Abstract
유전자 발현 및 조절은 반응 조건이 다른 셀들의 동작을 이해하는 것이 매우 중요하다. 다양한 기술이 유전자 발현을 연구하기 위해 현재 사용되지만, 대부분의 전 사체의 발현을 제공하는 전체 화상의 관점에서 제한된다. DNA 마이크로 어레이는 전체 유전자 발현의 전체 개요를 제공 빠르고 경제적 연구 기술을 제공하고 수천을 분석하는데 도움도 사이트, 세포의 전사 활성의 특성화 및 바인딩 신규 유전자 전사 인자의 확인을 포함하여 광범위한 응용 번호를 가지고 유전자 (하나의 실험에서). 본 연구에서, DNA 마이크로 어레이 분석 세포 수확에서 세균 전 사체 분석을위한 조건이 최적화되어있다. 계정으로 시간, 비용과 실험의 정확성을 촬영,이 기술 플랫폼은 세균 transcripto 연구를위한 매우 유용하고 보편적 applicabale 것으로 입증MES. 여기서 우리는 S.의 전사 반응을 비교하여 대소 연구 등의 폐렴 구균과 DNA 마이크로 어레이 분석을 수행 폐렴 L 배지에 세린의 다양한 농도의 존재 하에서 성장. 총 RNA는 RNA의 품질 검사 키트를 사용하여 조사 하였다 RNA 분리 키트 및 RNA의 품질을 사용하여 Macaloid 방법을 사용하여 단리 하였다. cDNA를 역전사 효소를 사용하여 제조하고, cDNA를 시료는 두 아민 반응성 형광 염료 중 하나를 사용하여 라벨링 하였다. 제 DNA 마이크로 어레이 슬라이드의 cDNA 마이크로 어레이 데이터 전처리 워크 (Microprep)를 사용하여 분석 하였다 표지 된 cDNA 샘플 및 마이크로 어레이 데이터의 혼성화에 사용 하였다. 마지막으로 사이버 T는 통계적으로 유의 한 발현 된 유전자의 식별 Microprep을 이용하여 생성 된 데이터를 분석하는데 사용 하였다. 또한, 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 (고추, FIVA는 공개, 검사, Genome2D)를 분석하는 데 사용되었다데이터.
Introduction
유전자 과발현 또는 녹 - 아웃을 포함하여, 특정 시간 또는 특정 조건 하에서 단세포 생물 또는 진핵 세포의 게놈에 의해 코딩 mRNA의 풍부 (사체)의 전체 세트의 연구는 transcriptomics 불린다. Transcriptomics 우리가 어느 정도 유전자 시점 X에서 특정 조건에서 발현되는 무엇을 관찰 할 수 있습니다 우리에게 유전자에 대한 참조를 기준으로 표시하는 방법을 강하게에 대한 정보를 제공합니다.
마이크로 어레이는 고체 기판 상에 2 차원 어레이 (일반적으로 유리 슬라이드 또는 실리콘 박막 셀) 높은 처리량 스크리닝을 사용하여 생체 물질의 대량 분석하는 데 사용하고, 소형화 될 수 있고, 다중화 및 병렬 프로세싱 및 검출이며 방법. 마이크로 어레이는 DNA-마이크로 어레이, 단백질 마이크로 어레이, 펩티드 마이크로 어레이, 조직 마이크로 어레이, 항체 마이크로 어레이, 세포 마이크로 어레이 등을 비롯한 다양한 형태로 왔습니다. DNA 마이크로 어레이는기본적 미세한 DNA 스폿의 조립체는 고체 표면에 고정 된 보통 유리. DNA 마이크로 어레이는 유전자의 발현 수준 또는 유전자의 동시 측정하는 세트 또는 게놈 2,3- 복수의 영역의 유전자형을 위해 사용된다. 프로브 Picomoles (10-12 몰) 또한 리포터로 알려진 특정 DNA 서열을 나타내며, 각각의 DNA 스폿 내에 존재한다. 샘플에서 라벨의 mRNA 분자는 '목표'라고합니다. 형광 프로브는 표적과 혼성화 형광 표지 된 표적의 검출을 측정하는 데 사용되는 것은 타겟 핵산 서열의 상대적인 풍부함을 결정한다. 배열 수십 프로브의 수천을 포함 할 수 있기 때문에 마이크로 어레이 실험은 병렬로 여러 유전자 검사를 수행 할 수 있습니다. 간단한 마이크로 어레이 실험의 배치는 그림 1에 나타나있다. 최근에는 이러한 배열은이 기술을 매우 비용 effectiv을 만드는, 재사용하는 것이 우리와 다른 실험실에서 설립되었다전자.
