाध्यकारी साइट का पता लगाने एल्गोरिथ्म प्रदान करता है। जीनों का सीआईएस -regulatory रूपांकनों इस एल्गोरिथ्म 18 का उपयोग करके पेश किया जा सकता है। Genome2D एक जीनोम मानचित्र पर 19 जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन चिह्नित करने के लिए अलग अलग रंग पर्वतमाला की पेशकश के द्वारा दृश्य और transcriptome डेटा के विश्लेषण के लिए एक Windows आधारित मंच प्रदान करता है। काली मिर्च वेबसर्वर सभी में एक विश्लेषण विधि, regulons, प्रमोटरों और प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों 20 के लिए खनन के लिए एक उपकरण बॉक्स के अलावा, प्रदान करता है। एक जीवाणु जीनोम में intergenic क्षेत्रों का पूरा एनोटेशन इस पैकेज का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रयोग डिजाइनिंग के लिए उन्हें एक मंच प्रदान करता है के रूप में जीव बहुत काली मिर्च से फायदा हो सकता हैएस इतना है कि धारणा जानकारी विट्रो 20 में पुष्टि की जा सकती है। उनमें से ज्यादातर आसानी से उपलब्ध हैं और डेटा सामान्यीकरण और विश्लेषण बहुत विश्वसनीय बनाने के रूप में इन सॉफ्टवेयर संकुल माइक्रोएरे विश्लेषण करने के लिए काफी योगदान करते हैं।

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Protocol

1. मीडिया की तैयारी, और सेल संस्कृति

  1. एस बढ़ो पहले से 11 के रूप में वर्णित निमोनिया D39 जंगली प्रकार के तनाव में 21। रासायनिक 6.4 15 के अंतिम पीएच के साथ मध्यम (सीडीएम) परिभाषित 50 मिलीलीटर में (50 मिलीलीटर में 1/100 अनुपात बाँझ ट्यूबों के साथ) 10% ग्लिसरॉल में सी ओ -80 में संग्रहीत कोशिकाओं टीका लगाना, लेकिन एमिनो एसिड से एल सेरीन न आना मिश्रण।
    नोट: दो अलग अलग CDMs इस्तेमाल किया गया; एल सेरीन (10 मिमी) की एक अधिकतम एकाग्रता युक्त एल सेरीन (150 माइक्रोन) और अन्य की एक न्यूनतम एकाग्रता युक्त एक। यह न्यूनतम एकाग्रता मूल रूप से मानव रक्त प्लाज्मा में एल सेरीन की एकाग्रता और उद्देश्य एस के जीन की अभिव्यक्ति तुलना करने के लिए है इन दो शर्तों के तहत निमोनिया D39 तनाव।

कुल शाही सेना के 2. अलगाव

  1. सामग्री
    1. कुल शाही सेना के अलगाव के लिए एसिड फिनोल, आरएनए ग्रेड का उपयोग करें।
    2. Macaloid:
      1. की 2 ग्राम निलंबित100 मिलीलीटर ते में macaloid और 5 मिनट के लिए उबाल लें। 50 मिलीलीटर ते पीएच 8 और दुकान पर 4 डिग्री सेल्सियस में आरटी पर 5 मिनट, resuspend के लिए 2000 × छ पर समाधान macaloid gels.Centrifuge तक आरटी और sonicate के लिए अच्छा है।
    3. समाधान:
      1. Diethyl pyrocarbonate (DEPC) के साथ सभी समाधान समझो। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं और आटोक्लेव, 100 μl DEPC / 100 मिलीलीटर समाधान जोड़ें।
  2. क्रियाविधि
    1. एस के 50 मिलीलीटर बढ़ो मध्य घातीय चरण (आयुध डिपो ~ 0.3) तक 37 ओ सी (कोई मिलाते) में 50 मिलीलीटर ट्यूब में निमोनिया D39 सेल संस्कृति। दो मिनट के लिए 10,000 × छ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र संस्कृतियों। मीडिया त्यागें और तुरंत तरल नाइट्रोजन में सेल छर्रों फ्रीज।
    2. Premix 300 μl क्लोरोफॉर्म: आई ए ए (24: 1) और 300 μl फिनोल (एसिड फिनोल, आरएनए ग्रेड)। कदम 2.2.3 में जैविक चरण के 500 μl का प्रयोग करें।
    3. शाही सेना से मुक्त पेंच टोपी ट्यूब में अग्रिम में निम्नलिखित मिश्रण तैयार: 00.5 जी कांच के मोती, 50 μl 10% एसडीएस, 500 μl फिनोल / क्लोरोफॉर्म: आई ए ए (कदम 2.2.2 में तैयार के रूप में), macaloid परत (150-175 μl, यह बहुत चिपचिपा है नहीं सटीक रूप में)। 400 μl ते (DEPC) में सेल छर्रों Resuspend और पेंच टोपी ट्यूब में resuspended कोशिकाओं जोड़ें।
    4. कोशिकाओं को तोड़ने के लिए, बर्फ पर एक मिनट के अंतराल के साथ 2x 60 "दालों के लिए एक मनका डिब्बा ('homogenize') में पेंच टोपी ट्यूब जगह है। अपकेंद्रित्र 10,000 × छ (4 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए नमूने हैं।
    5. एक ताजा ट्यूब करने के लिए ऊपरी चरण हस्तांतरण 500 μl क्लोरोफॉर्म जोड़ें: आई ए ए (24: 1) और अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए 10,000 × छ (4 डिग्री सेल्सियस) पर।
    6. सेल / बाध्यकारी बफर के दो संस्करणों (1 मिलीलीटर) जोड़ने के लिए, ताजा ट्यूबों के लिए ऊपरी चरण के 500 μl स्थानांतरण और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण। आरएनए अलगाव किट का उपयोग कर कुल शाही सेना को अलग और निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल का पालन करें।