8 - 다른 RNA의 분리 및 정제 기술은 C-TAB, SDS와 GT 방법 4를 포함하여 수년에 걸쳐 개발되고있다. 또한, 여러 상업 키트도 사용할 수 있습니다. 유전자 발현을위한 고품질의 RNA는 매우 중요합니다. 따라서, RNA 분리 방법은 RNA의 최대 양을 얻기 위해 수정됩니다. 마찬가지로, cDNA를 cDNA를 준비 및 라벨링에 대한 단계는 최소화된다. 스캔 한 후 데이터의 정규화는 또한 자체 내장 된 소프트웨어 패키지 및 도구 (9)를 사용하여 효율적으로 수행된다.
폐렴 구균은 비 인두를 식민지화과 폐렴, 패혈증, 중이염 등의 여러 감염의 원인 10 뇌막염 그람 양성 인간 병원체이다. 박테리아의 성장과 생존에 필요한 11,12 영양소 다양한 이용할 수있다. 연구 번호에 대해 수행 된아미노산의 중요성 및 병독성 13,14에서의 역할을 강조 폐렴 질소 대사 조절. 본 연구에서는 미국의 transcriptomic 응답 폐렴 L 세린, 인간 혈장에 존재하는 다량의 아미노산의 농도 변화에 DNA 마이크로 어레이를 사용하여보고된다. S.의 transcriptomic 응답 세린 L (150 μM)의 농도를 최소 성장 폐렴은 세린의 최대 농도 (10 mM)을 성장에 비해 하였다. 화학적으로 정의 된 배지 (CDM 또는 최소 배지) 15 세린의 농도를 제어하기 위해이 연구를 위해 사용되었다. 본 연구의 초점이 기술은 사용자 친화적 있도록 정상화 데이터 및 분석을위한 다른 도구를 제공하는 것이다. 따라서, 공구의 수는 분석 데이터 해석을 위해 개발되었다. FIVA (기능 정보 뷰어 및 분석기)을 갖는 유전자의 클러스터에 포함 된 정보 처리를위한 플랫폼을 제공합니다유사한 유전자 발현 패턴 및 기능 정보 (16)를 구성하기위한. 검사는 추정되는 기능 및 유전자 주석 (17)의 식별을 용이하게 다른 소프트웨어 패키지이다. 클러스터링 방법을 이용하여 공개는 DNA 결합 부위 검출 알고리즘을 제공한다. 유전자의 시스 - 규정 모티프이 알고리즘 (18)을 통해 투영 될 수있다. Genome2D는 게놈 맵 (19) 상에 유전자 발현 수준의 변화를 특성화하기 위해 상이한 컬러 범위를 제공함으로써 시각화 및 사체 데이터의 분석을위한 윈도우 기반 플랫폼을 제공한다. 고추 웹 서버는 모든 -에 - 하나의 분석 방법, regulons, 프로모터 및 전사 인자 결합 부위 (20)에 대한 마이닝 도구 상자에 추가로 제공합니다. 박테리아 게놈 유전자 간 영역의 전체 주석이 패키지를 사용함으로써 달성 될 수있다. 이 실험을 설계하는 그들에게 플랫폼을 제공으로 생물 학자들은 크게 고추 혜택을 누릴 수 있습니다(S)이되도록 가정 된 생체 정보 (20)에서 확인할 수있다. 대부분이 무료로 사용할 수 있습니다 및 데이터 표준화 및 분석은 매우 신뢰성있는 이러한 소프트웨어 패키지는 마이크로 어레이 분석에 크게 기여하고 있습니다.
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Protocol
1. 미디어의 준비 및 세포 배양
- S. 성장 앞서 설명한 바와 같이 11 폐렴 D39 야생형 균주 21. 화학적 6.4 (15)의 최종 pH 중형 (CDM)가 정의 50 ㎖ 중의 (50 ㎖에 1/100의 비율 멸균 튜브) 10 % 글리세롤에 C o를 -80 저장된 세포에 접종하지만 아미노산으로부터 L 세린 생략 혼합물.
주 : 두 개의 다른 CDMS 사용 하였다; L 세린 (10 mM)을 최대 농도를 함유하는 세린 L (150 μM) 및 기타의 최소 농도를 함유 한. 이러한 최소 농도는 기본적으로 인간 혈장 세린 L의 농도이며 목적은 S.의 유전자 발현을 비교하는 것이다 이 두 가지 조건에서 폐렴 D39 변형.
총 RNA 2. 분리
- 재료
- 총 RNA의 분리를 위해 산 페놀, RNA 등급을 사용합니다.