3. शाही सेना सफाई

< राजभाषा>
  • कुल शाही सेना से डीएनए के प्रदूषण को दूर 100 μl DNAseI मिश्रण (90 μl DNase बफर और 10μl DNAseI) जोड़ने और 15-25 डिग्री सेल्सियस पर 20-30 मिनट के लिए सेते हैं।
  • धो RNase किट का उपयोग आरएनए साफ कर दिया। Eluted मात्रा का 50 μl प्राप्त करते हैं।

    • शाही सेना के 4. विश्लेषण

    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर शाही सेना की एकाग्रता का निर्धारण। (चित्रा 2) के रूप में एक परख का उपयोग करके शाही सेना की गुणवत्ता निर्धारित करते हैं।
      1. 20-200 एनजी / μl के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए DEPC पानी की 50 μl के साथ नमूने की एक μl पतला।
      2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार Bioanalyser पर गुणवत्ता की जांच करने के लिए एक μl पतला शाही सेना के नमूने का प्रयोग करें।
    2. नोट: 23S के अनुपात: आसपास 2.0 के 16S अच्छा माना जाता है एक A260 इकाई आरएनए 40 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से मेल खाती है।। लेबलिंग के लिए एक सिफारिश की राशि 10-20 माइक्रोग्राम प्रति है।

    5. सीडीएनए तैयारी और लेबलिंग

    ntent "> नोट: निम्न प्रोटोकॉल सीडीएनए तैयारी और लेबलिंग के लिए पीछा किया गया था।

    1. एनीलिंग
      1. घर का बना स्लाइड या कंपनी के बनाए स्लाइड्स के लिए 5 माइक्रोग्राम प्रति के लिए कुल शाही सेना 10-15 माइक्रोग्राम प्रति की एकाग्रता रखने, 300 μl पीसीआर नलियों में annealing के प्रतिक्रिया प्रदर्शन करते हैं। 2 μl रैंडम nonamers (1.6 माइक्रोग्राम प्रति / μl) के साथ शाही सेना मिक्स और 18 μl के लिए annealing के मिश्रण की अंतिम मात्रा रखने के लिए यदि आवश्यक हो तो nuclease मुक्त पानी जोड़ें।
      2. 5 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर annealing के मिश्रण रखें। उसके बाद, 10 मिनट (एनीलिंग) के लिए आरटी के लिए मिश्रण को ठंडा और यदि आवश्यक हो तो, ट्यूब के नीचे करने के लिए प्रतिक्रियाओं नीचे स्पिन। कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर प्रतिक्रिया ट्यूबों रखें।
    2. रिवर्स प्रतिलेखन
      1. टी 18 μl annealing के मिश्रण करने के लिए μl रिवर्स 6 μl 5x पहले Strand बफर से मिलकर 12 μl मास्टर मिश्रण (3 μl 0.1 एम डीडीटी, 1.2 μl 25x एए-dUTP / न्यूक्लियोटाइड मिश्रण और 1.8 जोड़ने के इस प्रकार है: रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस मिश्रण तैयार करेंranscriptase (कंपनी के बनाए स्लाइड्स के लिए एक μl)। 42 डिग्री सेल्सियस पर 2-16 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण रखें।

    6. mRNA की गिरावट और सीडीएनए की शुद्धि

    1. , प्रतिक्रिया मिश्रण से mRNA के नीचा बारे में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 2.5 एम NaOH के μl और जगह को जोड़ने के लिए। 2 एम NaOH के बेअसर करने के लिए स्वतंत्र एसिड HEPES के बाद में, 15 μl जोड़ें।
    2. पीसीआर क्लीन-अप कॉलम का उपयोग करके सीडीएनए मिश्रण शुद्ध और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें।