- Macaloid :
- 의 2g을 일시 중단100 ml의 TE에 macaloid 5 분 동안 끓인다. 50 ml의 TE pH가 8 점에서 4 ° C에서의 RT에서 5 분, 재현 탁 2,000 × g에서 솔루션 macaloid gels.Centrifuge까지 RT와 초음파 처리에 차가운.
- 솔루션 :
- 디 에틸 피로 카보네이트 (DEPC) 모든 솔루션을 취급합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 O / N을 배양하고 오토 클레이브, 100 μL의 DEPC / 100 ml의 솔루션을 추가합니다.
- 방법론
- S. 50 ml의 성장 중간 지수 단계 (OD ~ 0.3)까지 37 O C (아무 흔들림)에 50 ㎖ 튜브에 폐렴 D39 세포 배양. 2 분 동안 10,000 × g에서 4 ° C에서 원심 분리기 문화. 미디어를 취소하고 즉시 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결.
- 프레 믹스 300 μL의 클로로포름 : IAA (24 : 1) 300 μL 페놀 (페놀 산, RNA 학년). 단계 2.2.3 유기상 500 μl를 사용한다.
- RNA가없는 스크류 캡 튜브에 사전에 다음과 같은 혼합물을 준비 : 00.5 g 유리 비드 50 ㎕의 10 % SDS, 500 μL의 페놀 / 클로로포름 : IAA (단계 2.2.2에서 제조 한 바와 같이), macaloid 층 (150-175 μL, 매우 점성없는 정확한 같이). 400 ㎕의 TE (DEPC)에있는 세포 펠렛을 재현 탁하고 나사 캡 튜브에 재현 탁 세포를 추가합니다.
- 세포를 파괴하기 위해 얼음에 1 분 간격으로 2 배 60 "펄스에 대한 비드 비터 ( '균질화')에 나사 캡 튜브를 배치합니다. 원심 분리기 10,000 ×의 g (4 ° C에서)에서 10 분 동안 샘플.
- 신선한 튜브에 상위 단계로 이동 500 μl의 클로로포름 추가 IAA (24 : 1) 원심 분리기 5 분 동안 10,000 ×의 g (4 ° C)에서.
- 용해 / 바인딩 버퍼의 두 볼륨 (1 ml)에 추가, 신선한 튜브 상위 단계의 500 μl를 전송하고로 pipetting 아래로 섞는다. RNA 분리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리하고, 제조업체에게 권장 프로토콜을 따릅니다.
3. RNA 정리
< OL>RNA 4. 분석
- 분광 광도계에 RNA의 농도를 결정합니다. (도 2)는 다음과 같이 분석을 이용하여 RNA의 품질을 결정한다.
- 20-200 NG / μL의 농도를 얻을 DEPC 물 50㎕의 샘플을 1 μL 희석.
- 제조업체의 지침에 따라 Bioanalyser에 품질을 확인하기 위해 1 μL 희석 RNA 샘플을 사용합니다.
- 참고 : 23S의 비율 : 약 2.0 16S가 좋은 것으로 간주됩니다 한 A260 단위 RNA가 40 ㎍ / ㎖의에 해당한다.. 라벨에 대한 권장 금액은 10 ~ 20 μg의입니다.
5. cDNA를 준비하고 레테르를 붙이기
ntent "> 참고 : 다음 프로토콜이 cDNA를 제조 및 라벨링에 대한 하였다.- 가열 냉각
- 만든 슬라이드 또는 회사에서 만든 슬라이드 5㎍을 위해 총 RNA 10 ~ 15 μg의 농도를 유지, 300 ㎕를 PCR 튜브에 어닐링 반응을 수행합니다. 2 μL 임의 nonamers (1.6 ㎍ / μL)와 RNA를 혼합하고 18 μL에 어닐링 혼합물의 최종 부피를 유지하기 위해 필요한 경우 핵산 분해 효소가없는 물을 추가합니다.
- 5 분 동안 70 ℃에서 어닐링 유지 혼합물. 그 후, 10 분 (어닐링)에 대한 RT 혼합물을 냉각하고, 필요한 경우, 관의 바닥에 반응을 스핀 다운. 적어도 1 분 동안 얼음에 반응 튜브를 놓습니다.
- 역전사
- t, 18 ㎕의 어닐링 믹스 μL 역 6 μl의 5 배 먼저 스트랜드 버퍼로 구성된 12 μL 마스터 믹스 (3 μL 0.1 M DDT, 1.2 ㎕의 25 배 AA-dUTP를 / 염기 믹스와 1.8를 추가 : 다음과 같이 역전사 효소 믹스를 준비ranscriptase (회사 만든 슬라이드 1 μL). 42 ° C에서 2-16 시간 동안 반응 믹스를 유지합니다.
6. mRNA를 분해 및 cDNA를 정화
- , 반응 혼합물로부터의 mRNA를 분해 약 15 분 동안 37 ° C에서 3 2.5 M의 NaOH μL과 장소를 추가합니다. 2M는 NaOH를 중화 유리 산을 HEPES의 후, 15 μl를 추가합니다.
- PCR 정화 컬럼을 사용하여 cDNA의 혼합물을 정제하고 제조자의 프로토콜을 따른다.
cDNA의 농도 측정 7.
- 분광 광도계에 cDNA의 농도를 측정한다. 라벨 계속하려면, cDNA를의 농도가 적어도 60 NG / μL (만든 슬라이드) 또는 20 NG / μL (회사 만든 슬라이드)되어 있는지 확인합니다.
아민 반응성 염료 및 정제와의 cDNA 8. 표지
- cDNA의 레이블을 아민 반응성 염료를 사용합니다. 직접 하나 나누어지는 (5 μL)의로 cDNA를 혼합아민 반응성 염료를.
- 60 ~ 90 분 동안 어두운 데에서, RT에서 혼합물을 부화 염료 표지 된 cDNA를 정제로 직접 진행. PCR 청소 열을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 염료로 표지 된 cDNA를 정화. 용출 완충제에서 50 μL의 cDNA 용출.
표지 된 cDNA를 9. 측정
- cDNA의 아민에 반응성 염료의 혼입을 측정하는 분광 광도계를 사용한다. 아민 반응성 염료의 농도가 50 μL의 총 부피에 적어도 0.5 pmol의 / μL가 있는지 확인합니다.
표지 된 cDNA를 샘플의 10 혼합
- 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도하게는 30 % 이상 차이가 하이브리드에 대한 모든 레이블의 cDNA를 사용합니다. 회사 만든 슬라이드를 들어, cDNA의 농도의 2 배 차이 이하로 cDNA를 사용합니다.
주 : 일반적으로, 유전자의 cDNA는 약 300 ng의 회사에서 만든 슬라이드 위해서 필요한 것이 REQ에 비해 약간 이는만든 슬라이드를위한 cDNA의 양을 uired.
11. 하이브리드 및 세척
- (40 μL 효모 RNA와 수 제) 반은 물, 에탄올 99 %, SHY 버퍼 : 다음과 같은 시약을 사용합니다. SHY 최대 1 ml의를 준비합니다.
- 장치 및 솔루션 준비
- 건조하기 전에 진공 농축기와 히터 적어도 1 시간에 전환합니다. (45 ° C를 사용하여, S. 폐렴 DNA 마이크로 어레이에 대한) 정확한 하이브리드 온도로 조정 세트 포인트, 하이브리드 오븐에 전환합니다. 마찬가지로, 30 ~ 60 분 동안 하이브리드 카세트와 오븐을 예열.
- 적어도 30 분 동안 68 ℃에서 SHY 버퍼를 예열한다.
- 샘플 준비 (의 cDNA를 표시)
- 표지 된 cDNA를 (최대 30 % 차이)의 동량을 결합합니다. 볼륨이보다 작은 7 μL 때까지 고온 (약. 40 분)에서 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다.
- 리프터 미끄럼
- 깨끗한 리프터 - 전표를 사용합니다.참고 : 30 μL 슬라이드에로드 할 수 있습니다 ±.
- 비누, 수돗물 100 % 에탄올을 많이 리프터 - 전표를 청소합니다. 참고 : 더러운 리프터 전표가 높은 배경을 제공합니다.
- 공기는 먼지 입자를 날려 공기 권총 리프터 - 전표를 건조. 측면에서 흰색 테프론 라이닝이 아래로 향하게하여 슬라이드에 깨끗한 리프터 슬립을 놓습니다.
- (표지 된 cDNA으로) 하이브리드 화 버퍼를 추가
- 7 μL의 H 2 O에있는 말린 염료 샘플을 용해 2 분 동안 94 ℃에서 배양한다.
- 즉시, 35 μL 예열 SHY 버퍼 (68 ° C)를 추가 침전물을 제거하는 1 분 동안 최대 속도로 부드럽게 회전 섞는다. 로딩 될 때까지 약 5 분 동안 68 ℃에서 프로브를 예열.
- 슬라이드 - 리프터 슬립 조립 및 예열.