    सीडीएनए एकाग्रता की 7. मापन

    1. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर सीडीएनए सांद्रता उपाय। लेबलिंग के साथ जारी रखने के लिये, सीडीएनए की एकाग्रता कम से कम 60 एनजी / μl (घर का बना स्लाइड) या 20 एनजी / μl (कंपनी के बनाए स्लाइड) है कि जाँच करें।

    अमाइन प्रतिक्रियाशील डाई और शोधन के साथ सीडीएनए 8. लेबलिंग

    1. सीडीएनए लेबल करने के लिए एमाइन प्रतिक्रियाशील डाई का प्रयोग करें। सीधे एक विभाज्य (5 μl) के साथ सीडीएनए मिश्रणamine प्रतिक्रियाशील डाई।
    2. 60 से 90 मिनट के लिए अंधेरे में, आरटी पर मिश्रण सेते हैं और डाई लेबल सीडीएनए की शुद्धि के लिए सीधे आगे बढ़ना। पीसीआर क्लीन-अप स्तंभों का उपयोग और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करके डाई लेबल सीडीएनए शुद्ध। क्षालन बफर के 50 μl में सीडीएनए Elute।

    लेबल सीडीएनए 9. मापन

    1. सीडीएनए में एमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक के समावेश को मापने के लिए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का प्रयोग करें। एमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक की एकाग्रता 50 μl की कुल मात्रा में से कम से कम 0.5 pmol / μl है कि जाँच करें।

    लेबल सीडीएनए नमूने के 10 मिश्रण

    1. घर का बना स्लाइड्स के लिए, सीडीएनए एकाग्रता में नहीं 30% से अधिक अंतर के साथ संकरण के लिए सभी लेबल सीडीएनए का उपयोग करें। कंपनी के बनाए स्लाइड्स के लिए, सीडीएनए एकाग्रता में दो गुना अंतर नहीं की तुलना में अधिक के साथ सीडीएनए का उपयोग करें।
      नोट: आम तौर पर, सीडीएनए के बारे में 300 एनजी कंपनी के बनाए स्लाइड्स के लिए आवश्यक है, अनुरोध की तुलना में बहुत कम है जोघर का बना स्लाइड्स के लिए सीडीएनए की राशि uired।