- 50 ℃에서 열 블록에 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 가열 된 하이브리드 슬라이드 홀더 및 P에 리프터 미끄럼 방지와 DNA 마이크로 어레이 (microarray) 슬라이드를 배치분 리프터 - 슬립과 슬라이드를 재가열. 가능한 한 빨리 다음 단계를 수행합니다.
- 슬라이드의 단부에 대상 시료 40 μL를 추가한다. 유체는 모세관 력에 의해 유리 표면 사이 흐르게. 천천히 조심스럽게 모든 피펫 팅을 수행합니다.
- 항상 리프터 슬립 수평으로 슬라이드를 유지하고 리프터 미끄럼 이동하지 않았다는 것을 확인하기 위해 천천히 이동합니다.
- 하이브리드 오븐에서 미리 예열 하이브리드 카세트를 가지고 시스템을 닫습니다. 장소 필터 종이는 하이브리드 카세트에서 3 ml의 2 배 SSC (표준 식염수 구연산)로 적셔.
- 조심스럽게 하이브리드 카세트에서 슬라이드와 하이브리드 슬라이드 홀더를 배치합니다. 하이브리드 카세트를 닫고 (약 16 ~ 18 시간 동안) 오븐 다시 하이브리드에 넣어.
- 슬라이드 세척
- I, II 및 III 신선한 세척 - 버퍼 (세척 단계 750 ml)에 준비합니다. (500)는 I를 버퍼를 씻어 ML를 들어, 2 × SSC / 0.5 % SDS를 사용합니다. 500 워시 - 버프를 ㎖로어 II는 1 × SSC / 0.25 % SDS를 사용합니다. 500 ml를 들어 세척 버퍼 III를 사용하는 1 × SSC / 0.1 % SDS (선택 사항)
- 30 ° C에서 세척 - 버퍼를 놓고 (확인하기 위해 SDS는 용해).
- 유리 튜브의 원뿔 바닥에 닿을 때까지 50 ㎖로 채워진 팔콘 튜브에 매우 부드럽게 가능한 한 빨리 슬라이드 잠수함,하지만 난 버퍼를 씻는다.
- 상기 튜브의 하단에 미끄럼 리프터 싱크가 배열 긁힘없이 핀셋 슬라이드를 꺼내 세정제의 선반에 넣고 몇 초 후. 짧은 시간 간격으로 세척를 계속합니다.
- 세척 버퍼를 ㎖로 I (세척 역에서) 500에서 5 분 동안 슬라이드를 씻으십시오. 세척 버퍼 ㎖로 500에 20 ~ 30 분 (세척 역) II를 위해 두 번째 씻어주세요. 마찬가지로, 세척 버퍼 ㎖로 500에 5 분 동안 슬라이드를 씻어 III (선택 사항) (세척 역).
- 2,000 rpm에서 2 분 동안 슬라이드를 건조시킵니다.
12. 마이크로 어레이 분석
- 이미지를 스캔와 스캐너에서 각각의 파장의 폴더 "주피터 프로젝트"에 저장합니다.
- 이 소프트웨어를 실행 한 후 이전에 22 설명 된 바와 같이 처음에 스캔 된 파일을 분석하는 소프트웨어를 사용하여, "레드"와 녹색 이미지 파일 (-.635)로 빨간색 이미지 파일 (-.550)을로드하려면 "이미지 열기"탭을 선택 "녹색". 탭 (22)을 "로드 배열 목록"을 선택하여 이미지 파일에 S. pneumoniae에 배열 목록을 갖는 걸 파일 (.gal)를 업로드합니다.
참고 :이 배열 목록, 48 그리드로 구성되어 각 격자에 16 행 15 열의가 있었다. 그리드의 각 지점은 하나의 유전자를 나타내는 유전자 이름을 포함하여 장소 정보는 현장 설명 파일을 통해 추가됩니다. 지점 번호는 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로부터 제공됩니다. - 조심스럽게 그리드를 선택 탭에 얼룩을지게 한 후 지점을 정렬 "기능을 정렬 블록을 찾아, 배열 찾기". 모든 기능을 정렬 한 후, "분석"t를 선택하여 이미지를 분석AB. 결과, 히스토그램과 산포도를 갖는 새로운 파일을 만듭니다. "다른 이름으로 저장 결과"탭에서이 파일을 저장 추가 분석을 위해 .gpr 파일로 저장됩니다.
- 9 바와 같이 자체 개발 Microprep 소프트웨어 패키지와 상기 정규화 데이터의 처리를 수행한다.
- 염료 스왑 DNA 마이크로 어레이 데이터에 대한 독립적 인 생물학적 반복 실험을 사용합니다. 같은 t-TEST1의 변형의 CyberT 구현을 수행하고 계산 거짓 발견 비율 (FDRs)는 9 설명했다.
- 발현 된 유전자, 표준 p <0.001 FDR <0.05를 취할.
- GEO (유전자 발현 옴니버스) 가입 번호를 얻기 위해 NCBI 제출 페이지에 DNA 마이크로 어레이 데이터를 업로드합니다.
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Representative Results
RNA, cDNA를 절연 부 및 분석
L 세린은 필수 아미노산의 하나이며, 인간의 혈장 농도는 아동 및 성인에서 60-150 μM 다르다. 퓨린과 피리 미딘의 생합성의 역할은 신진 대사의 중요성을 강조하고 여러 아미노산 (글리신, 시스테인 및 트립토판)의 전조이다. S. 전체 사체에 L 세린의 영향을 연구 폐렴 D39 야생형 균주, 동일한 배지에서 최대 농도 (10 mM)을 그 성장에 대해 L 세린의 최소 농도 (150 μM)를 CDM에서 자라는 균주 D39의 마이크로 어레이 분석을 실시 하였다. 우선, 두 농도 하에서 성장 세포로부터의 총 RNA는 단리 하였다. RNA 샘플의 농도는 표 1에 나타내었다. 총 RNA의 품질은 품질 검사 분석을 이용하여 조사 하였다. 이 RNA를 수행하기 전에의 DNase I으로 처리 하였다분석은 가능한 게놈 DNA를 제거하는 그림 2 RNA의 품질을 보여줍니다.; 차선 L은 사다리를 나타내는 1, 2 10mM의 세린으로부터 RNA를 나타내는 ~ 150㎛ 세린과 레인 3 및 4로부터 RNA를 나타내는 레인. 두 RNA 서브 유닛에 대응하는 2 개의 맑은 밴드의 존재는 RNA의 양질을 표시하고 다음 단계의 실험이 수행 될 수있다.
RNA의 품질을 측정 한 후, cDNA를 합성이 이루어졌다. cDNA를 랜덤 nanomers 및 역전사 효소를 이용하여 형성 하였다. cDNA를 시료의 농도를 표 1에 나타낸다.이 cDNA를 아민 반응성 염료로 표지하고, 표지 된 cDNA의 농도 및 염료 라벨은 라벨링 후, 샘플 혼성화 그에 따라 혼합 하였다. 표 1에 나타내었다. 세척 후, 슬라이드는 스캐너를 이용하여 스캔 한 후, 분석은 진 픽스 프로 소프트웨어를 사용하여 수행 하였다.도 3 캐터를 도시아민 반응성 염료 비의 플롯 분석. 초기 분석 한 후, 데이터는 또 다른 최종 분석에 사용 된 잡음 및 사이버 T를 감소시키기 PicroPrep 소프트웨어 패키지 (PrePrep, 준비, PostPrep) (9)를 사용하여 분석 하였다. 표 2는 ≥ 2.0의 기준을 적용 후에 마이크로 어레이 연구의 결과를 요약 차이 P - 값 <0.001 배. 최대 (표 2)와 비교하여 유전자의 수는 최소의 차분 L 세린의 존재하에 발현시켰다.
그림 1. DNA 마이크로 어레이 기술. RNA의 개요 및 제어 대상 샘플로부터 cDNA를 단리 후 혼성화 표지.
그림 2.RNA의 품질 검사는 S.로부터 단리 폐렴 D39 셀은 최소 (150 μM) 및 최대 (10 mM)을 세린 농도의 존재 하에서 성장. 1, 레인 2는 최소 세린 농도의 존재 하에서 성장 된 세포로부터 단리 RNA 샘플을 나타내는 반면 레인 L 사이즈 - 사다리를 나타낸다. 유사하게, 레인 3과 4는 세린 최대 농도의 존재 하에서 성장 된 세포로부터 단리 RNA 샘플을 나타낸다. 밴드는 23S와 16S rRNA 유전자를 나타냅니다. 두 밴드의 존재가 더 오염 된 gDNA없고 RNA 양질 인 것을 나타낸다.