    11. संकरण और वॉशिंग

    1. (; 40 μl खमीर शाही सेना के साथ घर का बना) डेमी पानी, इथेनॉल 99%, शर्मीली बफर: निम्न अभिकर्मकों का प्रयोग करें। शर्म की अधिकतम 1 मिलीलीटर तैयार करें।
    2. उपकरण और समाधान की तैयारी
      1. सुखाने से पहले वैक्यूम संकेंद्रक और हीटर में कम से कम एक घंटा पर स्विच करें। (45 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें, एस निमोनिया डीएनए के लिए) सही संकरण तापमान को समायोजित सेट बिंदु के साथ संकरण ओवन पर स्विच करें। इसी तरह, 30-60 मिनट के लिए संकरण कैसेट और पहले से गरम ओवन।
      2. कम से कम 30 मिनट के लिए 68 सी में शर्मीली बफर पहले से गरम।
    3. नमूना तैयार (सीडीएनए लेबल)
      1. लेबल वाले cDNAs (अधिकतम 30% अंतर) की बराबर मात्रा का मिश्रण। मात्रा छोटे से अधिक 7 μl है जब तक उच्च अस्थायी (लगभग। 40 मिनट) पर वैक्यूम संकेंद्रक का उपयोग कर नमूना सूखी।
    4. चोर पर्ची
      1. साफ चोर-फिसल जाता है का उपयोग करें।नोट: 30 μl स्लाइड पर लोड किया जा सकता ±।
      2. साबुन, पानी के नल और 100% इथेनॉल के बहुत से चोर-स्लिप्स साफ करें। नोट: गंदे चोर निकल जाता है उच्च पृष्ठभूमि दे।
      3. एयर धूल के कणों को दूर भगाने के लिए एयर पिस्टल के साथ चोर-फिसल जाता है सूखी। किनारों पर सफेद Teflon अस्तर नीचे का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड पर एक साफ चोर पर्ची रखें।
    5. (लेबल सीडीएनए के लिए) संकरण बफर जोड़ने
      1. 7 μl एच 2 ओ में सूखे डाई नमूने भंग और 2 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      2. इसके तत्काल बाद, 35 μl preheated शर्मीली बफर (68 डिग्री सेल्सियस) जोड़ने के अवक्षेप से छुटकारा पाने के लिए एक मिनट के लिए अधिकतम गति पर धीरे और स्पिन मिश्रण। लोड हो रहा है जब तक लगभग 5 मिनट के लिए 68 सी पर जांच पहले से गरम।
    6. स्लाइड-चोर पर्ची विधानसभा और पूर्वतापन।
      1. 50 सी पर एक गर्मी ब्लॉक पर संकरण स्लाइड धारक रखें। गरम संकरण स्लाइड धारक और पी पर चोर पर्ची के साथ डीएनए माइक्रोएरे स्लाइड रखेंएक मिनट के लिए चोर-पर्ची के साथ स्लाइड गरम करना। के रूप में जल्दी संभव के रूप में अगले चरणों का प्रदर्शन।
      2. स्लाइड के अंत करने के लिए नमूना लक्ष्य के 40 μl जोड़ें। तरल पदार्थ केशिका बल द्वारा गिलास सतहों के बीच प्रवाह करने की अनुमति दें। धीरे धीरे और सावधानी से सभी pipetting के प्रदर्शन करना।
      3. सभी समय पर चोर पर्ची क्षैतिज साथ स्लाइड रखें और भारोत्तोलक पर्ची कदम नहीं था कि सुनिश्चित करने के लिए धीरे धीरे कदम।
      4. संकरण ओवन से बाहर पूर्व गर्म संकरण कैसेट ले लो और मशीन को बंद करें। प्लेस फिल्टर कागज संकरण कैसेट में 3 मिलीलीटर 2x एसएससी (मानक खारा साइट्रेट) से लथपथ।
      5. धीरे संकरण कैसेट में स्लाइड के साथ संकरण स्लाइड धारक जगह है। संकरण कैसेट बंद करो और (लगभग 16-18 घंटे के लिए) के लिए ओवन फिर संकरण में डाल दिया।
    7. स्लाइड धुलाई
      1. मैं, द्वितीय और तृतीय ताजा धो-बफ़र्स (धोने कदम प्रति 750 मिलीलीटर) तैयार करें। 500 मैं-बफर धोने एमएल के लिए, 2 एक्स एसएससी / 0.5% एसडीएस का उपयोग करें। 500 के लिए धो-शौकीन mlएर द्वितीय, 1 एक्स एसएससी / 0.25% एसडीएस का उपयोग करें। 500 एमएल के लिए धो बफर तृतीय, का उपयोग एक एक्स एसएससी / 0.1% एसडीएस (वैकल्पिक)
      2. 30 डिग्री सेल्सियस पर धो-बफ़र्स प्लेस (यह सुनिश्चित हो एसडीएस भंग कर रहा है)।
      3. ग्लास ट्यूब के शंक्वाकार तल पर टिकी हुई है, जब तक 50 मिलीलीटर से भरा एक बाज़ ट्यूब में, बहुत धीरे से जितनी जल्दी संभव हो स्लाइड डूब, लेकिन मुझे लगता है कि बफर धो लें।
      4. ट्यूब के नीचे करने के लिए चोर-पर्ची डूब, सरणी scratching के बिना चिमटी के साथ स्लाइड बाहर ले और धोने स्टेशन के रैक में डाल दिया जब कुछ सेकंड के बाद। कोई समय अंतराल के साथ कपड़े धोने के साथ जारी रखें।
      5. धो बफर ml मैं (एक कपड़े धोने स्टेशन में) 500 में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें। धो बफर ml 500 में 20-30 मिनट (एक कपड़े धोने स्टेशन में) द्वितीय के लिए यह एक दूसरे धो दे। इसी तरह, धो बफर ml 500 में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो तृतीय (वैकल्पिक) (एक कपड़े धोने स्टेशन में)।
      6. 2000 rpm पर 2 मिनट के लिए स्लाइड सूखी।

    12. माइक्रोएरे विश्लेषण

    1. छवियों स्कैनऔर स्कैनर में संबंधित तरंग दैर्ध्य के साथ एक फ़ोल्डर "जौव परियोजना" में बचाने के लिए।
    2. इस सॉफ्टवेयर को चलाने के बाद पहले से 22. वर्णित के रूप में शुरू में स्कैन फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, "लाल" और हरे रंग की छवि फ़ाइल (-.635) के रूप में के रूप में लाल छवि फ़ाइल (-.550) लोड करने के लिए "ओपन छवि" टैब का चयन करें "ग्रीन"। टैब 22 "लोड ऐरे सूची" का चयन करके छवि फ़ाइल पर एस निमोनिया सरणी सूची होने लड़की फ़ाइल (.gal) अपलोड करें।
      नोट: इस सरणी सूची, 48 ग्रिडों के शामिल प्रत्येक ग्रिड पर 16 पंक्तियों और 15 कॉलम थे। ग्रिड पर हर जगह एक जीन का प्रतिनिधित्व करता है और जीन नाम सहित मौके जानकारी एक जगह वर्णन फ़ाइल के माध्यम से जोड़ा जाता है। मौके संख्या नीचे करने के लिए सही और शीर्ष करने के लिए बाईं ओर से दिया जाता है।
    3. ध्यान से ग्रिड, चुनिंदा टैब खोलना के बाद स्पॉट के लिए पंक्ति में "सुविधाएँ संरेखित, ब्लाकों का पता लगाएं, ऐरे खोजें"। सभी सुविधाओं aligning के बाद, "विश्लेषण" टी का चयन करके छवि का विश्लेषणएबी। परिणाम, हिस्टोग्राम और तितर बितर साजिश हो रही एक नई फ़ाइल बनाएँ। "के रूप में सहेजें परिणाम" टैब से इस फाइल को सेव करें आगे के विश्लेषण के लिए एक .gpr फ़ाइल के रूप में।
    4. 9 वर्णित के रूप में घर में विकसित Microprep सॉफ्टवेयर पैकेज के साथ आगे की सामान्य और डेटा की प्रोसेसिंग प्रदर्शन करते हैं।
    5. डाई-बदली कर रहे हैं, जो डीएनए माइक्रोएरे डेटा के लिए स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति का प्रयोग करें। के रूप में टी test1 का एक प्रकार का CyberT कार्यान्वयन प्रदर्शन और गणना झूठे खोज दरों (एफडीआर) 9 में वर्णित है।
    6. विभिन्न व्यक्त जीनों के लिए एक मानक के रूप में पी <0.001 और एफडीआर 0.05 <ले।
    7. एक भू (जीन एक्सप्रेशन सर्वग्राही) परिग्रहण संख्या प्राप्त करने के लिए एन सी बी आई प्रस्तुत पेज पर डीएनए माइक्रोएरे डेटा अपलोड करें।