샘플 혼합물의도 3 배열 비교 산점도. 곡선의 각각의 스폿은 X 축의 Y 축 및 염료 2 염료 1 실험에서 유전자의 평균 발현 값 (LOG2)을 나타낸다.
| 견본 | RNA 샘플 | 기술 | RNA 농도 (NG / μL) | cDNA의 농도 (NG / μL) | 표지 된 cDNA를 (NG / μL) | DyLight-550 (pmol의 / μL) | DyLight-650 (pmol의 / μL) | 하이브리드 방식 |
| S1 | R1 | CDM + 최소 L 세린 성장 D39 야생형 | 2,057 | (255) | (225) | 0.8 | R1 + R3 | |
| R2 | CDM + 최소 L 세린 성장 D39 야생형 | 2,566 | (201) | 179 | 1.2 | R2 + R4 | ||
| S2 | R3 | D39 야생형은 CDM + 최대 L 세린 재배 | 2,831 | (292) | (276) | 2.3 | ||
| R4 | CDM + 최대 성장 D39 야생형되는 최소의 L 세린 | 1,867 | (172) | (150) | (1) |
마이크로 어레이 분석에 사용 된 샘플을 표 1의 하이브리드 방식.
| 유전자 | 기능 B | 비율 C | |||
| SPD0600 | 세포 분열 단백질 DivIB | 4 | |||
| SPD0445 | 포스 키나제 | 3.5 | |||
| SPD0646 | 가설 단백질 | 3.4 | |||
| SPD0873 | 가설 단백질 | 3.3 | |||
| SPD1223 | 가설 단백질 | 3.3 | |||
| SPD0980 | 리보오스 인산 pyrophosphokinase 2.8 | ||||
| SPD1628 | 크 산틴 포스 포리 | 2.7 | |||
| SPD1011 | 글리세 레이트 키나제 | 2.4 | |||
| SPD0645 | 가설 단백질 | 2.3 | |||
| SPD0564 | 가설 단백질 | 2.2 | |||
| SPD0641 | 만노오스 -6- 포스페이트 이소 머라 제, 클래스 I, 마나 | 2.1 | |||
| SPD1333 | 가설 단백질 | 2.1 | |||
| SPD1384 | 양이온 유출 가족 단백질 | 2.1 | |||
| SPD1432 | UDP 포도당 4 에피 머라 아제, 강풍-1 | 2.1 | |||
| SPD1866 | N- 아세틸 글루코사민 -6- 포스페이트 데 아세틸 라제, 나가 | 2.1 | SPD0104 | LysM 도메인 단백질 | 이 |
| SPD0140 | ABC 수송, ATP 결합 단백질 | 이 | |||
| SPD0261 | 아미노 펩 티다 제 C, PEPC | 이 | |||
| SPD1350 | 가설 단백질 | 이 | |||
| SPD1822 | 리보솜 큰 소단위 pseudouridine 신타 RluD 아과 단백질 | 이 | |||
| SPD0453 | 유형 I 제한-수정 시스템, S 서브 유닛 | -2 | |||
| SPD0459 | 열 쇼크 단백질 GrpE | -2 | |||
| SPD1006 | 포도당 -1- 인산 adenylyltransferase | -2 | |||
| SPD1799 | 센서 히스티딘 키나아제, 추정 | -2.1 | </ TR>|||
| SPD0387 | 베타 hydroxyacyl- (아실 캐리어 단백질) 탈수 FabZ | -2.2 | |||
| SPD1494 | 설탕 ABC 수송, 미아 제 단백질 | -2.2 | |||
| SPD0974 | 클래스 I 글루타민 아미도 트랜스퍼 라제, 추정 | -2.4 | |||
| SPD1600 | 안트라 포스 포리 | -2.5 | |||
| SPD1472 | Isoleucyl-의 tRNA 합성 효소 | -2.6 | |||
| SPD0681 | 가설 단백질 | -2.7 | |||
| SPD0501 | 전사 antiterminator, Lict | -3.4 |
S.의 사체 비교 규제 유전자의 표 2. 목록 폐렴 구균 균주 D39 야생형는 CD에서 재배L 세린의 최대 농도와 최소 L 세린의 농도 및 CDM (15)와 M (15). 진 번호는 D39의 궤적 태그를 참조하십시오. B의 D39 주석은 / TIGR4는 주석 (21). C 비율은 유전자의 발현에서 배 증가 / 감소를 나타냅니다 CDM-최대에 (빼기 부호가 하향 조절을 나타냅니다) CDM-최소에 비해.
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Discussion
우리는 세균의 전체 전 사체 분석을 수행하도록 적용될 수있는 사용자 친화적 인 프로토콜을 설명한다. 이러한 특정 기법에 대한 핵심은 세포가 수확되는 조건에 따라 달라질 것이다. 세포 RNA 분리 및 수확 후,이 기술은 박테리아 샘플 모든 유형과 정확히 동일하게 동일한 절차를 따르며, 따라서 세균 배양의 모든 유형에 적용 할 수있다. 이 프로토콜은 매우 간단하고 편리하고 RNA 분리에서 시작됩니다. (Macaloid 및 RNA 분리 키트를 사용하여) 우리 RNA 분리 프로토콜은 시간 효율적인 종래의 페놀 - 클로로포름과 트리 졸 방법에 비해 같다. 다음 단계에서, 효소 III 효소의 cDNA의 제조를 행한다. 다음에, cDNA를 라벨링 아민 반응성 염료의 cDNA 1 혼합에 의해 수행되고, 그 후 표지 된 cDNA를 정제. 라벨은 또한 간단하고 시료 약 1 배양해야하기에 많은 시간을 소요하지어둠 속에서 시간. 그것은 임의의 특수 장비를 필요로하지 않는 모든 이러한 단계는 임의의 표준 실험실에서 수행 될 수있다. 마이크로 어레이 스캐너 슬라이드를 스캔 할 필요가있다. 슬라이드 검사 및 분석을 위해, 프로그램 제품, GenePix Pro는 매우 간단하고 사용자 친화적 인 프로그램 (22)이 사용된다.
모든 실험을 수행 한 후, 분석 MicroPrep과 CyberT를 사용하여 수행 하였다. MicroPrep 패키지는 세 가지 모듈, 즉, PrePreP, 준비 및 PostPreP 9로 구성되어 있습니다. 이 데이터 전처리 워크 데이터의 정규화를위한 시간을 단축하고 또한 폐기 된 데이터의 양을 감소시킨다. 연구자가 최단 시간 내에 DNA 마이크로 어레이 데이터의 이해를하기 위해 소프트웨어가 이용 될 수있는 용이성이 가능하게한다. 이는 슬라이드 이미지 분석을 완료 한 후에 추가 처리를 위해 고품질의 데이터로 원시 신호 데이터를 변환하는 분 정도만 걸린다. MICR 규제 유전자 풀에 대한 자세한 분석oarray 상이한 내부 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행 할 수있다. 그들은 고추 (20), FIVA (16) 공개 (18), 검사 17 Genome2D (19)를 포함한다. 이러한 Windows 기반 툴과 소프트웨어 패키지는 사용자 친화적이며, 추가 조사 중에 데이터에 깊은 통찰력을 제공합니다. 이 소프트웨어 패키지는 매우 쉽고 편리한 데이터가 훨씬 더 의미 있고 관련대로 연구진은이 기술을 활용 할 수 있도록.
마이크로 어레이에 사용되는 염료는 염료가 스캐너가 인식 할 수 없을 정도로 낮은 오존과 신호 강도의 존재 하에서 불안정하게 오존 효과에 민감한 것으로 알려져있다. 오존 효과에 덜 민감 아민 반응성 염료의 cDNA 레이블을하는 데 사용됩니다. 오존 효과에 대한 해결책은이 기술이 더 나은 것.
리스트 업이었다 유전자의 생성 또는 최소 L-SER의 존재 하향 조절되었다최대 (표 2)와 비교하여 농도를 이네. 상향 조절 유전자는 그들의 제품의 기능에 따라 분류 할 수있다. 그들 중 7 가정적 단백질, 탄수화물은 네 개의 전송 및 대사, 세포 분열 단백질 DivIB 및 특정 아미노산 수송 및 대사에 관여하는 유전자를 인코딩한다. 마찬가지로, 또한 우리의 시험 조건에서 하향 조절되는 특정 유전자가있다. BglG 가족의 전사 조절 LicT, 일부 탄수화물 유전자와 일부 아미노산 특정 유전자는 하향 조절 유전자 중입니다. 열 충격 단백질 GrpE 아래쪽 규제들 사이에 있습니다. 따라서 본 연구는 차동 시험 조건에서 발현되는 유전자의 전체 개요를 제공합니다. 결과의 분석 후, 결과의 검증은 때때로 필요하다. 이 중 하나의 lacZ 프로모터 융합을 사용하여 qPCR에 또는 β - 갈 락토시다 분석하여 수행 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 DNA 마이크로 어레이 슬라이드 생산에 대한 도움말 앤 드 종과 Siger Holsappel 감사합니다. 생물 정보학 분석을위한 앤 드 종의 지원도 받고있다. 우리는 또한 종이를 검토 할 Jelle Slager 감사합니다. 무하마드 아프과 이르판 Manzoor는 HEC 파키스탄의 교수 개발 프로그램에 따라 GC 대학, 파이 살라 바드, 파키스탄에서 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acid phenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Roche RNA isolation kit | Roche Applied Science | 11828665001 | |
| Glass beads | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop | ND-100 | |
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| First Strand buffer | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Speedvac cooler | Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac concentrator plus |
| Hybridization oven | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD analytical technologies | Microarray scanner | |
| Sodium bicarbonate | SigmaAldrich | 104766 |
References
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