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    Representative Results

    शाही सेना, सीडीएनए isolations और विश्लेषण

    एल सेरीन आवश्यक अमीनो एसिड में से एक है और मानव रक्त प्लाज्मा में अपनी एकाग्रता बच्चों और वयस्कों में 60-150 माइक्रोन से भिन्न होता है। Purines और pyrimidines के जैवसंश्लेषण में इसकी भूमिका चयापचय में इसके महत्व पर प्रकाश डाला गया है और यह कई अमीनो एसिड (ग्लाइसिन, सिस्टीन और tryptophan) के लिए एक अग्रदूत साबित हुई। एस के पूरे transcriptome पर एल सेरीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए निमोनिया D39 जंगली प्रकार के तनाव, एक ही माध्यम में एक अधिकतम एकाग्रता (10 मिमी) में उगाया जाता है कि के खिलाफ एल सेरीन की एक न्यूनतम एकाग्रता (150 माइक्रोन) के साथ सीडीएम में उगाई D39 तनाव के माइक्रोएरे विश्लेषण किया गया था। सबसे पहले, दोनों सांद्रता के तहत विकसित कोशिकाओं से कुल शाही सेना पृथक किया गया। शाही सेना के नमूने की सांद्रता तालिका 1 में दिया जाता है। कुल शाही सेना की गुणवत्ता में गुणवत्ता की जांच परख का उपयोग कर जांच की गई थी। शाही सेना के इस प्रदर्शन से पहले DNase मैं के साथ इलाज किया गया थापरख संभव जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए चित्रा 2 शाही सेना की गुणवत्ता को दर्शाता है।; लेन एल, सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है 1 और 2 10 मिमी सेरीन से शाही सेना का प्रतिनिधित्व करते हैं 150μM सेरीन और गलियों 3 और 4 से शाही सेना का प्रतिनिधित्व करते हैं गलियों। दो आरएनए सब यूनिटों को इसी दो स्पष्ट बैंड की उपस्थिति शाही सेना की अच्छी गुणवत्ता के संकेत दिया है और प्रयोग के अगले चरण का प्रदर्शन किया जा सकता है।

    शाही सेना की गुणवत्ता मापने के बाद, सीडीएनए संश्लेषण किया गया था। सीडीएनए यादृच्छिक nanomers और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस एंजाइम का उपयोग करके बनाई गई थी। सीडीएनए नमूनों की सांद्रता तालिका 1 में दिया जाता है। इस सीडीएनए एमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ चिह्नित किया गया और लेबल सीडीएनए की सांद्रता और डाई लेबल लेबलिंग के बाद, नमूने संकरित फिर उसके अनुसार मिलाया जाता है और कर रहे थे। तालिका 1 में दिया जाता है। धोने के बाद, स्लाइड स्कैनर का उपयोग कर स्कैन किया गया है, और विश्लेषण जीन पिक्स प्रो सॉफ्टवेयर का उपयोग किया गया था। 3 चित्रा बिखराव से पता चलता हैएमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक अनुपात की साजिश विश्लेषण। प्रारंभिक विश्लेषण के बाद, डेटा आगे अंतिम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था शोर और साइबर टी को कम करने के PicroPrep सॉफ्टवेयर पैकेज (PrePrep, प्रस्तुत करने का, PostPrep) 9 का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था। तालिका 2 ≥ 2.0 के मानदंडों को लागू करने के बाद माइक्रोएरे अध्ययनों के परिणामों का सार अंतर और पी -value <0.001 गुना। अधिकतम (तालिका 2) की तुलना में जीन की एक संख्या विभिन्न न्यूनतम एल सेरीन की उपस्थिति में व्यक्त किया गया।

    चित्र 1
    चित्रा 1. डीएनए माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी। आरएनए का अवलोकन नियंत्रण और लक्ष्य के नमूने से अलग और सीडीएनए तो संकरित है लेबल है।

    चित्र 2
    चित्र 2।शाही सेना की गुणवत्ता की जांच एस से अलग निमोनिया D39 कोशिकाओं न्यूनतम (150 माइक्रोन) और अधिकतम (10 मिमी) सेरीन सांद्रता की उपस्थिति में वृद्धि हुई है। एक लेन और दो ​​न्यूनतम सेरीन एकाग्रता की उपस्थिति में विकसित कोशिकाओं से अलग शाही सेना के नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं जबकि लेन एल आकार-सीढ़ी का प्रतिनिधित्व करता है। इसी तरह, लेन 3 और 4 अधिकतम सेरीन एकाग्रता की उपस्थिति में विकसित कोशिकाओं से अलग शाही सेना के नमूने का प्रतिनिधित्व करते हैं। बैंड 23S और -16 rRNA प्रतिनिधित्व करते हैं। केवल दो बैंड की उपस्थिति वहाँ कोई gDNA संदूषण है और शाही सेना को अच्छी गुणवत्ता की है कि पता चलता है।

    चित्र तीन
    एक नमूना मिश्रण की चित्रा 3. ऐरे तुलना तितर बितर साजिश है। भूखंड में हर जगह एक्स-अक्ष पर y अक्ष और डाई दो पर डाई एक के साथ एक प्रयोग में एक जीन का मतलब है अभिव्यक्ति मूल्य (log2) का प्रतिनिधित्व करता है।

    नमूना शाही सेना के नमूने विवरण शाही सेना एकाग्रता (एनजी / μl) सीडीएनए एकाग्रता (एनजी / μl) लेबल सीडीएनए (एनजी / μl) DyLight-550 (pmol / μl) DyLight-650 (pmol / μl) संकरण योजना
    एस 1 आर 1 सीडीएम + न्यूनतम एल सेरीन में उगाई D39 जंगली प्रकार 2057 255 225 0.8 आर 1 + R3
    आर 2 सीडीएम + न्यूनतम एल सेरीन में उगाई D39 जंगली प्रकार 2566 201 179 1.2 आर 2 + R4 है
    S2 R3 D39 जंगली प्रकार सीडीएम + अधिकतम एल सेरीन में उगाई 2831 292 276 2.3
    R4 है सीडीएम + मैक्स में उगाई D39 जंगली प्रकारimum एल सेरीन 1867 172 150 1

    माइक्रोएरे विश्लेषण में इस्तेमाल नमूनों की तालिका 1. संकरण योजना।

    <Tr />
    जीन एक समारोह बी अनुपात ग
    SPD0600 कोशिका विभाजन प्रोटीन DivIB 4
    SPD0445 Phosphoglycerate काइनेज 3.5
    SPD0646 काल्पनिक प्रोटीन 3.4
    SPD0873 काल्पनिक प्रोटीन 3.3
    SPD1223 काल्पनिक प्रोटीन 3.3
    SPD0980 Ribose फॉस्फेट pyrophosphokinase 2.8
    SPD1628 Xanthine phosphoribosyltransferase 2.7
    SPD1011 ग्लिसरेट काइनेज 2.4
    SPD0645 काल्पनिक प्रोटीन 2.3
    SPD0564 काल्पनिक प्रोटीन 2.2
    SPD0641 Mannose-6-फॉस्फेट आइसोमेरेस कक्षा मैं, मन 2.1
    SPD1333 काल्पनिक प्रोटीन 2.1
    SPD1384 कटियन तपका परिवार प्रोटीन 2.1
    SPD1432 यूडीपी-ग्लूकोज 4-epimerase, आंधी-1 2.1
    SPD1866 एन एसिटाइलग्लूकोसेमाइन-6-फॉस्फेट deacetylase, नगा 2.1 SPD0104 LysM डोमेन प्रोटीन 2
    SPD0140 एबीसी ट्रांसपोर्टर, एटीपी बाध्यकारी प्रोटीन 2
    SPD0261 अमीनोपेप्टिडेज़ सी, PepC 2
    SPD1350 काल्पनिक प्रोटीन 2
    SPD1822 Ribosomal बड़े सबयूनिट pseudouridine सिन्थेज़, RluD उपपरिवार प्रोटीन 2
    SPD0453 प्रकार मैं प्रतिबंध संशोधन प्रणाली, एस सबयूनिट -2
    SPD0459 गर्मी झटका प्रोटीन GrpE -2
    SPD1006 ग्लूकोज-1-फॉस्फेट adenylyltransferase -2
    SPD1799 सेंसर हिस्टडीन काइनेज, ख्यात -2.1
    SPD0387 बीटा-hydroxyacyl- (एसाइल-वाहक प्रोटीन) dehydratase FabZ -2.2
    SPD1494 चीनी एबीसी ट्रांसपोर्टर, permease प्रोटीन -2.2
    SPD0974 कक्षा मैं glutamine के amidotransferase, ख्यात -2.4
    SPD1600 Anthranilate phosphoribosyltransferase -2.5
    SPD1472 Isoleucyl-टीआरएनए synthetase -2.6
    SPD0681 काल्पनिक प्रोटीन -2.7
    SPD0501 ट्रांसक्रिप्शन antiterminator, Lict -3.4

    एस के transcriptome तुलना में विनियमित जीन की तालिका 2. सूची निमोनिया तनाव D39 जंगली प्रकार सीडी में उगाईएल सेरीन की अधिकतम एकाग्रता के साथ न्यूनतम एल सेरीन की एकाग्रता और सीडीएम 15 के साथ 15 मीटर। एक जीन संख्या D39 ठिकाना टैग को देखें। बी D39 एनोटेशन / TIGR4 एनोटेशन 21। सी अनुपात जीनों की अभिव्यक्ति में गुना वृद्धि / कमी का प्रतिनिधित्व करता है सीडीएम-अधिकतम में (ऋण चिह्न डाउनरेगुलेशन इंगित करता है) सीडीएम-न्यूनतम की तुलना में।

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    Discussion

    हम बैक्टीरिया के पूरे transcriptome विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है कि एक उपयोगकर्ता के अनुकूल प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस विशेष तकनीक के बारे में प्रमुख मुद्दा कोशिकाओं काटा जाता है, जिसके तहत हालत भिन्न हो जाएगा। कोशिकाओं और आरएनए अलगाव कटाई के बाद, इस तकनीक बैक्टीरियल नमूने के सभी प्रकार के बराबर हो जाता है और बिल्कुल समान चरणों का अनुसरण करता है और इसलिए, जीवाणु संस्कृति के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है। प्रोटोकॉल बहुत ही सरल और सुविधाजनक है और शाही सेना के अलगाव से शुरू होता है। (एक Macaloid और आरएनए अलगाव किट का उपयोग) हमारी शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल समय प्रभावी पारंपरिक फिनोल-क्लोरोफॉर्म और Trizol तरीकों की तुलना के रूप में है। अगले चरण में, ट्रांसक्रिपटेस तृतीय एंजाइम के साथ सीडीएनए की तैयारी के किया जाता है। अगला, सीडीएनए की लेबलिंग एमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक के साथ सीडीएनए की पहली मिश्रण द्वारा किया जाता है, और फिर से लेबल सीडीएनए सफ़ाई। लेबलिंग भी सरल है और नमूने के बारे में एक के लिए incubated करने की आवश्यकता के रूप में समय की एक बहुत नहीं ले करता हैअंधेरे में घंटा। यह किसी भी विशेष उपकरणों की मांग नहीं करता रूप में इन सभी चरणों को किसी भी मानक प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है। एक माइक्रोएरे स्कैनर स्लाइड स्कैन करने की जरूरत है। स्लाइड स्कैनिंग और विश्लेषण के लिए, GenePix प्रो कार्यक्रम एक बहुत ही सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यक्रम 22 है, जो प्रयोग किया जाता है।

    सभी प्रयोगों करने के बाद, विश्लेषण MicroPrep और CyberT उपयोग किया गया था। MicroPrep पैकेज, तीन मॉड्यूल, यानी, PrePreP, प्रस्तुत करने और PostPreP 9 के होते हैं। इस डेटा पूर्व प्रसंस्करण ढांचे डेटा को सामान्य बनाने के लिए समय कम कर देता है और यह भी खारिज कर दिया डेटा की मात्रा कम कर देता है। शोधकर्ता कम से कम समय में डीएनए माइक्रोएरे डेटा की समझ है करने के लिए सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया जा सकता है जिस आसानी से यह संभव बनाता है। यह स्लाइड छवि विश्लेषण किया जाता है के बाद आगे की प्रक्रिया के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डाटा में कच्चे संकेत डेटा कन्वर्ट करने के लिए केवल कुछ मिनट के एक जोड़े को ले जाता है। माइकर में विनियमित जीन का पूल पर आगे के विश्लेषणoarray अलग-घर सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग किया जा सकता है। वे काली मिर्च 20, FIVA 16 का खुलासा 18, अभियोजक 17 और Genome2D 19 में शामिल हैं। इन खिड़कियों पर आधारित उपकरणों और सॉफ्टवेयर संकुल उपयोगकर्ता के अनुकूल हैं और आगे की जांच पड़ताल के दौरान डेटा में गहरी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। ये सॉफ्टवेयर संकुल यह बहुत आसान है और आसान डेटा और अधिक सार्थक और प्रासंगिक हो जाता है के रूप में शोधकर्ताओं ने इस तकनीक का उपयोग करने के लिए करते हैं।

    प्रोटीन में इस्तेमाल रंगों रंजक यह स्कैनर द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं किया जा सकता है कि इतनी कम है ओजोन और सिग्नल की शक्ति की उपस्थिति में अस्थिर हो जहां एक ओजोन-प्रभाव, के लिए अतिसंवेदनशील होने के लिए जाना जाता है। ओजोन प्रभाव को कम संवेदनशील होते हैं जो amine प्रतिक्रियाशील रंजक सीडीएनए लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है। ओजोन प्रभाव का हल इस तकनीक का भी बेहतर बनाना होगा।

    एक सूची ऊपर थे कि जीन की बनाई या कम से कम एल सेवा की उपस्थिति में downregulated किया गया थाअधिकतम (तालिका 2) की तुलना में ine एकाग्रता। upregulated जीन उनके उत्पाद के समारोह के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है। उनमें से सात काल्पनिक प्रोटीन, चार कार्बोहाइड्रेट परिवहन और चयापचय, एक कोशिका विभाजन प्रोटीन DivIB, और कुछ अमीनो एसिड परिवहन और चयापचय जीन में शामिल कर रहे हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना। इसी तरह, यह भी हमारे परीक्षण किया हालत में downregulated कर रहे हैं कि कुछ जीन होते हैं। एक BglG-परिवार ट्रांसक्रिप्शनल नियामक LicT, कुछ कार्बोहाइड्रेट जीन और कुछ अमीनो एसिड-विशिष्ट जीन downregulated जीन में हैं। एक गर्मी सदमे प्रोटीन GrpE नीचे विनियमित लोगों के बीच भी है। इसलिए, इस अध्ययन के विभिन्न परीक्षण किया शर्तों के तहत व्यक्त जीनों की एक पूरी अवलोकन प्रदान करता है। परिणामों के विश्लेषण के बाद, परिणामों की कभी कभी सत्यापन आवश्यक है। यह या तो lacZ प्रमोटर fusions का उपयोग कर qPCR या β-galactosidase assays के द्वारा किया जा सकता है।

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

    Acknowledgments

    हम डीएनए स्लाइड उत्पादन के साथ मदद के लिए ऐनी डी जोंग और Siger Holsappel धन्यवाद। जैव सूचना विज्ञान के विश्लेषण के लिए ऐनी डी जोंग का समर्थन भी सराहना की है। हम भी कागज की समीक्षा करने के लिए Jelle Slager धन्यवाद। मुहम्मद अफजल और इरफान मंजूर एचईसी पाकिस्तान के संकाय विकास कार्यक्रम के तहत जीसी विश्वविद्यालय, फैसलाबाद, पाकिस्तान द्वारा समर्थित हैं।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acid phenol SigmaAldrich P4682
    Roche RNA isolation kit Roche Applied Science 11828665001
    Glass beads 105015
    Chloroform Boom 92013505.1000.
    IAA 106630
    Nanodrop Nanodrop ND-100
    Agilent BioAnalyser Agilent G2940CA
    Superscript III Life technologies Invitrogen 18080044
    AA-dUTP Life technologies Invitrogen AM8439
    DDT Life technologies Invitrogen 18080044
    First Strand buffer Life technologies Invitrogen 18080044
    NaOH SigmaAldrich S8045-1KG
    HEPES SigmaAldrich H4034-500G
    DyLight-550 Thermoscientiffic 62262
    DyLight-650 Thermoscientiffic 62265
    SHY Buffer SigmaAldrich H7033-125ML
    Speedvac cooler Eppendorf RUGNE3140 Speedvac concentrator plus
    Hybridization oven Grant Boekel Iso-20
    Lifter-slips Erie Scientific 25x60I-M-5439
    Wipe KIMTECH
    SDS SigmaAldrich L3771-100g
    SSC SigmaAldrich W302600-1KG-K
    Genpix autoloader 4200A1 MSD analytical technologies Microarray scanner
    Sodium bicarbonate SigmaAldrich 104766

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    आण्विक जीवविज्ञान अंक 98 डीएनए जीन अभिव्यक्ति transcriptomics जैव सूचना विज्ञान डेटा विश्लेषण pneumococcus एल सेरीन
    बैक्टीरियल transcriptome विश्लेषण प्रकरण अध्ययन के लिए एक तेज और विश्वसनीय पाइपलाइन: सेरीन निर्भर जीन विनियमन में<em&gt; स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em
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    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O.… More

    Afzal, M., Manzoor, I., Kuipers, O. P. A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae. J. Vis. Exp. (98), e52649, doi:10.3791/52649 (2015).

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